CN117070450B - 一种外泌体的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种外泌体的纯化方法，涉及生物技术领域。所述纯化方法首先将含外泌体的细胞培养液经处理获得培养上清液，然后用0.22μM过滤器过滤，再超滤上清液，上样到混合模式层析柱进一步分离，获得纯度较高外泌体。本发明通过超滤+混合层析的方式纯化外泌体，在超滤阶段，采用切向流过滤方式并降低进样压力，以避免外泌体损伤，后续再通过混合模式层析弥补超滤带来的低杂蛋白去除率，通过低渗或高渗缓冲液充分去除蛋白杂质，同时还保证外泌体较高的收率。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种外泌体的纯化方法。
背景技术
外泌体是由细胞分泌于细胞间质的一类直径约30-150nm的微小囊泡。作为细胞形成外囊泡的一种，区别于微囊泡（50-1000nm）和凋亡小体（400-4000nm）。外泌体具有脂质双分子层膜结构，具有膜蛋白。外泌体内部包含重要的生物信号物质，包括蛋白质、DNA片段、RNA片段等，这样的生物学特性为相关疾病的诊断和治疗提供了重要的参考，同时具有成为药物递送的潜在载体。但是混合了其他成分的外泌体存在不利影响，需要对含外泌体成分细胞培养物进行纯化分离。
目前，对外泌体纯化分离的最常用方法是超速离心法（UC），其是一种根据溶液成分大小和密度以及介质的密度来分离外泌体的方法。此外，还有尺寸排阻色谱法（SEC），其是一种基于组分分子大小的分离技术，当外泌体等成分通过层析介质，各组分会根据大小被填料孔隙差异排斥，导致外泌体与其他成分相分离；聚合物沉淀法，一般使用聚乙二醇，在水中具有超溶性，使难溶成分如外泌体、蛋白质等从溶液中分离出来，再在低速离心条件下，收获外泌体；免疫磁珠法，利用磁珠表面包被可以识别外泌体表面标记物的抗体，与溶液中外泌体结合，从而达到分离提取的目的。但这些方法存在样品处理量较小、处理时间较长、操作步骤繁琐或者获得外泌体纯度不高等缺陷。
发明内容
本发明所要解决的问题是如何分离纯化外泌体且兼顾收率与纯度，且实现外泌体的大规模生产。
为解决上述问题，本发明提供一种外泌体的纯化方法，包括：
取含有外泌体的细胞培养液的上清液；
采用滤芯孔径为0.22μM的过滤器对所述上清液进行过滤，得到第一滤液；
对所述第一滤液进行切向流超滤，得到第二滤液；其中，所述切向流超滤的进样压力不大于4PSI，超滤膜截留分子量为400-750kD；
对所述第二滤液进行混合模式层析，收集流穿，得到纯化后的外泌体溶液；其中，所述混合模式层析包括尺寸排阻色谱模式层析和阴离子与疏水模式层析；当所述切向流超滤的超滤膜截流分子量为400-500kD时，所述混合模式层析的截留分子量为400kD，且所述混合模式层析过程中所用的缓冲液为盐浓度为20-60mM的磷酸盐缓冲液；当所述切向流超滤的超滤膜截留分子量大于500kD且小于或等于750kD时，所述混合模式层析的截留分子量为700kD，且所述混合模式层析过程中所用的缓冲液为盐浓度为200-300mM的磷酸盐缓冲液。
可选地，所述磷酸盐缓冲液为浓度为20mM、pH为7.9-8.0的NaH2PO4-Na2HPO4混合液。
可选地，所述切向流超滤过程中，反复多次先浓缩再稀释除杂，总稀释倍数为250-1500倍。
可选地，所述阴离子与疏水模式层析的填料的配基为辛胺。
可选地，所述混合模式层析过程中的流速为3-7cm/min。
可选地，当所述混合模式层析的截留分子量为400kD时，所述混合模式层析的填料包括Rigose Shell 400 或Capto Core 400。
可选地，当所述混合模式层析的截留分子量为700kD时，所述混合模式层析的填料包括Rigose Shell 700 或Capto Core 700。
可选地，所述纯化后的外泌体溶液中所述外泌体的颗粒直径为30-150nm。
可选地，所述外泌体的纯化方法还包括：将所述纯化后的外泌体溶液采用平衡液进行置换，所述平衡液为含有150mM NaCL、浓度为20mM的pH为7.9-8.0的NaH2PO4-Na2HPO4平衡液。
可选地，所述含有外泌体的细胞培养液来源于间充质干细胞。
本发明相较于现有技术的优势在于：
本发明通过超滤+混合层析的方式纯化外泌体，在超滤阶段，采用切向流过滤方式并降低进样压力，以避免外泌体损伤，后续再通过混合模式层析弥补超滤带来的低杂蛋白去除率，通过低渗或高渗缓冲液充分去除蛋白杂质，同时还保证外泌体较高的收率，且超滤+混合层析的纯化方式，还可以应用于外泌体的大规模生产。
附图说明
图1为本发明实施例中外泌体的纯化方法流程图；
图2为本发明实施例1中培养上清液的粒径分布；
图3为本发明实施例1中滤出液内容物粒径分布；
图4为本发明实施例1中超滤收集液的粒径分布；
图5为本发明实施例1中超滤收集液的SDS-PAGE电泳图；
图6为本发明实施例1中纯化收集液的粒径分布；
图7为本发明实施例1中纯化收集液的SDS-PAGE电泳图；
图8为本发明实施例2中超滤收集液的粒径分布；
图9为本发明实施例2中细胞培养上清液超滤SDS-PAGE电泳情况；
图10为本发明对比例中纯化收集液A的粒径分布；
图11为本发明实施例2中纯化收集液B的粒径分布；
图12为本发明实施例2与对比例的纯化收集液的粒径分布对比；
图13为本发明实施例2与对比例的超滤收集液纯化后的SDS-PAGE电泳情况。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施例做详细的说明。
请参阅图1所示，本发明实施例的一种外泌体的纯化方法，包括：
取含有外泌体的细胞培养液的上清液；
采用滤芯孔径为0.22μM的过滤器对所述上清液进行过滤，得到第一滤液；
对所述第一滤液进行切向流超滤，得到第二滤液；其中，所述切向流超滤的进样压力不大于4PSI，截留分子量为400-750kD；
对所述第二滤液进行混合模式层析，收集流穿，得到纯化后的外泌体溶液；其中，所述混合模式层析包括尺寸排阻色谱模式层析和阴离子与疏水模式层析；当所述切向流超滤的截流分子量为400-500kD时，所述混合模式层析的截留分子量为400kD，且所述混合模式层析过程中所用的缓冲液为盐浓度为20-60 mM的磷酸盐缓冲液；当所述切向流超滤的截留分子量大于500kD且小于或等于750kD时，所述混合模式层析的截留分子量为700kD，且所述混合模式层析过程中所用的缓冲液为盐浓度为200-300 mM的磷酸盐缓冲液。
本实施例的纯化方法首先将含外泌体的细胞培养液经处理获得培养上清液，然后用0.22μM过滤器过滤，再超滤上清液，上样到混合模式层析柱进一步分离，获得纯度较高外泌体。其中，可以通过离心或深层过滤处理，去除细胞及碎片，获得含外泌体的细胞培养液的上清液，然后再用0.22μM过滤器过滤上清液，去除残留细胞碎片、大部分凋亡小体及微囊泡，获得第一滤液。再将第一滤液进行超滤以去除蛋白等杂质。传统过滤法一般为直流式过滤(DFF)，样品流垂直流动于膜表面，使小分子得以通过滤膜。但是这种方式大分子容易堆积于膜表面，形成滤饼层，且随着过滤时间增加，滤饼层厚度也会随之变厚，造成滤膜堵塞，导致流速、分子分离效果下降，并且缩短滤膜使用寿命。而本实施例采用切向流过滤（TFF），样品流水平流动于膜表面，并以垂直于膜表面的方向进行过滤，由此样品可以随着流速循环，同时也对膜表面进行冲洗，避免大分子堆积在膜表面，并防止浓度极化降低流速，从而维持稳定的流速，有效进行过滤，延长滤膜寿命。
超滤过程中，流速控制在进样压力不大于4PSI，以减少剪切力对外泌体的损伤。其中PSI为磅力/平方英寸，是指每平方英寸面积承受1磅重量所产生的压力。由于超滤时采用的压力较低，超滤过程比较温和，所以杂蛋白的去除率较低，因此在后续进行混合层析时，采用高渗或低渗溶液进行层析。具体地，当切向流超滤的截留分子量为400-500kD时，混合模式层析的截留分子量为400kD，此时，混合模式层析过程中所用的缓冲液为含有20-60mMNaCL的磷酸盐缓冲液，以增加蛋白和层析柱的结合力。当切向流超滤的截留分子量大于500kD且小于或等于750kD时，混合模式层析的截留分子量为700kD，此时，由于层析柱孔径较大，而外泌体的粒径较小，所以会有部分外泌体进入到柱子中与柱子结合，进而损失部分外泌体，因此，本实施例采用含有200-300mM NaCL的磷酸盐缓冲液，通过提高盐浓度，使得层析柱以疏水模式结合杂质蛋白，并减少外泌体对柱子的电荷吸附。可以理解，由于混合模式层析柱可以在高盐条件下以疏水模式结合蛋白杂质，因此可以有效去除蛋白杂质，但由于外泌体具有脂质双分子层膜结构，双分子层膜结构具有膜蛋白，且膜蛋白疏水部分在双分子层中间，蛋白双分子层外侧部分多带电荷且亲水，因此增加缓冲液盐浓度，可以减少外泌体对层析柱的电荷吸附，主要是减少层析柱对30nm左右外泌体的吸附，但却不影响或很少影响蛋白杂质对混合模式层析柱的结合。因此，高盐条件下，不仅能有效去除蛋白杂质，也提高了外泌体的收率，达到相对保持外泌体的高纯度基础下的维持较高收率的目的。
本实施例中，截留分子量为400-500kD的超滤器与截留分子量为400kD的混合模式层析柱搭配使用，层析模式所用缓冲液为含20mM-60mM NaCL的磷酸盐，优选地，为了便于操作，超滤过程中所用缓冲液也采用含20mM-60mM NaCL的磷酸盐，更优选地，超滤和层析过程中所用缓冲液的盐浓度相同。为了便于叙述，将这种搭配模式称为第一种方式。第一种方式中，蛋白杂质去除96%以上，其中外泌体颗粒直径为30-150nm。 截留分子量为750kD的超滤器与截留分子量为700kD的混合模式层析柱搭配使用，层析模式所用缓冲液为含200-300mMNaCL的磷酸盐，优选地，为了便于操作，超滤过程中所用缓冲液也采用含200-300mM NaCL的磷酸盐，更优选地，超滤和层析过程中所用缓冲液的盐浓度相同。为了便于叙述，将这种搭配模式称为第二种方式。第二种方式中，蛋白杂质去除97%左右。应当理解，第二种方式中，由于层析柱孔径较大，因此会损失部分外泌体，例如30nm左右的外泌体极大可能进入柱内与层析柱结合，由此使得最终获得的外泌体颗粒的最小直径要大于30nm。
因此，本实施例通过超滤+混合层析的方式纯化外泌体，在超滤阶段，采用切向流过滤方式并降低进样压力，以避免外泌体损伤，后续再通过混合模式层析弥补超滤带来的低杂蛋白去除率，通过低渗或高渗缓冲液充分去除蛋白杂质，同时还保证外泌体较高的收率。
其中一些实施方式中，所述磷酸盐缓冲液为NaH2PO4-Na2HPO4混合液，所述NaH2PO4-Na2HPO4混合液的浓度为20mM、pH为7.9-8.0。
其中一些实施方式中，在所述切向流超滤过程中，采用反复浓缩稀释的方式进行除杂，即，超滤浓缩后再稀释除杂，反复多次，稀释倍数总共250-1500倍。
本实施例中，进行超滤的目的主要是为了除杂，且反复通过浓缩稀释的方式进行，示例性地，将第一滤液经切向流超滤后浓缩至1L，再稀释五倍，得到5L滤液，再将该5L滤液经切向流超滤后再次浓缩至1L，再稀释五倍，如此反复多次，可以实现更好的除杂效果。相比一次超滤浓缩，本实施例在过层析柱之前进行了充分的除杂，除杂效率高，减缓后续层析压力。
其中一些实施方式中，所述阴离子与疏水模式层析的填料的配基为辛胺。所述混合模式层析过程中的流速为3-7cm/min。
其中一些实施方式中，当所述混合模式层析的截留分子量为400kD时，所述混合模式层析的填料包括Rigose Shell 400 或Capto Core 400。当所述混合模式层析的截留分子量为700kD时，所述混合模式层析的填料包括Rigose Shell 700 或Capto Core 700。其中，Rigose Shell 400可以排阻分子量大于400kD的生物大分子。Rigose Shell 700可以排阻分子量大于700kD的生物大分子。使用上述填料，可以实现使用一种层析填料发挥分子排阻和离子、疏水的三重功能。
其中一些实施方式中，所述外泌体的纯化方法还包括：将所述纯化后的外泌体溶液采用平衡液进行置换，所述平衡液为含有150mM NaCL、浓度为20mM的pH为7.9-8.0的NaH2PO4-Na2HPO4平衡液。
浓度为150mM的氯化钠溶液是等渗溶液。由于外泌体为脂质双分子层囊泡，长时间的低渗或高渗溶液对其有不利影响，因此本实施例中使用低渗（例如第一种方式中采用含20-60mM NaCL的缓冲液）或者高渗（例如第二种方式中采用含300mM NaCL的缓冲液）溶液扩宽试验条件的选择后及时的将其置换成等渗溶液，减少对外泌体的损伤。
其中一些实施方式中，所述含有外泌体的细胞培养液来源于间充质干细胞，可用于改善皮肤组织细胞。
本实施例的纯化外泌体的方法可以便捷的获得高纯度外泌体，并且该纯化方法可以根据培养液上清量相应的放大规模，在确定培养液上清具有外泌体的情况下，可以根据简单检测确认纯度及相对定量，具备商业化生产的特征。
本实施例中，对纯化后的外泌体溶液，可以使用紫外分光光度计和10%胶浓度的SDS-PAGE电泳检测OD280nm值和纯度。
下面通过具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
取间充质干细胞培养液，经离心或者深层过滤处理，去除细胞及碎片，获得清澈上清培养液（图2，图5-1泳道）。然后用0.22μM过滤器进一步清除残留细胞碎片，以及大部分凋亡小体和微囊泡。图2显示细胞培养上清经过滤除碎片后，培养液上清中蛋白、外泌体、囊泡等混合物粒径分布情况，可以看出，过滤后获得的上清液，经检测粒径分布特征，主要包括10nm处蛋白颗粒以及100nm处囊泡颗粒两大主要部分。
选取截留分子量400kD切向流超滤器，超滤除蛋白等杂质，超滤过程中，流速控制在进样压力4PSI，先浓缩，后五倍于浓缩体积稀释除杂，反复4次（图3，三次取样检测：图5-2、3、4泳道）。图3为滤出液内容物粒径分布，细胞培养上清经超滤后，上清液经超滤膜滤出溶液，主要含杂质蛋白的粒径特征，约10nm范围。超滤过程中所用缓冲液为20mMpH7.9NaH2PO4和Na2HPO4，且缓冲液中含20mM NaCL。
选取截留分子量400kD混合模式层析柱（填料为Rigose Shell 400 或Capto Core400），使用磷酸盐缓冲液平衡3个柱体积。超滤后收集的溶液（图4、图5-5泳道）上样，层析过程中流速为7cm/min，收集流穿，得到纯化收集液。图4为超滤收集液粒径分布，培养上清液经反复浓缩、稀释、超滤除杂过程，最终获得溶液的粒径分布情况，其范围10-300nm，可推断包含外泌体及部分蛋白。图5为超滤收集液SDS-PAGE电泳图，电泳泳道1为细胞培养上清液含有蛋白情况，2-4泳道为超滤滤出端，在不同稀释倍数下蛋白去除情况。
经检测，收集液粒径在30-300nm，主峰位置粒径约138.5nm，平均尺寸约98nm（图6）。图6为纯化收集液粒径分布，超滤收集的溶液经纯化后，其粒径分布与超滤后粒径对比，进一步缩小，表明溶液中杂蛋白进一步去除，溶液中颗粒平均直径98nm，主峰位置粒径约138.5nm，整体与外泌体大小（30-150nm）相符。检测样品上清、滤出液、收集液OD280值和SDS-PAGE电泳（图7），蛋白杂质去除96%以上。图7为纯化收集液SDS-PAGE电泳图，其中，图7中泳道1代表超滤收集液的电泳情况，2代表纯化收集液20μL点样的电泳情况，3代表纯化收集液10μL点样的电泳情况，4代表Marker, 表示分子标记，用于作为参照。SDS-PAGE电泳表明，超滤收集液经纯化后，泳道1与泳道2、3对比，蛋白进一步被清除。需要说明的是，外泌体特征蛋白通常需要与特异性抗体结合才能检测到，且不同的外泌体特征蛋白检测手段也有所不同，本实施例中对纯化收集液的电泳图仅用来说明杂质蛋白的去除。
将所获得的纯化收集液重新置换成20mM pH7.9 NaH2PO4-Na2HPO4，含150mM NaCL缓冲液，短期于4-8℃条件下保存，长期于零下80±2℃条件下保存。
实施例2
本实施例与实施例1的区别在于，采用截留分子量750kD超滤器与截留分子量700kD混合模式层析纯化外泌体。其中，本实施例所用缓冲液为含有氯化钠浓度为300mM的磷酸盐缓冲液。具体纯化步骤如下：
取间充质干细胞培养液上清，0.22μM过滤器去除残留细胞碎片以及大部分凋亡小体和微囊泡。
选截留分子量750kD切向流超滤器，超滤除蛋白等杂质，流速控制在进样压力4PSI，先浓缩，再稀释除杂，反复数次共稀释320倍，获得超滤收集液B。所用缓冲液为20mMpH7.9NaH2PO4和Na2HPO4，含300mM NaCL。
经检测，超滤收集液B的检测粒径及SDS-PAGE电泳如图8和图9所示，图9泳道1代表Marker，图9泳道3-7滤出液是不同稀释倍数下的杂蛋白滤出情况。可以看出上清液经超滤后，粒径分布于40-500nm范围（图8），平均直径123.8nm。如图9，为超滤SDS-PAGE电泳情况，泳道2为培养上清所含蛋白情况，泳道3-7为培养上清经超滤膜滤出端在不同稀释倍数下，蛋白去除情况，泳道8为培养上清超滤后电泳情况。
选取截留分子量700kD混合模式层析柱（填料Rigose Shell700），用含300mM NaCL的20mM pH7.9NaH2PO4和Na2HPO4磷酸盐缓冲液平衡3个柱体积。超滤收集液B上样，流速7cm/min，收集流穿，得到纯化收集液B。
经检测，纯化收集液B的粒径分布情况如图11所示，粒径在40-300nm，主峰位置粒径约147.8nm，平均尺寸约120.2nm（图11）。根据图11还可以看出，粒径分布范围的小值约在40-45nm之间，与超滤收集液A的粒径分布相似，说明纯化时采用盐浓度为300 mM的磷酸盐缓冲液不会损失小粒径的外泌体。检测样品上清、滤出液、收集液OD280值和SDS-PAGE电泳（图13中泳道4），蛋白杂质去除97%以上。
对比例
本对比例所用缓冲液为含有氯化钠浓度为150mM的磷酸盐缓冲液。
具体地：取间充质干细胞培养液上清，经0.22μM过滤器去除残留细胞碎片以及大部分凋亡小体和微囊泡；
选取截留分子量750kD切向流超滤器，超滤除蛋白等杂质，流速控制在进样压力4PSI，先浓缩，再稀释除杂，反复数次共稀释320倍，获得超滤收集液A。所用缓冲液为20mMpH7.9NaH2PO4和Na2HPO4，含150mM NaCL。
经检测，超滤收集液A的粒径分布及SDS-PAGE电泳与实施例2中超滤收集液B的粒径分布及SDS-PAGE电泳情况相似，说明缓冲液中盐浓度对超滤过程的影响不大。
选取截留分子量700kD混合模式层析柱（填料Rigose Shell700），用含150mM NaCL的20mM pH7.9 NaH2PO4-Na2HPO4磷酸盐缓冲液平衡3个柱体积。超滤收集液A上样，流速7cm/min，收集流穿，得到纯化收集液A。
经检测，纯化收集液A的粒径分布情况如图10所示，可以看出，在粒径分布范围小值处，含150mM氯化钠的磷酸盐缓冲液纯化的A液，约在50nm处， 相较超滤收集液A，说明损失了部分小粒径外泌体，例如40-50nm之间的的外泌体。
以下为对实施例2与对比例进行的比较。
实施例2与对比例两种纯化液的粒径分布如图12所示，可见纯化收集液B粒径分布整体左移，说明纯化时选用盐浓度为300mM氯化钠的磷酸盐缓冲液，可以避免或减少小粒径外泌体的损失。
通过紫外分光光度计测量纯化收集液A与纯化收集液B的OD280值，分别为0.053和0.073，SDS-PAGE结果显示纯化收集液A与纯化收集液B所含蛋白相当（图13），所以造成粒径分布差异的原因，可能来自于较小粒径外泌体在300mM氯化钠条件纯化中得到保留，损失相对较少。图13为超滤收集液经纯化后SDS-PAGE电泳情况，展示了两种不同纯化条件下收集溶液（纯化收集液A和纯化收集液B）的电泳情况，其中，图13中泳道1和5代表Marker，3表示空白组，即没有点样时的电泳情况，2代表纯化收集液A的电泳情况， 4代表纯化收集液B的电泳情况。
虽然本发明披露如上，但本发明的保护范围并非仅限于此。本领域技术人员在不脱离本发明的精神和范围的前提下，可进行各种变更与修改，这些变更与修改均将落入本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种外泌体的纯化方法，其特征在于，包括：
取含有外泌体的细胞培养液的上清液；
采用滤芯孔径为0.22μm的过滤器对所述上清液进行过滤，得到第一滤液；
对所述第一滤液进行切向流超滤，得到第二滤液；其中，所述切向流超滤的进样压力不大于4PSI，超滤膜截留分子量为400-750kD；
对所述第二滤液进行混合模式层析，收集流穿，得到纯化后的外泌体溶液；其中，所述混合模式层析包括尺寸排阻色谱模式层析和阴离子与疏水模式层析；当所述切向流超滤的超滤膜截流分子量为400-500kD时，所述混合模式层析的截留分子量为400kD，且所述混合模式层析过程中所用的缓冲液为NaCl浓度为20mM的磷酸盐缓冲液；当所述切向流超滤的超滤膜截留分子量大于500kD且小于或等于750kD时，所述混合模式层析的截留分子量为700kD，且所述混合模式层析过程中所用的缓冲液为NaCl浓度为300mM的磷酸盐缓冲液；其中，所述磷酸盐缓冲液为浓度为20mM、pH为7.9-8.0的NaH2PO4-Na2HPO4混合液；
将所述纯化后的外泌体溶液采用平衡液进行置换，所述平衡液为含有150mM NaCL、浓度为20mM的pH为7.9-8.0的NaH2PO4-Na2HPO4平衡液。
2.根据权利要求1所述的外泌体的纯化方法，其特征在于，所述切向流超滤过程中，反复多次先浓缩再稀释除杂，总稀释倍数为250-1500倍。
3.根据权利要求1所述的外泌体的纯化方法，其特征在于，所述阴离子与疏水模式层析的填料的配基为辛胺。
4.根据权利要求1所述的外泌体的纯化方法，其特征在于，所述混合模式层析过程中的流速为3-7cm/min。
5.根据权利要求1所述的外泌体的纯化方法，其特征在于，当所述混合模式层析的截留分子量为400kD时，所述混合模式层析的填料包括Rigose Shell 400 或Capto Core 400。
6.根据权利要求1所述的外泌体的纯化方法，其特征在于，当所述混合模式层析的截留分子量为700kD时，所述混合模式层析的填料包括Rigose Shell 700 或Capto Core 700。
7.根据权利要求1所述的外泌体的纯化方法，其特征在于，所述纯化后的外泌体溶液中所述外泌体的颗粒直径为30-150nm。
8.根据权利要求1所述的外泌体的纯化方法，其特征在于，所述含有外泌体的细胞培养液来源于间充质干细胞。
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