CN115028724A - 一种单抗细胞培养液的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种单抗细胞培养液的纯化方法，具体地，本发明提供了一种地舒单抗细胞培养液的纯化方法，该方法是采用细胞培养液离心后，深层过滤，任选地，在离心后、深层过滤前进行酸沉降与絮凝。本发明的纯化方法能够大幅降低生产成本，并能够获得收率在90％以上、浊度小于20NTU的目标细胞培养液，适于工业化生产。
Description
技术领域
本发明属于抗体药物纯化方法领域，具体涉及地舒单抗细胞培养液的纯化方法。
背景技术
地舒单抗是一种新型的抗RANKL(核因子κ-B配体的受体激动剂)的全人化单克隆IgG2抗体，分子量约为147kD，对可溶性、跨膜形式的人RANKL具有高度亲和力和特异性。与RANK结合后，可抑制破骨细胞的活性，降低骨吸收。临床上用于多发性骨髓瘤和实体瘤骨转移相关事件、不可手术切除的骨巨细胞瘤等疾病的治疗。
地舒单抗作为一种单克隆抗体药物，其生产工艺一般采用真核细胞进行培养，培养液再经收获、澄清、纯化、罐装、加塞等工艺制备而成。
深层过滤法是指采用硅藻土、纤维素、助滤剂等过滤介质，形成孔径大小不一的立体过滤网络，不仅过滤尺寸大于过滤孔径的颗粒物质，同时，对尺寸小于过滤孔径的颗粒物质，过滤介质利用静电或疏水等作用，吸附颗粒性物质，从而达到使溶液澄清的作用。深层过滤对细胞培养液中的死亡细胞、细胞碎片及其它颗粒性物质等具有很好的澄清效果。
深层过滤法，由于其固定资产投资少，澄清效果好，生产工艺可线性放大，常用来进行细胞培养液的澄清。但深层过滤介质表面与颗粒物质的静电或疏水作用等为弱相互作用，并存在一定的包含度，与过滤介质结合不牢的细小颗粒可能随着流体的冲刷而进入滤液，因此，过滤后的溶液经常还含有一定量的颗粒物质，存在一定的浊度。另外，深层过滤介质不可清洗，属于一次性产品，使用价格昂贵，过滤成本高。
离心，指利用离心机转子高速旋转产生的强大离心力，加快溶液中颗粒的沉降速度，将溶液中颗粒性物质沉淀出来，从而达到澄清溶液的作用。但由于料液中含有的细小颗粒性物质，在一般的离心转速下，难以沉淀。虽增大离心速度，可将其沉淀，但增大的离心速度可能将完整的细胞破碎，释放胞内物质，如细胞器、核酸、宿主蛋白等，从而产生新的杂质。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明技术人员采用离心和深层过滤结合工艺，即细胞培养液首先经离心工艺，去除沉降系数大的颗粒性物质，然后，再经深层过滤，除去沉降系数小的颗粒性物质，从而达到使料液澄清的目的。在深层过滤工艺前增加离心工艺，去除大部分颗粒性物质，减轻深层过滤的负担，降低深层过滤膜的使用数量及成本。
优选地，在离心后、深层过滤前进行酸沉降与絮凝步骤，所述酸沉淀与絮凝是使用酸溶液调节离心液中的pH至4-6；
通过所述酸沉降与絮凝步骤，促进料液中细小的颗粒性蛋白等杂质沉淀或絮凝，以增大其体积，便于深层过滤膜胞拦截或吸附。
本发明的具体技术内容如下：
纯化地舒单抗细胞培养液的方法，细胞培养液离心后，深层过滤。
进一步地，根据本发明地舒单抗细胞培养液的纯化方法，包括以下步骤：
1)细胞培养液加入离心机进行连续流离心；
2)离心液经二级深层过滤器过滤，得到目标细胞培养液。
进一步地，根据本发明地舒单抗细胞培养液的纯化方法，所述离心液经二级深层过滤器过滤的流速选自100-300LMH。
进一步地，根据本发明地舒单抗细胞培养液的纯化方法，所述二级深层过滤器为23cm2二级深层过滤器。
进一步地，根据本发明地舒单抗细胞培养液的纯化方法，步骤2)离心液体积选自1000L-5000L，优选2000L。
进一步地，根据本发明地舒单抗细胞培养液的纯化方法，所述二级深层过滤时间选自2-4小时，优选3小时。
进一步地，根据本发明地舒单抗细胞培养液的纯化方法，所述二级深层过滤压力终点6.5psi，滤器载量15-320L/m2。
进一步地，根据本发明地舒单抗细胞培养液的纯化方法，所述二级深层过滤压力终点7.0psi，滤器载量15-320L/m2。
进一步地，根据本发明地舒单抗细胞培养液的纯化方法，所述细胞培养液细胞密度不低于2.0×107cell/mL。
进一步地，根据本发明地舒单抗细胞培养液的纯化方法，所述细胞培养液的固含物不低于5％。
进一步地，根据本发明地舒单抗细胞培养液的纯化方法，所述细胞培养液细胞活率不低于80％。
任选地，在离心后、深层过滤前，进行酸沉淀与絮凝得到经过酸沉淀与絮凝处理的离心液；
所述酸沉淀与絮凝是使用酸溶液调节离心液中的pH至4-6，优选为4.4±0.2；
所述酸沉淀与絮凝过程中，在调节完pH后，任选地进行静置，所述静置时间为0.5-5小时，优选为1-2小时；
所述酸可为盐酸、硫酸、醋酸、柠檬酸或苹果酸等，优选为稀盐酸、醋酸或柠檬酸，更优选为醋酸。
本工艺与单独的离心工艺相比，对料液的澄清效果更好。与单抗药物常用的仅采用深层过滤工艺比较，本工艺的经济成本更低。
本发明工艺对细胞培养液的澄清效果与传统的深层过滤工艺更优，料液浊度可以达到小于20NTU，蛋白收率均在90％以上，每批次的生产成本大幅下降。
本发明还发现在离心后、二级深层过滤前，进行酸沉淀与絮凝可以进一步提高过滤的效率，降低过滤成本，综合收率和滤液浊度角度考虑，采用醋酸进行沉淀与絮凝，优于稀盐酸和柠檬酸。
具体实施方式
以下将结合实施例更详细地解释本发明，本发明的实施例仅用于说明本发明的技术方案，并非限定本发明的实质和范围。本发明实施例中地舒单抗细胞培养液中的细胞株为CHO细胞。
实施例1
1.实验方案
1.1离心：取约150L地舒单抗细胞培养液，采用碟片式离心机进行连续流离心，离心过程每隔数分钟进行取样，检测离心清液浊度，并最后测定总离心液的浊度，计算收率。
1.2二级深层过滤：采用Pmax/Tmax实验方法，将离心液以100-300LMH恒定的流速，通过23cm2的二级深层过滤器。每隔3-5分钟，记录过滤器压降、滤液体积及滤液浊度，当压降达到设定值(Pmax)或浊度贯穿(Tmax)时，停止实验。计算蛋白收率，及过滤2000L离心液所需的二级膜胞数量。
2.实验结果
2.1离心：离心过程离心清液的浊度介于70至140NTU间，最终总离心液的浊度为110NTU。收率为95.8％。
2.2二级深层过滤
经离心后的上清液经二级深层过滤，过滤过程中压力和浊度逐渐上升，实验终点314.3L/m2,浊度达到19.9NTU，蛋白收率为93.9％。
按3小时内完成2000L料液的澄清过滤计算，二级深层过滤器可选择8个 1.1m2Millistak X0SP Pod过滤器，安全系数1.38。
表1：二级过滤时间、体积、压力及浊度记录表
实施例2
1.实验方案
1.1离心：取约150L地舒单抗细胞培养液，采用碟片式离心机进行连续流离心，离心过程每隔数分钟进行取样，检测离心清液浊度，并最后测定总离心液的浊度，计算收率。
1.2二级深层过滤：
采用Pmax/Tmax实验方法，将离心液以100-300LMH恒定的流速，通过 23cm2二级深层过滤器。每隔3-5分钟，记录过滤器压降、滤液体积及滤液浊度，当压降达到设定值(Pmax)或浊度贯穿(Tmax)时，停止实验。计算蛋白收率，及过滤2000L离心液所需的二级膜胞数量。
2.实验结果
2.1离心：离心液浊度为60NTU，最终离心液的浊度为59.4NTU。其蛋白收率95.5％。
2.2深层过滤：经离心后的上清液经二级深层过滤，过滤过程中压力和浊度逐渐上升，实验终点317.4L/m2,浊度达到20.2NTU，蛋白收率为93.9％。
按3小时内完成2000L料液的澄清过滤计算，二级深层过滤器可选择8个 1.1m2Millistak X0SP Pod过滤器，安全系数1.40。
表2：二级过滤时间、体积、压力及浊度记录表
实施例3
1.实验方法
1.1离心：取约150L地舒单抗细胞培养液，采用碟片式离心机进行连续流离心，离心过程每隔数分钟进行取样，检测离心清液浊度，并最后测定总离心液的浊度，计算收率。
1.2酸沉淀与絮凝：
取离心液3份，每份2L，分别滴加稀盐酸、醋酸和柠檬酸，调节离心上清液pH值至4.4±0.2，静置1小时，备用。
1.3二级深层过滤：
采用Pmax/Tmax实验方法，将三种酸沉淀后的料液分别以100-300LMH恒定的流速，通过23cm2二级深层过滤器。每隔3-5分钟，记录过滤器压降、滤液体积及滤液浊度，当压降达到设定值(Pmax)或浊度贯穿(Tmax)时，停止实验。计算蛋白收率，过滤2000L一级过滤后的料液所需的二级膜胞数量。
2.实验结果
2.1离心：离心液浊度约72NTU，最终离心液的浊度为70NTU。其蛋白收率 94.6％。
2.2酸沉淀与絮凝：
肉眼观察：盐酸沉淀絮凝液稀存在少许沉淀；柠檬酸絮凝液较澄清；醋酸絮凝液介于两者之间。
2.3深层过滤：
2.3.1深层过滤盐酸沉淀与絮凝液
经稀盐酸沉淀与絮凝的料液，再经二级深层过滤，过滤过程中压力和浊度逐渐上升，实验终点滤器载量702.1L/m2,浊度达到6.7NTU，蛋白收率为93.2％ (酸沉淀与絮凝、深层过滤两步总收率)。
按3小时内完成2000L料液的澄清过滤计算，二级深层过滤器可选择4个 1.1m2Millistak X0SP Pod过滤器，安全系数1.54。
表3：盐酸沉淀与絮凝液经二级过滤时间、体积、压力及浊度记录表
2.3.2深层过滤醋酸沉淀与絮凝液
经醋酸沉淀絮凝的料液，再经二级深层过滤，过滤过程中压力和浊度逐渐上升，实验终点683.5L/m2,浊度达到6.9NTU，蛋白收率为96.5％(酸沉淀与絮凝、深层过滤两步总收率)。
按3小时内完成2000L料液的澄清过滤计算，二级深层过滤器可选择4个 1.1m2Millistak X0SP Pod过滤器，安全系数1.50。
表4：醋酸沉淀絮凝液经二级过滤时间、体积、压力及浊度记录表
2.3.3深层过滤柠檬酸沉淀与絮凝液
经柠檬酸沉淀絮凝的料液，再经二级深层过滤，过滤过程中压力和浊度逐渐上升，实验终点610.7L/m2,浊度达到14.2NTU，蛋白收率为95.1％(酸沉淀与絮凝、深层过滤两步总收率)。
按3小时内完成2000L料液的澄清过滤计算，二级深层过滤器可选择4个 1.1m2Millistak X0SP Pod过滤器，安全系数1.34。
表5：柠檬酸沉淀絮凝液经二级过滤时间、体积、压力及浊度记录表
3.讨论
采用稀盐酸进行沉淀与絮凝，料液再经二级深层过滤，浊度达到6.7NTU，其深层过滤的收率为93.2％；采用醋酸进行沉淀与絮凝，料液再经二级深层过滤，浊度达到6.9NTU，其深层过滤的收率为96.5％；采用柠檬酸进行沉淀与絮凝，料液再经二级深层过滤，滤液浊度上升较快，当其浊度为14.2，其深层过滤的收率为95.1％。
综上所述，从收率和滤液浊度角度考虑，采用醋酸进行沉淀与絮凝，优于稀盐酸和柠檬酸。
Claims (10)
1.地舒单抗细胞培养液的纯化方法，其特征在于，细胞培养液离心后，深层过滤。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)细胞培养液加入离心机进行连续流离心；
2)离心液经二级深层过滤器过滤，得到目标细胞培养液。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述离心液经二级深层过滤器过滤的流速选自100-300LMH。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述二级深层过滤器为23cm2二级深层过滤器。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤2)离心液体积选自1000L-5000L，优选2000L。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述二级深层过滤时间选自2-4小时，优选3小时。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在离心后、深层过滤前，进行酸沉淀与絮凝得到经过酸沉淀与絮凝处理的离心液。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述酸沉淀与絮凝是使用酸溶液调节离心液中的pH至4-6，优选为4.4±0.2。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述酸沉淀与絮凝过程中，在调节完pH后，进行静置，优选所述静置时间为0.5-5小时，更优选为1-2小时。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述酸为盐酸、硫酸、醋酸、柠檬酸或苹果酸，优选为稀盐酸、醋酸或柠檬酸，更优选为醋酸。
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