FI100110B - Kymosiinin talteenotto ja puhdistus - Google Patents

Description

100110

Kyntösiinin talteenotto ja puhdistus

Keksinnön aihepiiri Tämä keksintö koskee kymosiinin talteenottoa ja 5 puhdistusta vesipitoisista entsyymiseoksista, erityisesti fermentaatiomenetelmillä tuotetuista entsyymien vesiseok-sista.

Keksinnön tausta

Kymosiinia on erotettu ja puhdistettu käyttäen eri-10 laisia tekniikoita. Esimerkiksi vasikan renniiniä tai re-nniiniuutteita on puhdistettu käyttäen siniväriaffiniteet-tiligandeja, kuten US-patenttijulkaisussa 4 666 843, jonka patentin omistaa Subramanian, tai käyttäen selluloosahart-sikolonneja, kuten US-patentti julkaisussa 4 745 063, jonka 15 patentin omistaa Birschbach. Samoja menetelmiä on käytetty mikrobisesti tuotetun kymosiinin talteenottamiseksi ja puhdistamiseksi, kuten US-patenttijulkaisussa 4 743 551, jonka patentin omistaa Subramanian, ja vastaavasti US-patentti julkaisussa 4 721 673, jonka patentin omistavat Uren 20 et ai.. Nämä patenttijulkaisut sisällytetään tähän viitteiksi .

Kuitenkin tuotettaessa kymosiinia teollisessa tai kaupallisessa mittakaavassa käyttäen mikrobien aktiivisuutta nämä menetelmät kymosiinin talteenottamiseksi ja 25 puhdistamiseksi ovat riittämättömiä. Teolliseen tuotantoon kaupallisessa mittakaavassa tarvitaan tehokkaampia, taloudellisempia menetelmiä kymosiinin talteenottamiseksi ja puhdistamiseksi. On samoin oleellista, että tällaiset menetelmät sopivat muutettaviksi taloudellisesti suurem-30 paan mittakaavaan kaupallista tuotantoa silmällä pitäen.

. Erityisen kiinnostavaa kymosiinin teollisessa tuo tannossa mikrobeilla on kymosiinin tuottaminen fermentoi-malla kuituisia sieniä, jotka on modifioitu geneettisesti ilmentämään ja erittämään kymosiinia kuten kuvataan 35 Lawlisin et ai. US-patentissa 5 364 770, joka jätettiin 2 100110 26. helmikuuta 1988 ja joka sisällytetään tähän viitteeksi.

Tämän keksinnön päämääränä on antaa käyttöön tehokkaita menetelmiä kymosiinin erottamiseksi ja puhdistami-5 seksi vesipitoisista entsyymiseoksista, erityisesti vesipitoisista seoksista, jotka on tuotettu fermentoimalla tai muutoin mikrobien aktiivisuudella, ja erityisesti kymosiinin tuottamiseksi kaupallisessa mittakaavassa.

Yhteenveto keksinnöstä 10 Tämä keksintö on menetelmä kymosiinin erottamisek si vesipitoisesta entsyymiseoksesta, jonka mukaan vesipitoinen seos saatetaan kosketuksiin fenyylisefaroosihartsin kanssa kymosiinin sitomiseksi hartsiin ja hartsi sekä sitoutunut kymosiini erotetaan vesipitoisen seoksen loppu-15 osasta. Sitten kymosiini eluoidaan hartsista vedellä tai laimealla suolaliuoksella. Ennen kuin vesipitoinen entsyy-miseos saatetaan kosketuksiin fenyylisefaroosihartsin kanssa, vesiseos valmistellaan hartsikosketusta varten jommallakummalla kahdesta tavasta. Yhdessä valmistuksessa 20 vesipitoiseen seokseen lisätään konsentroitua suolaliuosta seoksen suolapitoisuuden nostamiseksi, mikä tehostaa kymosiinin tehokasta sitoutumista fenyylisefaroosihartsiin. Toisessa valmistuksessa vesipitoisen entsyymiseoksen pH lasketaan alle noin 3:een ennen vesipitoisen entsyymiseok-25 sen saattamista kosketuksiin fenyylisefaroosihartsin kanssa.

Suppea kuvaus piirroksesta

Piirroksessa esitetään kymosiinin eluoinnin fenyy-lisefaroosihartsista riippuvuus suolapitoisuudesta.

30 Kuvaus keksinnöstä Tätä keksintöä kuvataan liittyen vesipitoisiin entsyymiseoksiin, jotka sisältävät kymosiinia. Tämän keksinnön mukainen menetelmä on erityisen käyttökelpoinen vesipitoisten entsyymiseoksien yhteydessä, jotka on saatu 35 mikrobi-ilmennyksestä, jossa kymosiini on tuotettu solun- 3 100110 sisäisesti, tai mikrobi-ilmennyksestä, jossa kymosiini tuotetaan soluissa ja eritetään niistä. Edullinen vesipitoinen entsyymiseos, joka on käyttökelpoinen tässä keksinnössä, on saatu fermentoimalla mikrobi-ilmennysisäntiä, 5 jotka erittävät kymosiinia tuottaen solunulkoista kymosii-nia. Tämän keksinnön mukaista menetelmää voidaan samoin käyttää kymosiinin erottamiseksi vesipitoisista entsyymi-seoksista, jotka on saatu muista lähteistä, kuten vasikan renniiniuutteista.

10 Yhden edullisen menetelmän mukaan esillä olevan keksinnön suorittamiseksi fermentaatiolientä, kuten Aspergillus nigerin fermentoinnista saatua, käsitellään rikkihapolla pH:n laskemiseksi noin 2:een. Noin 1-2 paino-% (laskettuna kokonaisseoksen painosta) etikkahappoa lisä-15 tään fermentaation pysäyttämiseksi sekä solujen oleellisesti täydelliseksi tappamiseksi. Sitten lisätään ammo-niumhydroksidia pH: n nostamiseksi noin 5,9:ään. Sitten seos laimennetaan noin kaksinkertaiseksi alkuperäisestä tilavuudestaan vettä lisäämällä, minkä jälkeen se suoda-20 tetaan solujätteen ja muun kiintoaineksen poistamiseksi. Suolaa, edullisesti natriumkloridia, lisätään joko ennen suodatusta tai sen jälkeen siten, että nestesuodoksen suolapitoisuudeksi tulee noin 2 M. pH pidetään noin 5,9:ssä ja nestesuodos saatetaan kosketuksiin fenyylise-• 25 faroosihartsikolonnin kanssa. Kymosiini sitoutuu hartsiin, kun taas muut entsyymit ja suolaliuos kulkevat fenyylise-faroosihartsikolonnin läpi ja heitetään pois. Sitten hart-sikolonnia pestään liuoksella, jossa on pitoisuudet 2 M natriumkloridi ja 50 mM fosfaatti, pH:n pitämiseksi noin 30 5,9:ssä. Pesun jälkeen kymosiini eluoidaan fenyylisefaroo- sihartsikolonnista vedellä tai laimealla suolaliuoksella kuten 50 mM fosfaattiliuoksella. Kymosiini eluoidaan yhtenä eränä; gradienttia tai vaiheittaista eluointia ei tarvita, koska kymosiini on ainoa pääasiallinen entsyymi täl-35 laisissa entsyymien seoksissa, jotka sitoutuvat fenyylise-faroosihartsiin. Tällä menetelmällä tuotettu kymosiini on 4 100110 oleellisesti puhdasta ja on tavallisesti elintarvikelaa-tua, jota tarvitsee vain laimentaa vedellä, suodattaa ja käsitellä natriumkloridilla sekä säilytysaineella, jotta tuote täyttäisi halutut spesifikaatiot myytäväksi lopulli-5 sena kymosiinituotteena, joka on valmis teolliseen käyttöön. Hartsikolonni pestään sitten 0,1 M - noin 1 M nat-riumhydroksidiliuoksella, minkä jälkeen se pestään vedellä ja käytetään uudelleen toiselle erälle valmistettua suo-dosta.

10 Toisen edullisen menetelmän mukaan esillä olevan keksinnön mukaisen menetelmän suorittamiseksi fermentaa-tioseoksen pH lasketaan noin 2:een rikkihapolla ja noin 1-2 paino-% etikkahappoa lisätään fermentaatioprosessin keskeyttämiseksi ja solujen tappamiseksi. Tässä menetel-15 mässä seoksen pH pidetään noin 2:ssa, kun seos suodatetaan solujätteen ja muun kiintoaineksen poistamiseksi sekä nestemäisen suodoksen tuottamiseksi, joka sisältää entsyymiseoksen. Sitten kun suodos on saatu suodatusvai-heesta, pH pidetään edelleen noin 2:ssa, kun suodos saa-20 tetaan kosketuksiin fenyylisefaroosihartsikolonnin kans

sa. Haluttaessa suoloja voidaan lisätä suodokseen ennen suodoksen saattamista kosketuksiin hartsikolonnin kanssa. Joissain tapauksissa suolan lisääminen saattaa tehostaa kymosiinin sitoutumista hartsikolonniin. Esimerkkejä täl-• 25 laisista suoloista ovat 0,5 M ammoniumsulfaatti tai 0,5 M

natriumsulfaatti. Saatettaessa suodos kosketuksiin fenyylisefaroosihartsikolonnin kanssa kymosiini sitoutuu hartsiin kolonnissa, kun taas muut entsyymit ja suodosliuos kulkevat kolonnin läpi ja heitetään pois. Sitoutuneen ky-30 mosiinin sisältävä fenyylisefaroosihartsikolonni pestään sitten 0,2 M natriumkloridiliuoksella. Vaikka pH voidaan pitää noin 2:ssa ja nostaa haluttuun tasoon noin 5,9 elu-oinnin jälkeen, edullisesti pH nostetaan menetelmän tässä kohdassa noin 5,9:ksi käyttäen 0,2 M fosfaattiliuosta. Kun 35 hartsikolonni on pesty ja pH haluttaessa säädetty, kymosiini eluoidaan yhtenä eränä käyttäen vettä tai laimeaa il 5 100110 suolaliuosta, kuten 50 mM fosfaattiliuosta. Kuten edellä eluoitu kymosiini on oleellisesti puhdasta ja sitä voidaan käyttää elintarvikelaatukäytöissä. Eluoitu kymosiini laimennetaan haluttuun pitoisuuteen, natriumkloridia ja säi-5 lytysainetta lisätään ja liuos suodatetaan halutun kaupallisen tuotteen saamiseksi. Samoin kuten edellä, hartsiko-lonni pestään sitten 0,1 M - IM natriumhydroksidiliuok-sella ja sitten vedellä hartsikolonnin valmistelemiseksi uudelleenkäytettäväksi toisen erän valmistettua suodosta 10 kanssa.

Huomattakoon, että edeltävät kuvaukset ovat edullisia menetelmiä esillä olevan keksinnön mukaisen menetelmän suorittamiseksi ja että menetelmään voidaan tehdä edeltävistä menetelmistä lukuisia muunnoksia noudattaen 15 tämän keksinnön opetuksia. Eri menetelmäolosuhteita voidaan muuttaa ja käytettyjä reagensseja voidaan vaihtaa erilaisten haluttujen tai optimaalisten olosuhteiden saamiseksi kymosiinin talteenottamiseksi mistä tahansa sopivasta entsyymien vesiseoksesta, joka sisältää kymosiinia.

20 Menetelmän oleellinen piirre on kuitenkin fenyylisefaroo-sihartsin käyttö. Fenyylisefaroosihartsi on todettu ainutkertaisen aktiiviseksi ja selektiiviseksi kymosiinin sitomiseksi vesiseoksista, jotka sisältävät lukuisia muita ainesosia ja entsyymejä. Sefaroosihartseilla, joissa on mui-• 25 ta funktionaalisia ryhmiä, kuten oktyyli, ei ole todettu olevan haluttua selektiivisyyttä kymosiinin suhteen. Vaikka seuraavan teorian ei tarkoiteta rajoittavan tai tulkitsevan tämän keksinnön kattavuutta, arvellaan, että juuri sefaroosihartsin fenyylifunktionaalisuus tuottaa korkea-30 asteisen selektiivisyyden kymosiinille. Fenyylisefaroosi-hartsin on todettu olevan erityisen käyttökelpoinen kymosiinin erottamiseksi fermentaatioliemestä, koska fermen-taatioliemi sisältää laajan valikoiman muita ainesosia, entsyymejä ja epäpuhtauksia. Sitä vastoin tällaiset komp-35 leksiset seokset häiritsevät anionin- ja kationinvaihto- 6 100110 hartsien toimintaa tehden niistä siten tehottomia kymosii-nin talteenotossa fermentaatioliemestä.

Esillä olevan keksinnön yhteydessä on aivan yllättäen havaittu, että kymosiini on oleellisesti ainoa fer-5 mentaatioliemessä esiintyvä entsyymimateriaali, joka sitoutuu sefaroosihartsiin olosuhteissa, joissa pH on alhainen ja/tai suolapitoisuus korkea. Normaalisti lukuisat erilaiset entsyymit ja muut materiaalit sitoutuvat sefa-roosityypin hartseihin, jolloin haluttu entsyymi otetaan 10 talteen yhtenä fraktiona eluoimalla sarjassa, osittain tai vaiheittain muuttaen asteittain eluointinesteen pH:ta ja/ tai suolapitoisuutta. Tässä vakiomenetelmässä kukin entsyymi eluoidaan eri ajankohtana, jolloin saadaan erillisiä fraktioita, joista yksi tai useampi sisältää haluttua tal-15 teenotettavaa entsyymiä. Fraktioeluoinnissa tapahtuu ta vallisesti myös muodostuneiden fraktioiden joutumista päällekkäin, jolloin halutut tuote-eluaatit voivat jakautua ainakin osittain viereisiin fraktioihin, mikä laskee halutun tuotteen, ainakin sellaisen, joka edustaa haluttua 20 korkeaa puhtausastetta, talteensaatavaa kokonaismäärää.

Tällaiset fraktioeluointimenetelmät eivät ole tarpeeksi tehokkaita taloudelliseen kaupalliseen käyttöön suuren mittakaavan erotuksissa.

Edeltävään nähden vastakkaisesti tämän keksinnön • 25 mukaisessa menetelmässä on todettu, että kymosiini on oleellisesti ainoa ainesosa fermentaatioliemisuodoksesta, joka sitoutuu fenyylisefaroosihartsiin. Täten gradientti-tai fraktioeluointi ei ole sen paremmin tarpeen kuin toivottavaakaan tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä; ky-30 mosiini voidaan eluoida yhtenä eränä. Tämä menetelmä suo korkeita saantotasoja, koska fenyylisefaroosihartsi poistaa ainakin noin 95 paino-% kokonaiskymosiinista fermentaatioliemisuodoksesta. Tämä menetelmä on tehokas, koska kymosiini voidaan nopeasti eluoida hartsikolonnista yh-35 dessä vaiheessa fraktioeluointeja tarvitsematta. Saadun 7 100110 kymosiinituotteen puhtausaste on ainakin noin 90 % ja sitä voidaan valmistaa kaupalliseen käyttöön käyttämättä merkittävää jatkokäsittelyä epäpuhtauksien poistamiseksi. Kaupallinen kymosiinituote laimennetaan tavallisesti pi-5 toisuuteen noin 1,5 g/litra kymosiinia, suola- (tavallisesti NaCl-) pitoisuus nostetaan normaalisti noin 18 %:iin ja lisätään säilytysainetta kuten natriumbentsoaattia. Lopullisella kaupallisella tuotteella, joka on tarkoitettu elintarvikelaatukäyttöön, suoritetaan tavallisesti niin 10 ikään viimeinen suodatus mahdollisesti esiintyvien epätoivottavien kiinteiden aineiden tai hiukkasten poistamiseksi.

Fenyylisefaroosihartsit ovat hyvin tunnettu luokka hartseja ja ne tunnetaan myös ristikytkettyinä fenyyli-15 agaroosihartseina. "Phenyl-Sepharose CL-4B" on kauppanimi ristikytketyille fenyyliagaroosihartseille, joiden valmistaja on Pharmacia Fine Chemicals, AB, ja tässä käytettynä "fenyylisefaroosilla" tarkoitetaan mitä tahansa ristikyt-kettyä agaroosihartsia, jossa on riittävä fenyylifunktio-20 naalisuus kymosiinin tehokkaaksi sitomiseksi vesiliuoksesta tai -lietteestä.

Fenyylisefaroosihartsia voidaan käyttää hiukkas-muodossa irtotuotteena, jonka hiukkaskoko on noin 40 mikronia - noin 400 mikronia ja se voidaan sekoittaa vesipi-. 25 toiseen entsyymiseokseen, jotta kymosiini voi sitoutua hartsiin. Hartsi voidaan sitten erottaa vesipitoisesta liuoksesta, eluoida sitten ja uudelleenkierrättää kuten edellä kuvattiin. Kuitenkin edullisesti fenyylisefaroosihartsia käytetään pakatun kolonnin muodossa, jolloin ko-30 lonni sisältää hartsihiukkasia, joiden hiukkaskoko on noin 40 mikronia - noin 400 mikronia.

Kuten alan ammattilaiset huomannevat, hapot, emäkset ja suolat, joihin viitataan edellä tämän keksinnön mukaisen menetelmän kuvauksessa, voidaan vaihtaa tai kor-35 vata samanarvoisilla hapoilla, emäksillä tai suoloilla, 8 100110 joilla saadaan haluttu pH tai haluttu suolapitoisuus häiritsemättä fenyylisefaroosihartsin toimintaa tässä keksinnössä ja jotka eivät denaturoi kymosiinia. Samoin kuten alan ammattilaiset huomannevat, pH-arvoja, joihin edellä 5 viitataan, voidaan modifioida tietyissä rajoissa ja silti saada halutut tulokset. Esimerkiksi fermentaatioliemi voidaan prosessoida ja suodattaa pH:ssa alle noin 6, mutta edullisesti pH on alle noin 3 ja edullisimmin pH pidetään noin 2:ssa. Samoin silloin kun pH edullisesti säädetään 10 noin 5,9:ksi menetelmässä, pH noissa menetelmäkohdissa voi vaihdella lukemissa noin 5 - noin 6 ja edullisesti noin 5,5 - noin 6. Vastaavasti konsentroitujen suolojen pitoisuutta voidaan vaihdella haluttuun tulokseen pääsemiseksi.

On todettu, että kymosiini sitoutuu parhaiten fenyylisefa-15 roosihartsiin konsentroidun suolaliuoksen läsnä ollessa, jossa pitoisuus on ainakin noin 1 M, ja/tai kun vesipitoisen seoksen pH on alle noin 3. Normaalisti edullisesti käytetään natriumkloridia sen alhaisen hinnan johdosta; esimerkkejä muista käyttökelpoisista suoloista ovat Na2S04 20 ja (NH4)2S04. Liuoksen edullinen suolapitoisuus on noin 2 M, vaikkakin suolan korkeampi tai alhaisempi moolipitoisuus vesipitoisessa entsyymiseoksessa, esimerkiksi noin 1 M - 2 M, voi olla tehokas kymosiinin sitomisessa fenyylisefaroo-sihartsiin. Eluointivaiheessa on todettu, että kymosiini . 25 voidaan eluoida helposti yksittäis- tai eräeluointina fe- nyylisefaroosihartsista vedellä tai heikoilla suolaliuoksilla. Arvellaan, että kymosiini sitoutuu parhaiten fenyy-lisefaroosihartsiin, kun ionipitoisuus suolaliuoksessa on korkea, ja eluoituu sitten helposti laskettaessa kymosii-30 nin fenyylisefaroosihartsissa ionivahvuutta eluoimalla •\ vedellä tai laimealla suolaliuoksella.

Kun esillä olevaa keksintöä on nyt kuvattu liittyen edeltäviin edullisiin menetelmiin tämän keksinnön mukaisen menetelmän ja sen muunnoksien suorittamiseksi,

II

9 100110 keksintöä havainnollistetaan nyt seuraavilla spesifisillä esimerkeillä.

Esimerkki 1 Tämä esimerkki kuvaa kymosiinin talteenottomene-5 telmää elintarvikelaatua edustavan kymosiinin tuottamiseksi . Kymosiini otetaan talteen Aspergillus niger var. awamorin fermentaatiosta. Kuvataan menetelmää, jossa käytetään 3 000 litran fermentoria ja jossa liemen saantoti-lavuus on noin 2 500 litraa. Fermentaation päätyttyä lie-10 mi inaktivoidaan säätämällä pH lukemaan 2,0 - 2,5 rikkihapolla ja lisäämällä etikkahappoa. (Katso US-patentti 5 378 621, jonka jättivät 13. kesäkuuta 1989 Lawlis et ai. ja joka sisällytetään tähän viitteeksi.) Inaktivaatio-olo-suhteita pidetään 1 tunnin ajan fermentaation lämpötilassa 15 ja ilmavirtauksella. Tämä inaktivaatio johtaa riittävään vähennykseen elävien solujen lukumäärässä, jotta sitominen lakkaa. Inaktivaation jälkeen pH säädetään 5,5:ksi lisäämällä ammoniumhydroksidia. Inaktivaatiossa ja sitä seuraa-vassa pH:n säädössä tarvitaan noin 125 kg rikkihappoa, 25 20 kg jääetikkaa ja 80 litraa 28-%:ista ammoniumhydroksidi-liuosta.

Inaktivoitu liemi suodatetaan käyttäen pyörötyhjö-rumpusuodatinta. Lientä laimennetaan 2,5x deionisoidulla vedellä (2 500 litraa - 6 250 litraa). Laimennettuun ma-. 25 teriaaliin lisätään 3 % (w/v) Manville Celite 545 -val mistetta ja suodatetaan Celite 545 -kerroksen läpi. Kakku pestään saantojen nostamiseksi. Suodostilavuuden tulisi olla sama kuin lähtösyöttötilavuus.

Suodosta viimeistellään ennen vaihetta, jossa se 30 saatetaan kosketuksiin fenyylisefaroosihartsin kanssa, käyttämällä kaksivaiheista kerrossuodatusta. Suodoksesta tehdään 6-%:ista (w/v) NaCl:n suhteen ja l-%:ista (w/v) HyFlo Super Cel -valmisteen suhteen ja se suodatetaan SEN Supra 200 -suodatinkerroksien läpi. Ensimmäisen vaiheen 35 suodos otetaan talteen ja puristetaan käyttäen Supra 50 10 100110 -kakkuja. Toisen vaiheen suodatuksessa ei käytetä suoda-tusapuainetta.

Kirkastettu suodos käytetään 10 litran fenyylise-faroosihartsikolonnin läpi ("Fast Flow L.S.", 40 - 100 5 mikronin hiukkaskoko, valmistajalta Pharmacia Fine Chemicals, AB). Panostuksen jälkeen kolonni pestään 3 tilavuudella (30 litraa) 6-%:ista NaCl-liuosta. Sitten kolonnia eluoidaan yhtenä eränä 4 kolonnitilavuudella (40 litraa) 50 mM natriumfosfaattipuskuria pH:ssa 5,5. Eluoidus-10 ta kymosiiniliuoksesta tehdään 17-%:ista NaCl:n suhteen

kaupallista elintarvikelaatukäyttöä silmällä pitäen. Esimerkki II

Käyttäen samaa suodosta ja fenyylisefaroosihartsia kuin esimerkissä I tämä esimerkki havainnollistaa kymo-15 siinin gradienttieluointia hartsista.

Olosuhteet: 11,4 ml fenyylisefaroosihartsia panostus ja eluointi nopeudella 5,0 ml/min 20

Nro Kuvaus (NH4)2S04* CHU/1 Til. CHU Mg (ml) (tot.) (tot.) I lähtömat. 1 1,62 5 000 8,10 105,30 25 2 tyhjä + pesu 1 0,03 5 000 0,15 1,95 3 pH-muutos 1 0,03 50 0,00 0,02 4 fraktio 1 1 0,03 10 0,00 0,00 5 fraktio 2 0,9 - 10 0,00 0,00 6 fraktio 3 0,8 - 10 0,00 0,00 30 7 fraktio 4 0,7 0 10 0,00 0,00 • ‘ 8 fraktio 5 0,6 0,12 10 0,00 0,02 9 fraktio 6 0,5 0,61 10 0,01 0,08 10 fraktio 7 0,4 6,48 10 0,06 0,84 II fraktio 8 0,3 34,04 10 0,34 4,43 35 12 fraktio 9 0,2 93,9 10 0,94 12,21 11 100110 13 fraktio 10 0,1 170,1 10 1,70 22,11 14 fraktio 11 0 198,4 10 1,98 25,79 15 fraktio 12 0 128,9 10 1,29 16,76 16 fraktio 13 0 17,34 10 0,17 2,25 5 17 fraktio 14 0 5,37 10 0,05 0,70 18 komposiitti 50,02 140 7,00 91,04 (CHU = Chris. Hansen -yksikkö) gradientti: 2 M - 0, kuten esitetään piirroksessa 10

Kymosiinin kokonaissaanto on noin 85 paino-%. Oheisessa piirroksessa esitetään edeltävä kymosiinin eluointi ammoniumsulfaattipitoisuuden funktiona ja havainnollistetaan, miten helposti kymosiini saadaan tal-15 teen yhdellä eluoinnilla.

Esimerkki III

Samankaltaista suodosta kuin esimerkissä I käyttäen fenyylisefaroosihartsin kapasiteetti seuraavissa olosuhteissa on: 20

Hartsin kapasiteetti

Olosuhteet (mg kymosiinia/1 hartsia) 2 M NaCl, pH 5,8 3,79 1 M (NH4)2S04, pH 2,0 7,32 25 Tämä esimerkki havainnollistaa sitä, että edullinen menetelmä tämän keksinnön harjoittamiseksi suoritetaan alhaisemmassa pH:ssa.

Claims (11)

100110

1 M.

1. Menetelmä kymosiinin erottamiseksi vesipitoisesta entsyymiseoksesta, tunnettu siitä, että: 5 (a) vesipitoinen entsyymiseos saatetaan kosketuk siin fenyylisefaroosihartsin kanssa olosuhteissa, joissa pH on alle 3 ja/tai suolapitoisuus on korkea, jolloin ky-mosiini on oleellisesti ainoa sitoutuva entsyymimateriaa-li, riittävän pitkäksi ajaksi, jotta kymosiini voi sitou- 10 tua hartsiin; (b) hartsi ja sitoutunut kymosiini erotetaan vesipitoisesta seoksesta; ja (c) kymosiini eluoidaan hartsista.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 15 tunnettu siitä, että suolaa lisätään vesipitoiseen entsyymiseokseen ennen seoksen saattamista kosketuksiin hartsin kanssa.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnett.u siitä, että lisätty suola käsittää epäor- 20 gaanisen suolan liuoksen, jonka pitoisuus on ainakin noin

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että eluointivaiheeseen sisältyy laimean suolaliuoksen käyttäminen, jonka pitoisuus on 25 korkeintaan noin 0,5 M.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että alkuperäinen vesipitoinen entsyymiseos muodostetaan fermentaatiovaiheessa.

6. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, 30 tunnettu siitä, että alkuperäinen vesipitoinen \ entsyymiseos muodostetaan fermentaatiovaiheessa.

7. Menetelmä kymosiinin erottamiseksi vesipitoisesta entsyymiseoksesta, tunnettu siitä, että: (a) vesipitoisen seoksen pH säädetään alle noin 35 3:een; n 100110 (b) vesipitoinen entsyymiseos, jonka pH on säädetty, saatetaan kosketuksiin fenyylisefaroosihartsin kanssa riittävän pitkäksi ajaksi, jotta kymosiini voi sitoutua hartsiin; 5 (c) hartsi ja sitoutunut kymosiini erotetaan vesi pitoisesta seoksesta; ja (d) kymosiini eluoidaan hartsista.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hartsi ja sidottu kymosiini 10 pestään ennen eluointivaihetta suolaliuoksella, jonka pi toisuus on ainakin noin 1 M.

9. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että eluointivaiheeseen sisältyy laimean suolaliuoksen käyttäminen, jonka pitoisuus on 15 korkeintaan noin 0,5 M.

10. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että alkuperäinen vesipitoinen entsyymiseos muodostetaan fermentaatiovaiheessa.

11. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, 20 tunnettu siitä, että alkuperäinen vesipitoinen entsyymiseos muodostetaan fermentaatiossa. « 100110