JP2534587B2 - 微生物学的に生成されたキモシンの回収方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 1.発明の分野 本発明は微生物学的に生成されたキモシンの回収に関
する。特に、本発明は、キモシンを生成するために調製
された培養微生物から生じる発酵ビール（fermentation
beer）からキモシンを回収する方法に関する。本発明
はさらに、微生物学的に生成されたキモシンの選択的回
収およびその後の純化の方法に関する。

2.技術水準 キモシンはチーズの製造に特に有用な公知の酵素であ
る。最近まで、商業的に使用されるほとんど全てのキモ
シンは、子牛の４番目の胃から回収されていたが、子
羊、ヤギ等の他の哺乳動物の胃からキモシンを回収する
こともこれまでに知られている。しかしながら、近年の
子牛の生産の減少によって、そのようなキモシンの天然
源が減っており、それによってキモシンの微生物による
生産にはずみがついた。このような状況下、最近の特許
および特許出願は、遺伝子工学による微生物の発酵によ
ってキモシンが生成され得ることを開示している。例え
ば、キモシンを発現し、分泌するよう遺伝子に変更され
た糸状菌の発酵によるキモシンの生成が、米国特許出願
第07/163,219号に開示されており、この開示内容は本出
願に引用として取り込まれている。同様に、1987年５月
19日に発行の米国特許第4,666,847号は、キモシンを発
現し、分泌するよう遺伝子に変更されたE.coli（バクテ
リア）の発酵によるキモシンの生産、並びにキモシンを
発現し、分泌するよう遺伝的に変更されたSaccharomyce
s cerevisiae（酵母）の発酵によるキモシンの生産を開
示しており、この開示内容は本出願に引用されている。

キモシンの微生物学的生産は、キモシンに加えて酵素
の発現をももたらすので、発酵ビールからのキモシンの
回収および純化は現存する問題をかかえている。例え
ば、キモシンを上記米国出願第07/163,219号のようにし
て生産すると、α−アミラーゼ、酸性ホスファターゼ、
レウアミノペプチダーゼ（leu amino peptidase）等の
酵素が、前記発酵中に同時生成されてしまう。発酵ビー
ル中に上記のような付加的酵素が存在することにより、
そのようなビールからのキモシンの回収および純化にさ
らなる困難性が生じる。

発酵ビールから酵素を分離するための種々の方法が開
示されているが、出願人の知る限りにおいて、キモシン
と共に酵素を含む発酵ビールから選択的に極めて多量
（すなわち分配係数（Ｋ）＞85）のキモシンを回収でき
ることを開示した引例はない。

例えば、米国特許第4,144,130号は、細胞から細胞間
酵素が遊離されていった水溶液からそれら細胞間酵素を
回収するため、（１）高分子量不置換または置換ポリア
ルコール、ポリエーテル、ポリビニルピロリドンまたは
多糖類と無機塩との混合物、（２）前記高分子量ポリマ
ーの２種以上の混合物の使用を開示している。ポリエチ
レングリコールと無機塩の混合物を使用すると、所望の
細胞間酵素が上部ポリエチレングリコール層に入り、一
方、細胞の残骸（celldebris）と他の発酵製品が下部の
塩含有層に入る。この引例は、通常の細胞集団を処理す
る際にはグリコール層に回収された種々の酵素の分配係
数が約0.3であり、冷凍細胞を水と混合し、解体して酵
素を遊離すると前記分配係数が約３に上がることを開示
している。しかしながら、この引例は単一酵素の選択的
回収ましてや１種以上の酵素を含む発酵ビールからのキ
モシンの選択的回収を教示しておらず、示唆もしていな
い。

同様にして、米国特許第4,728,613号は、細胞外で生
成された酵素（例えばプロテアーゼ、アミラーゼおよび
微生物的レンネット）を、ポリエチレングリコール、ポ
リエチレングリコールのアミン誘導体、ポリエチレング
リコールのカルボキシレート誘導体、ポリプロピレング
リコール、ポリプロピレングリコールのアミン誘導体、
ポリプロピレングリコールのカルボキシレート誘導体、
ポリ（エチレングリコール）エステル、ポリエチレンイ
ミン、トリメチルアミノ−ポリエチレングリコール、ポ
リビニルアルコール、ポリビニルピロリドンおよびそれ
らの混合物から成る群より選択されるポリマーと無機塩
とを用いて、全発酵ビール（whole fermentation bee
r）から回収する方法を開示している。この引例の実施
例は前記細胞外酵素に対して約80までの分配係数を達成
することを開示しているが、ポリエチレングリコール／
塩混合物からのキモシンの回収並びに１種類以上の酵素
を含む発酵ビールからのキモシンの選択的回収について
開示してはいない。

同様に、Kula等の“Purification of Enzymes by Liq
uid−Liquid Extraction"は、液体−液体抽出による酵
素の純化の種々の方法を記載している。開示される種々
の方法の中で、Kula等は、酵素を含む水溶液にポリエチ
レングリコール／無機塩混合物を加えることによって、
ポリエチレングリコール相が酵素を含むような２層系が
形成されることを開示している。Kula等はさらに、111
ページに、酵素をイオン交換体に吸着させ、相形成ポリ
マーを洗浄し、そして酵素をその後回収することによっ
て、酵素から相形成ポリマー（ポリエチレングリコー
ル）を除去できることを開示している。しかしながら、
この引例は、ポリエチレングリコール／塩混合物を用い
るキモシンの回収並びに１種類以上の酵素を含む発酵ビ
ールからのキモシンの選択的回収について開示していな
い。

一方、米国特許第4,508,825号は、細胞外プロテアー
ゼおよび共生成アミラーゼを生成できる微生物の発酵中
に、ポリエチレングリコールとカチオン性エピハロヒド
リン／ポリアミンコポリマーまたはデキストランポリマ
ーを発酵媒体に加え、これらポリマーを相分離させてプ
ロテアーゼリッチ相およびアミラーゼリッチ相を形成す
ることによって、前記細胞外プロテアーゼおよび共生成
アミラーゼを分離することを開示している。

また、米国特許第4,591,563号は、蔗糖上の培養媒体
からのデキストラン−スクラーゼの同時純化および濃縮
の方法を開示している。特に、開示された方法は、２相
を形成するためにポリエチレングリコールなどのポリエ
ーテルを加えることを含む。この２層とは、濃縮および
純化デキストラン−スクラーゼ酵素を含む重デキストラ
ンリッチ相と、除去物である汚染酵素活性を含む軽ポリ
エーテルリッチ相である。

以上より、引用例は、約85より大のキモシン分配係数
を有する２相液体−液体抽出方法を用いた発酵ビールか
らの微生物学的に生成されたキモシンの回収を開示して
いないことは明らかである。

さらに、引用例は、キモシンと共に発酵酵素を含む
（すなわち、ほとんどのキモシンは１つの層から回収さ
れ、一方ほとんどの他の発酵酵素はもう１つの層から回
収される）発酵ビールからキモシンを選択的に回収する
ことを開示していない。

一方、微生物学的活性およびその後の純化によりキモ
シンの工業的または商業的規模の生産は、液体−液体の
２相系におけるキモシンの大分配係数、並びにそのよう
な２相系が使用される際のビールに含まれる他の発酵酵
素からのキモシンの選択的回収によって、大きく促進さ
れる。

従って、本発明の目的は、発酵または他の微生物学的
活性により生産される酵素の水性混合物から微生物学的
に生成されるキモシンを回収する有効な方法、特にキモ
シンの商業的規模の回収に有効な方法を提供することで
ある。

本発明のもう１つの目的は、約85を超えるキモシンの
分配係数を有する液体−液体２相系を用いた微生物学的
に生成されるキモシンの回収方法を提供することであ
る。

本発明のさらにもう１つの目的は、他の酵素を含む発
酵ビールに含まれる他のポリペプチドからのキモシンの
選択的回収を可能にする、液体−液体２相系を用いた微
生物学的に生成されるキモシンの回収方法を提供するこ
とである。

本発明のさらにもう１つの目的は、微生物学的に生成
されるキモシンの回収および純化の方法を提供すること
である。

これらおよびその他の目的は、以下に述べる発明の概
要、発明の詳細な記述、実施例および請求の範囲に示さ
れるように、本発明によって達成される。

発明の概要 １つの側面において、本発明は、２相系を形成するた
めに有効量のポリエチレングリコール（PEG）と無機塩
を発酵ビールに加え；発酵ビールとポリエチレングリコ
ールと無機塩との混合物を、キモシンリッチで発酵ポリ
ペプチドプアのポリマー相と、キモシンプアで発酵ポリ
ペプチドリッチの塩相とに分離させ；そして前記キモシ
ンリッチで発酵ポリペプチドプアのポリマー相を回収す
ることから成る、発酵ポリペプチドを付加的に含む水性
発酵ビールから微生物学的に生成されるキモシンを回収
する方法にある。

驚いたことに、この回収方法は、発酵ビールに見出さ
れる発酵ポリペプチドからのキモシンの選択的回収を可
能にし、さらにまた、約85を超え、好ましくは約100を
超えるキモシン回収の分配係数を与える。

通常、発酵ビールのpHは、キモシンが安定であるよう
なあらゆるpH（すなわち約6.5以下）とすることができ
る。しかしながら、好ましい実施態様においては、小さ
いpH（すなわち３以下のpH、好ましくは約２から約2.5
までのpH）を発酵ビールに用いると、約３から約6.5のp
Hを使用した場合に比べて、キモシンをポリエチレング
リコール相へと分離するためのより大きい分配係数（よ
り大きい選択性）（1000以上）を与えることがわかっ
た。

従って、本発明による好ましい方法は、発酵ポリペプ
チドを付加的に含む水性発酵ビールから微生物学的に生
成されるキモシンを回収する方法であって、発酵ビール
のpHを約３未満に調整し、次に発酵ビールに有効量のポ
リエチレングリコール（PEG）と無機塩とを加えて２相
系を形成し、発酵ビール−ポリエチレングリコール−無
機塩混合物を、キモシンリッチで発酵ポリペプチドプア
のポリマー相とキモシンプアで発酵ポリペプチドリッチ
の塩相とに分離させ、そしてキモシンリッチで発酵ポリ
ペプチドプアのポリマー相を回収することから成る方法
に関する。

本発明のさらなる側面において、ポリエチレングリコ
ール相を、キモシンがイオン交換樹脂に結合する条件下
で該イオン交換樹脂と接触させることにより、キモシン
がポリエチレングリコール相から分離できることがわか
った。これらの条件下において、ポリエチレングリコー
ルがイオン交換樹脂を通過し、キモシンが該イオン交換
樹脂から回収される。従って、本発明の上記側面による
方法は、発酵ポリペプチドを付加的に含む水性発酵ビー
ルから微生物学的に生成されるキモシンを回収および純
化する方法であって、 ａ） 有効量のポリエチレングリコール（PEG）と無機
塩を発酵ビールに加えて２相系を形成し、 ｂ） 発酵ビール−ポリエチレングリコール−無機塩混
合物が、キモシンリッチで発酵ポリペプチドプアのポリ
エチレングリコール相とキモシンプアで発酵ポリペプチ
ドリッチの塩相に分離するのを許容し、 ｃ） キモシンリッチで発酵ポリペプチドプアのポリエ
チレングリコール相を回収し、 ｄ） キモシンがイオン交換樹脂に結合しかつポリエチ
レングリコールがイオン交換樹脂を通過する条件下で、
キモシンリッチで発酵ポリペプチドプアのポリエチレン
グリコール相をイオン交換樹脂と接触させ、そして ｅ） イオン交換樹脂からキモシンを回収することから
成る方法に関する。

本発明のこの側面において、そして上記した理由によ
り、ポリエチレングリコール／塩を該発酵ビールに加え
る前に、最初の発酵ビールのpHを約３以下に調整するこ
とが好ましい。さらにまた、前記PEG相の分離および該P
EG相とイオン交換樹脂との接触の期間を通してpHを約３
未満に維持することが好ましい。

発明の詳細な記述 種々の分子量のポリエチレングリコールなどのポリマ
ーと他のポリマー（例えばデキストラン）または無機塩
との組合せを用いて水溶液から種々の酵素を分離するこ
とは公知である。しかしながら、本発明は、十分な量の
ポリエチレングリコールと無機塩を発酵ビールに加えて
２相系を形成することによって、微生物学的に生成され
るキモシン（特に細胞外で生成されるキモシン）の抽出
のための極めて大きい分配係数が達成できるという予期
せぬ発見に一部関する。これらの状況下において、ほと
んど全てのキモシンがポリエチレングリコール相に分配
される。このことは、ポリエチレングリコール相におけ
るキモシンの分配係数が約85より大、好ましくは約100
より大であることによって示される。

さらに、本発明はまた、ポリエチレングリコールの無
機塩の添加による発酵ビールからの微生物学的に生成さ
れるキモシンの抽出（回収）が大きく選択的であるとい
う予期せぬ発見に関する。すなわち、この抽出工程はキ
モシンにとって選択的であり、発酵ビールに見い出され
る（他の酵素を含む）他のポリペプチドが優先的にキモ
シンプア塩相に保持される。この後者は、ポリマーと無
機塩の添加による水溶液からの酵素回収を論じた従来技
術は前記水溶液に存在する１つの酵素を他の酵素から選
択的に回収することを教示していない、という事実に鑑
みて、特に驚くべきことである。

しかしながら、本発明を詳しく論ずる前に、以下の用
語を定義しておく。

“微生物学的に生成されるキモシン”とは、天然に生
成されるキモシンの酵素活性を獲得するよう天然に生成
されるキモシンに対する十分なアミノ酸の相同性を有
し、かつここに述べる液体−液体２相水性系中における
天然に生成されるキモシンの分配特性を有する微生物学
的に生成されるポリペプチドを意味する。微生物学的に
生成されるキモシンは、通常、ホスト微生物（すなわち
糸状菌、バクテリア、酵母その他）を培養（発酵）し、
キモシンの全てあるいは大部分をエンコードする組換え
DNAで形質変換され、生成されたポリペプチドが天然に
生成されるキモシンの酵素活性を獲得することにより作
り出される。微生物学的に生成されるキモシンを生成で
きる適当な形質変換ホスト微生物の開示に関して例えば
米国特許出願第163,219号および米国特許第4,666,847号
を参照のこと。

微生物学的に生成されるキモシンはさらに細胞内生成
または細胞外生成に分類できる。より詳細には、細胞内
生成酵素は、発酵中にホスト細胞内で生成かつ保持さ
れ、発酵の完了時には（通常細胞を溶解（lysing）する
ことによって）細胞から遊離しなければならない酵素で
ある。細胞は従来のようにして殺され、熱を用いて溶解
される。例えば、Wegner等の米国特許第4,601,986号参
照のこと。ある種の微生物に有用なもう１つの方法は、
細胞を溶解（lyse）させる浸透圧を変えることである。
例えば、Aubert等の米国特許第4,299,858号を参照のこ
と。細胞を溶解するためのもう１つの従来法は、細胞壁
または膜を分解する酵素を導入することによる方法であ
る。この方法の例が杉山の米国特許第3,816,260号、小
林等の米国特許第3,890,198号、北村等の米国特許第3,9
17,510号に開示されている。これらの特許の開示内容は
本出願に引用として取り込まれている。

細胞外生成酵素は、微生物が細胞壁を横断して移送可
能であり、従ってさらなる処理を細胞に加えずに発酵の
完了時に発酵ビール中に見られる酵素である。

“天然に生成されるキモシン”とは、ビールに施され
るその後の処理を含む形質変換ホスト細胞の発酵から回
収されるキモシン含有溶液をいう。そのような任意の処
理工程には、例えば、無機塩およびポリエチレングリコ
ールの発酵ビールへの添加前に発酵ビール中で細胞（微
生物）を殺すことが含まれる。微生物を殺すことは、米
国特許出願第07/365,945号に記載されるようにして行う
のが好ましい。この出願の開示内容は本出願に引用す
る。さらに、無機塩およびポリエチレングリコールを加
える前に発酵ビールから細胞および／または細胞屑（ce
ll debris）を除去することが望ましい場合もある。そ
のような除去は、細胞および／または細胞屑を含む固体
のほとんどまたは全てを除去する濾過工程によって行い
得る。同様に、無機塩およびポリエチレングリコールを
加える前に発酵ビールのpHを調整することが望ましい場
合もある。また、細胞内生成キモシンにとって、溶解細
胞を除去しそしてタンパク質構造の巻き戻し後に本発明
のようにして処理されるキモシンのバルクを含む封入体
を回収することは一般的である。

“発酵ポリペプチド”とは、キモシン以外のポリペプ
チドであって、ポリエチレングリコールおよび無機塩を
加える時点で発酵ビールに含まれるホスト微生物（キモ
シンと共に）によって発酵中生成され得るポリペプチド
をいう。そのような発酵ポリペプチドの主な成員は発酵
中に共生成される酵素である。例えば、米国特許出願第
07/163,219号に記載されるようなキモシンの細胞外生成
もまた、α−アミラーゼ、酸性ホスファターゼ、レウア
ミノペピチダーゼ（leu amino peptidase）等の酵素の
生成を生じさせる。これら酵素は発酵の完了時の発酵ビ
ールにみられる。同様に、キモシンが細胞内で生成され
る場合、キモシンと共に生成される酵素には、ホスト細
胞の発酵中に生成されるあらゆる細胞外酵素やキモシン
を遊離させるために発酵の完了時にホスト細胞を溶解す
る際に遊離されたあらゆる細胞内酵素がある。

“発酵副生物”とは、ポリエチレングリコールと無機
塩を発酵ビールに加えた時に発酵ビールに含まれる非ポ
リペプチド生成物（例えば有機酸、錯カルボハイドレー
ト等）をいう。

“ポリエチレングリコール”とは、本発明のようにキ
モシンを抽出するのに使用できるあらゆる分子量のポリ
エチレングリコールをいう。ポリエチレングリコールは
約400から約22,000の分子量で得られる。本発明で使用
するのに好ましいポリエチレングリコールは約600から
約12,000の範囲の分子量を有する。特に好ましいポリエ
チレングリコールはPEG−8000、すなわち約8000の分子
量を有するポリエチレングリコールである。使用するポ
リエチレングリコールの選択は、キモシンを抽出すべき
混合物の組成に一部依存し、プロセスの経済性に一部依
存し、その他の要因にも依存する。

“無機塩”とは、本発明のようにしてキモシンを抽出
するのに使用できるあらゆる無機塩をいう。適した無機
塩には、例えば、硫酸塩、リン酸塩その他がある。硫酸
塩は好ましく、例えば硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウ
ム、硫酸アンモニウムその他がある。さらに、適した塩
の混合物も使用でき、さらにそのような塩の混合物と塩
化ナトリウムなどの塩との組合せも使用できる。塩化ナ
トリウムなどの塩は、それ自体ではポリエチレングリコ
ールで２相系に分かれないが、適当な無機塩と組合わせ
ると酵素の分配係数を向上させることが知られている。

“分配係数（Ｋ）”とは、 式 Ｋ＝C_t/C_b （ここで、C_tは上部相の分配コンパウンドの平衡濃度を
表わし、C_bは下部相の分配コンパウンドの平衡濃度を表
わす）で定義される。従って、各相の分配コンパウンド
の量はその分配係数と各相の容積に依存する。すなわ
ち、分配コンパウンドが一体的な分配係数を有する（分
配コンパウンドが上部相および下部相において等しく分
配される）場合、両相が同容積の場合のみ両相は同量の
分配コンパウンドを含む。上部相が下部相の10％の容積
を有する場合、分配係数が一体的であるとすると上部相
は10％の分配コンパウンドしか含まない。以上より、上
部相の容積が下部相に比べて小さい場合でも上部相で多
量の分配コンパウンドを回収できることから分配コンパ
ウンドの分配係数がとても大きいことが極めて有益であ
る。このように、本発明においては、大変大きい分配係
数のため、ポリエチレングリコールの使用量を小さくし
ながらキモシンの回収量を大変大きくすることができ
る。

“等電点（IP）”とは、ポリペプチドが静電的に中性
（すなわち、ポリペプチドが同数のプラスおよびマイナ
スに帯電した機能体（functionality）を有する）とな
るpHをいう。キモシンの等電点は約4.6である。等電点
未満のpHにおいて、キモシンは正味正電荷を有し、等電
点より大きいpHにおいて、キモシンは正味負電荷を有す
る。

“イオン交換樹脂”とは、帯電化合物を静電的に結合
する能力を有するタンパク相容性（protein compatibl
e）樹脂状材料をいう。

イオン交換樹脂は公知であり、カチオンおよびアニオ
ン交換樹脂を含む。

本発明の実施に際し、キモシンの溶液を、キモシンが
イオン交換樹脂に結合する条件下で、イオン交換樹脂と
接触させる。本発明においてカチオン交換樹脂を使用す
るかアニオン交換樹脂を使用するかは、ポリエチレング
リコール相のpH（すなわち、溶液のpHがキモシンの等電
点より上か下か）による。従って、キモシン含有溶液
を、キモシンがイオン交換樹脂に結合する条件下で、イ
オン交換樹脂と接触させるとは、単にキモシンがイオン
交換樹脂に結合するよう溶液のpHをその等電点より上か
下に調整することをいう。

溶液のpHは通常約6.5以下であるが、等電点付近のpH
（すなわち、約3.6から約5.0のpH）はキモシンの正味静
電荷が小さくなるので好ましくない。正味静電荷が小さ
いと、イオン交換樹脂との効果的な結合ができにくくな
る。

さらに、ポリエチレングリコール相（溶液）を3.0〜
5.0のpHに維持する場合、キモシンはより有効な自己分
解を生じる。自己分解は、水中よりポリエチレングリコ
ール中でかなり小さい。とにかく、水性ポリエチレング
リコール相を3.0〜5.0のpHに維持すると、自己分解によ
るキモシン産生量のいく分かのロスを生じる。従って、
カチオン交換樹脂を使用する場合は、溶液のpHを約3.0
未満にし、アニオン交換樹脂を使用する場合は、pHを約
5.0より大とすることが好ましい。

上記の理由から、好ましくは、ポリエチレングリコー
ル溶液のpHは約３以下、より好ましくは約３未満、さら
に好ましくは約２から約2.5とする。小さいpH値を用い
る場合、発酵副生物は容易にイオン交換樹脂を通過し、
一方大きいpH値（５以上のpH値）においてアニオン交換
樹脂を用いると、発酵副生物のいくらかが不可逆的にア
ニオン交換樹脂に結合して使用期間を短かくしてしま
う。

本発明に用いるのに好ましいカチオン交換樹脂には、
例えば、IBF SP Spherodex,Pharmacia SP−Sephadex,In
dion SP−2,IBF SP−Trisacrylその他がある。本発明に
用いるのに好ましいアニオン交換樹脂には、例えば、IB
F Q Spherodex,Pharmacia Q−Sphadex,Indion Q−2,IBF
Q−Trisacrylその他がある。

本発明の方法は、微生物学的に生成されるキモシンの
回収および／または純化に有用である。微生物学的に生
成されるキモシンを回収および純化する際、全発酵ビー
ルまたは混合物はその粗形態で使用でき、所望ならば、
発酵混合物をまず濾過してほとんどあるいは全ての固形
分を除去した後に液体の濾液を使用してもよい。

本発明の１つの側面において、発酵ビールに有効量の
ポリエチレングリコール（PEG）と有効量の無機塩を加
えて２相系を形成することにより、微生物学的に生成さ
れるキモシンを回収する、得られた溶液は放置されてキ
モシンリッチで発酵ポリペプチドプアのポリエチレング
リコール相とキモシンプアで発酵ポリペプチドリッチの
塩相とに分離される。次にキモシンリッチで発酵ポリペ
プチドプアのポリエチレングリコール相が従来の技術に
よって回収される。

これらの条件下において、前記ポリエチレングリコー
ル相において85より大、好ましくは100より大のキモシ
ンの分配係数が達成されることがわかった。ポリエチレ
ングリコール抽出は大きいpH値（すなわちpH6.5以上）
でキモシンを回収するのに有用であるが、pH3未満でキ
モシンを回収するのにより有効である。そのような小さ
いpH値において、1000あるいは超えるまでの分配係数が
達成され得る。大きい分配係数は特に好ましい。と言う
のは、大きい分配係数により、発酵ビールからのキモシ
ンの所望の分離を達成するのに少量のポリエチレングリ
コールで済み、次の段階としてポリエチレングリコール
からのキモシンの分離が促進される（すなわち、分離す
べきポリエチレングリコールが少なくて済む）からであ
る。

１回の抽出の結果、ポリエチレングリコールは発酵ビ
ールに元から存在する全キモシンの95％以上を含み得る
と共に、発酵ビールからの発酵ポリペプチドまたは発酵
副生物をあったとしてもほとんどない程度に含むのみと
なる。このように、発酵ビールに含まれる微生物学的に
生成されるキモシンのほぼ全部を回収する手段を提供す
るのみならず、本発明はまた、発酵ビールからのキモシ
ンの選択的回収をも提供する。キモシン回収のこの選択
性は、発酵ビールからキモシンを回収することを可能に
するのみならず、発酵中に共生成された発酵副生物およ
び発酵ポリペプチドのほとんどからキモシンを分離する
ことを可能にする。このように、本発明によるキモシン
の回収は、抽出前、すなわち発酵ビール中における発酵
ポリペプチドおよび発酵副生物によるキモシンの汚染に
比べてそれらによるキモシンの汚染が約75％以上少ない
（好ましくは約90％以上少ない）ポリエチレングリコー
ル相を与える。

本発明のもう１つの側面において、抽出されたキモシ
ンを含むポリエチレングリコール相が他の相から分離さ
れ、このポリエチレングリコール相が、キモシンがイオ
ン交換樹脂に結合するようなpHに調整しながら、イオン
交換樹脂と接触される。これらの条件下でポリエチレン
グリコールは帯電していないので、ポリエチレングリコ
ールはイオン交換樹脂を通過し、ポリエチレングリコー
ルからのキモシンの純化が達成される。このように、抽
出されたキモシンを含む単離したポリエチレングリコー
ル相が、キモシンがイオン交換樹脂に結合する条件下
で、イオン交換樹脂と接触されると、略全てのキモシン
がポリエチレングリコールから出て来てイオン交換樹脂
に結合し、ポリエチレングリコールはイオン交換樹脂カ
ラムを通過する。最初の接触後、好ましくはイオン交換
樹脂からキモシンを除去せずに、残るポリエチレングリ
コールを除去するため、イオン交換樹脂は水または水と
塩で洗浄される。次に、キモシンは、キモシンをイオン
交換樹脂から除去するpHに維持された緩衝剤と塩溶液を
用いて、カラムから溶離される。キモシン回収の高選択
性により、イオン交換樹脂の勾配溶離または段階的溶離
を用いる必要がない。と言うのは、ポリエチレングリコ
ール相でイオン交換樹脂と結合し、その後イオン交換樹
脂から遊離されるほぼ唯一の酵素または物質はキモシン
だからである。従って、塩溶液を用い、（もちろん、カ
チオン交換樹脂を使うかアニオン交換樹脂を使うかによ
って）pHを上げるか下げるかしてイオン交換樹脂に結合
したキモシン全部を１バッチで溶離させるワンバルク工
程でキモシンを溶離できる。好ましくは、溶離の速度ま
たは程度を援助するため、あるいは、ある場合（すなわ
ちアニオン交換樹脂を用いて）イオン交換樹脂からのキ
モシンの溶離を行わせるため、溶離溶液に塩を加える。
好ましくは、溶離溶液と共に塩が使用される。と言うの
は、キモシンは通常塩溶液の形態で販売されており、従
ってこの段階でキモシンに塩を取り込むことは好都合で
ある。

プロセス全体を通して大きいpH（約6.5までのpH）が
使用できるが、発酵ビールからキモシンを抽出する際の
ポリエチレングリコール／無機塩混合物の効率、よって
プロセスの効率は、抽出工程全体を通して小さいpHが保
たれた場合程高くはない。従って、プロセス全体の効率
を高めるため、小さいpH、よってカチオン交換樹脂を使
用するのが好ましい。

約３以下のpHでポリエチレングリコール抽出を行い、
分離されたポリエチレングリコール相をpHを小さく保ち
ながらカチオン交換樹脂と接触させることによって本発
明の上記好ましい側面を組合わせると、１回のポリエチ
レングリコール抽出およびイオン交換樹脂との１回の
（single−pass）接触で、最初の発酵ビールに存在して
いた全キモシンの90〜95％を回収できることがわかっ
た。

一方、ポリエチレングリコール抽出工程に大きいpHを
用い、さらにキモシンの等電点より大きいpHに維持しな
がらアニオン交換樹脂を使用しても、許容できる結果が
得られる。しかしながら、その場合には、不可逆的に結
合した発酵副生物の蓄積によってアニオン交換樹脂の耐
用年数は減じられる。キモシンを抽出するのに大きいpH
を使用する場合、前述した問題は、ポリエチレングリコ
ール抽出物のpHをキモシンの等電点より小さくし（好ま
しくは約3.6以下、より好ましくは約３以下）、次にキ
モシンをカチオン交換樹脂と接触させることによって回
避できる。

前述したポリエチレングリコール／無機塩混合物を用
いることによるキモシン回収の高い収率に加えて、ポリ
エチレングリコール中のキモシンの溶解度が大変高くて
キモシンが水性相からポリエチレングリコール相に急速
に移動することがわかった。ポリエチレングリコール相
へのキモシンの抽出に必要な時間は通常大変短いので、
それは重要なプロセス設計ファクターではない。従っ
て、この方法は大変有効で実施に際して経済的であり、
商業生産へと容易にスケールアップされる。

明らかなように、pHに関係なく、本発明の方法は、水
性混合物からより疎水性のポリエチレングリコール相へ
のキモシンの移動を伴う。これは、少なくとも一部は、
非ポリエチレングリコール相の塩濃度によって促進され
る。小さい分子量のポリエチレングリコールを使用する
と、ポリエチレングリコールは疎水性が小さくなり、非
ポリエチレングリコール相中の高い塩濃度が必要となっ
て、実施のコストを上げる。大きい分子量でより疎水性
のポリエチレングリコールを使用すると、より少ない塩
で済むが、高分子量ポリエチレングリコールの高粘度の
ために分離速度が小さくなる。このように、本発明の方
法は、所望のポリエチレングリコール分子量、塩濃度そ
して所望の経済性を与える他のパラメータを選択するこ
とにより、どのような特定のオペレーションにも最適化
できる。１つの目的は、ポリエチレングリコール相への
キモシンの移動に必要な時間を最小にすることである
が、もう１つの目的はポリエチレングリコール相にほと
んど全てのキモシンを移動させるのに用いられる塩の量
を最小にすることである。非ポリエチレングリコール相
中の塩濃度は20wt％以上にもすることができるが、通常
適切なポリエチレングリコールと共に用いて約15％未満
とする。例えば、PEG−8000と共に用いて約10〜13％の
硫酸ナトリウムが適当である。一方、最少無機塩濃度
は、ポリエチレングリコールによって２相系を形成する
のに必要な塩の濃度によって決定される。しかしなが
ら、好ましい実施態様において、無機塩濃度は、発酵ビ
ールの容積を基準にして約8.5から約20の対容積重量％
（weight to volume percent）である。

また、好ましくは、用いられるポリエチレングリコー
ル濃度は、発酵ビールの容積を基準にして約20対容積重
量％未満、より好ましくは約15対容積重量％未満であ
る。経済性および後の分離の容易性の点から、ポリエチ
レングリコールはできる限り少なく使用するのが好まし
い。使用されるポリエチレングリコールおよび無機塩の
正確な濃度は、当業者によって容易に決定し得る。

キモシンがイオン交換樹脂と結合した後、イオン交換
樹脂を通過したポリエチレングリコール相を集め、そし
て活性炭などの化学種で処理して付加的不純物を除去す
るかまたは集めたポリエチレングリコール相を直接出発
材料の他のバッチに加えることにより、ポリエチレング
リコール相は回収されそして再使用され得る。

同様に、イオン交換樹脂は、適切なpHに調整された水
溶液でイオン交換樹脂を洗浄することにより、キモシン
を含むポリエチレングリコールの次のバッチに使用する
ため再生できる。例えば、カチオン交換樹脂を使用する
場合、pHを約２にするのに十分な硫酸を含む水溶液で洗
浄することにより該カチオン交換樹脂は再生できる。

ポリエチレングリコールのリサイクリングとイオン交
換樹脂の再使用を可能にする本発明の上記側面により、
本発明の方法は、キモシン（特に微生物学的に生成され
るキモシン）の工業的量の純化のための有効な商業的お
よび工業的オペレーションに特に有用となる。

本発明について概要を述べてきたが、以下の実施例に
示される実施態様を参照することにより、本発明がより
明確に理解されよう。しかしながら、本発明の範囲は添
付の請求の範囲によって決定されるものであり、以下の
実施例は、本発明が実施できる特定の様態の単なる例示
に過ぎない。

実施例 実施例１ 本実施例は、水性２相ポリエチレングリコール抽出と
それに続くイオン交換樹脂との接触を用いて食品グレー
ドキモシンを生産するキモシン回収方法を記載する。キ
モシンはAspergillus Nigre var.awamoriの発酵から回
収される。プロセスは、3000 1発行槽と約2500 1のブロ
スハーベスト容積（broth harvest volume）で記載す
る。発酵が完了すると、硫酸および酢酸の添加によりpH
を2.0〜2.5に調整することにより、ブロス（broth）を
不活性化する（米国特許出願第07/365,945号,Lawlis等
により1989年６月13日出願（開示内容は本出願に引用）
を参照のこと）。この不活性化状態を１時間、発酵温度
において空気流れ中で保持する。この不活性化は、汚染
物をこわすために十分な実行可能な細胞減少（viable c
ell reduction）を達成する。不活性化の後に、pHを2.0
〜2.5に維持する。不活性化は、約125kgの硫酸と25kgの
酢酸を必要とする。

PEG8000/硫酸ナトリウム系を用いてpH2.0〜2.5におい
て水で３×に稀釈し、その後４％重量／容積のPEG8000
（75kg）と10.5％重量／容積の無水硫酸ナトリウムを加
えることにより、ブロスを抽出する。PEG/塩系とブロス
を混合すると、短時間でキモシンがPEG相に抽出され
る。この２相混合物を、抽出遠心機を用いて分離する。
キモシンリッチの軽PEG相をさらなる処理のために集め
る。このプロセスを用いてPEG抽出のために2500 1のブ
ロスを約7500 1に稀釈し、約700 1のPEG相抽出物を得
る。

この抽出物は脱イオン水で３×に稀釈され、イオン交
換工程の前にセルロース パッドを通して濾過される。
濾過された抽出物を、40〜100ミクロンの粒径を有するI
BF Spherodex SPカチオン交換樹脂の10 1カラムに通
す。充填したカラムを、pH2の30 1 ６％NaCl溶液で洗
浄する。このカラムをpH6.0において50mMリン酸塩緩衝
剤と2M NaClで溶離する。イオン交換樹脂の能力は樹脂
１当り約60gのキモシンまでである。キモシンを含む溶
離画分を次の処理のために集める。カラムは、硫酸でpH
2に調整された水で洗浄することによって再使用のため
再生される。溶離されたキモシン溶液は商業的食品グレ
ード使用のため17％NaClとされるか、所望ならば他の目
的用に処理される。

実施例２ 本実施例は、本発明の方法により得られる、PEG相へ
のキモシンの高分配を示すものである。実施例１と同じ
発酵ブロスを用いて同じように不活性化し、以下の抽出
を、全ブロス（サンプル１）および回転真空ドラムフィ
ルターからの全ブロスの濾液（サンプル２および３）に
対して行った。３つのサンプル全てを処理のためpH2に
維持し、５％重量／容積のPEG8000および10％重量／容
積の硫酸ナトリウムで抽出した。サンプル１および２を
ボトル遠心機（RC3B）で相分離し、サンプル３をSA−１
連続実験遠心機で分離した。

（CHU−Chris.Hansen単位− CHU/ml,以下の条件下： 基 体:110gの低温スプレー乾燥、スキムミルク粉末
を1000mlの0.05％塩化カルシウムに懸濁させる。このミ
ルクを室温で30分間攪拌し、そしてさらに30分間放置す
る。このミルクは４〜25℃の範囲の温度で３時間以下の
期間貯蔵しなければならない。

温 度：恒温水浴中で32±0.2℃ 酵素添加:0.5mlの酵素溶液を25mlの戻したスキムミルク
に加え、稀釈して380〜500秒の凝固時間を与える。

（410〜460の凝固時間を与える） ある値の測定に用いた方法は曖昧であっておよそその
値を与えるものであるため、上記マスバランス（mass b
alance）は100％ではない。しかしながら、上記試験
は、試験方法の実験誤差を許容する本発明によって達成
されるキモシンの相対分配を表わしている。

実施例３ 本実施例では、脱イオン水で稀釈し濾過した実施例１
と類似のPEG相を、pH＝２の脱イオン水中で平衡させら
れた各樹脂1mlのカラムに通した。流れ速度は1.0ml/分
であり、pH＝2.0の脱イオン水で洗浄した。pH＝5.8,2M
NaCl,50mMリン酸ナトリウム（Pi）で溶離した。

樹 脂： 実施例４ 本実施例は、多段階溶離を以下のように行った以外は
実施例３と同じである。すなわち、670mlのSP−Spherod
ex樹脂；充填および溶離＠450ml.分;1:4PEG抽出物の稀
釈pH＝2.0重点（load 1:4 dilution of PEG Extract pH
＝2.0）；脱イオンH20 pH2.0,2M NaCl pH2.0で洗浄;2
M NaCl,200mM Pi,pH5.8で溶離。

実施例５ 本実施例は、860mlのPEG抽出物を１％“Nuchar SA"木
炭で30分間処理し、濾過し、1:3に稀釈し、次に3.2cmの
床深を有する2.5mlの樹脂のカラムに供給した以外は実
施例４と同じである。結果は以下の通りであった。

実施例６ 実施例２の抽出手順と同様であるが、約5.8のpHを使
用して、下記の酵素を水溶液から液体−液体２相系のポ
リエチレングリコール相に抽出して以下の結果を得た
（純粋酵素を使用）。

この実験をくり返したが、今後はpHを２〜2.5にして
以下の結果を得た。

上記結果は、キモシンが優れた分配係数（すなわち、
pH5.8あるいは２〜2.5で約85より大）を与え、一方、牛
ペプシンおよび豚ペプシンは小さいpHでのみ優れた分配
係数を与えることを示している。しかしながら、牛ペプ
シンも豚ペプシンも発酵ビールにみられるポリペプチド
ではない。一方、上記データはまた、微生物レンネット
（すなわち、E.parasiticaアスパラギン酸プロテアーゼ
（aspartic protease）およびM.mieheiアスパラギン酸
プロテアーゼ）が試験された小さいpHおよび大きいpHで
大きな分配係数を有しないことを示している。

実施例７ 次の実施例は、Aspergillus Niger var.awamoriの発
酵ビールにみられるグルコアミラーゼ（GAM）、α−ア
ミラーゼ、酸性ホスファターゼ、レウアミノペプチダー
ゼアミラーゼ（leu amino peptidase amylase）、そし
てキモシンについて、pH2.5と5.5での分配係数の直接比
較に関する。下記の例外を除いて、抽出は、実施例２と
同様に行った。

上記データは、キモシンがポリエチレングリコール相
に分配され、発酵ビールの他の酵素はポリエチレングリ
コール相に分配されないことを示している。このデータ
は、発酵ポリペプチドの存在下で、キモシンがポリエチ
レングリコール相に選択的に分配されることを立証して
いる。

実施例８ pH5.8のAspergillus Niger var.awamoriの１アリコ
ートをRC−3B遠心機（Sorvall）で約5000×ｇにて約15
分間遠心分離して細胞（殺さずに）を除去した。得られ
た発酵ブロス（fermentation broth）を約37℃にあたた
めた。この溶液に、硫酸ナトリウム（10.5対容積重量
％）とPEG8000（４対容積重量％）を加えた。この溶液
を成分が溶解するまで混合させた。次にこの溶液を5000
×ｇの遠心分離に約15分間（遠心機で）供し、得られた
相の分離を促進させた。キモシンリッチポリエチレング
リコール相（上部相）を塩リッチ相（下部相）から、パ
ースタルティックポンプ（perstaltic pump）を用いて
下部相を除去することにより、分離した。上部相の半分
（45ml）を蒸留水で1:3に稀釈し、50mMリン酸ナトリウ
ムpH5.8で平衡させた2.5ml Pharmacia Q−Sepharoseカ
ラムに充填した。このカラムを同じ緩衝剤の14カラム容
積で洗浄した。キモシンを50mMリン酸ナトリウム、pH5.
8、2M NaClで溶離した。溶離剤の容積は45mlであっ
た。結果は以下の通りである。

上述した手段に従うと、実質的に純粋なキモシンが回
収される。すなわち、キモシンは少なくとも約90wt％の
純度を有し、好ましくは少なくとも約95wt％の純度を有
し、不純物を除くためのさらなる重大な処理を行うこと
なく商業的使用のために調製できる。商業的キモシン生
成物は通常、１ガロン当り約5gまたは１キモシン当り
約1.5gに稀釈する。塩（通常NaCl）濃度は、通常約18％
までにされ、防腐剤（例えば安息香酸ナトリウムのよう
な）を加える。食品グレード使用を意図した最終濃縮生
成物は通常、最終濾過にも供されて、存在するあらゆる
望ましくない固形分または粒子を除かれる。

以下、本発明の実施態様を項に分けて記載する。

1.発酵酵素を付加的に含む水性発酵ビールから微生物学
的に生成されるキモシンを回収する方法であって、発酵
ビールに有効量のポリエチレングリコールと無機塩を加
えて２相系を形成し、発酵ビール−ポリエチレングリコ
ール−無機塩混合物がキモシンリッチで発酵ポリペプチ
ドプアのポリマー相とキモシンプアで発酵ポリペプチド
リッチの塩相に分離するのを許容し、そしてキモシンリ
ッチで発酵ポリペプチドプアのポリマー相を回収するこ
とからなる方法。

2.発酵ビールのpHが約6.5以下であることを特徴とする
実施態様第１項記載の方法。

3.発酵ビールのpHが約３以下であることを特徴とする実
施態様第２項記載の方法。

4.発酵ビールのpHが約2.8未満であることを特徴とする
実施態様第３項記載の方法。

5.ポリエチレングリコールの平均分子量が約600〜約12,
000であることを特徴とする実施態様第１項記載の方
法。

6.ポリエチレングリコールの平均分子量が約5000〜約1
0,000であることを特徴とする実施態様第５項記載の方
法。

7.無機塩が硫酸塩およびリン酸塩から成る群より選択さ
れることを特徴とする実施態様第１項記載の方法。

8.無機塩が硫酸塩であることを特徴とする実施態様第７
項記載の方法。

9.硫酸塩が硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウムおよび硫
酸アンモニウムから成る群より選択されることを特徴と
する実施態様第８項記載の方法。

10.ポリエチレングリコールおよび無機塩を加える前に
水性発酵ビールをまず濾過することを特徴とする実施態
様第１項記載の方法。

11.発酵ポリペプチドを付加的に含む水性発酵ビールか
ら微生物学的に生成されるキモシンを回収する方法であ
って、水性混合物のpHを約３未満に調整し、発酵混合物
に有効量のポリエチレングリコールと無機塩を加えて２
相系を形成し、発酵ビール−ポリエチレングリコール−
無機塩混合物がキモシンリッチで発酵ポリペプチドプア
のポリマー相とキモシンプアで発酵ポリペプチドリッチ
の塩相に分離するものを許容し、そしてキモシンリッチ
で発酵ポリペプチドプアのポリマー相を回収することか
らなる方法。

12.ポリエチレングリコールの平均分子量が約600〜約1
2,000であることを特徴とする実施態様第11項記載の方
法。

13.ポリエチレングリコールの平均分子量が約5000〜約1
0,000であることを特徴とする実施態様第12項記載の方
法。

14.無機塩が硫酸塩およびリン酸塩から成る群より選択
されることを特徴とする実施態様第11項記載の方法。

15.無機塩が硫酸塩であることを特徴とする実施態様第1
4項記載の方法。

16.硫酸塩が硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウムおよび
硫酸アンモニウムから成る群より選択されることを特徴
とする実施態様第15項記載の方法。

17.ポリエチレングリコールおよび無機塩を加える前に
水性発酵ビールをまず濾過することを特徴とする実施態
様第11項記載の方法。

18.発酵ポリペプチドを付加的に含む水性発酵ビールか
ら微生物学的に生成されるキモシンを回収および純化す
る方法であって、 ａ）有効量のポリエチレングリコールおよび無機塩を発
酵ビールに加えて２相系を形成し、 ｂ）発酵ビール−ポリエチレングリコール−無機塩混合
物が、キモシンリッチで発酵ポリペプチドプアのポリエ
チレングリコール相とキモシンプアで発酵ポリペプチド
リッチの塩相に分離するのを許容し、 ｃ）キモシンリッチで発酵ポリペプチドプアのポリエチ
レングリコール相を回収し、 ｄ）キモシンがイオン交換樹脂に結合しかつポリエチレ
ングリコールがイオン交換樹脂を通過する条件下で、キ
モシンリッチで発酵ポリペプチドプアのポリエチレング
リコール相をイオン交換樹脂と接触させ、そして ｅ）イオン交換樹脂からキモシンを回収する、 各工程から成ることを特徴とする方法。

19.ポリエチレングリコールの平均分子量が約600〜約1
2,000であることを特徴とする実施態様第18項記載の方
法。

20.ポリエチレングリコールの平均分子量が約5000〜約1
0,000であることを特徴とする実施態様第19項記載の方
法。

21.無機塩が硫酸塩およびリン酸塩から成る群より選択
されることを特徴とする実施態様第18項記載の方法。

22.無機塩が硫酸塩であることを特徴とする実施態様第2
1項記載の方法。

23.硫酸塩が硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウムおよび
硫酸アンモニウムから成る群より選択されることを特徴
とする実施態様第22項記載の方法。

24.ポリエチレングリコールと無機塩を加える前に水性
発酵ビールをまず濾過することを特徴とする実施態様第
18項記載の方法。

25.発酵ビールのpHが約6.5以下であることを特徴とする
実施態様第18項記載の方法。

26.発酵ビールのpHが約３以下であることを特徴とする
実施態様第25項記載の方法。

27.発酵ビールのpHが約2.8未満であることを特徴とする
実施態様第26項記載の方法。

28.キモシンリッチで発酵ポリペプチドプアのポリエチ
レングリコール相のpHが5.0〜6.5の範囲かまたは約3.0
以下であることを特徴とする実施態様第18項記載の方
法。

29.キモシンリッチで発酵ポリペプチドプアのポリエチ
レングリコール相のpHが約3.0以下であり、カチオン交
換樹脂を使用することを特徴とする実施態様第28項記載
の方法。

30.キモシンリッチで発酵ポリペプチドプアのポリエチ
レングリコール相のpHが約5.0〜約6.5の範囲であり、ア
ニオン交換樹脂を使用することを特徴とする実施態様第
28項記載の方法。

31.工程ａ）を約３以下のpHでポリエチレングリコール
相の分離後に行い、この相のpHは約5.0〜6.5の範囲に調
整され、アニオン交換樹脂を使用することを特徴とする
実施態様第18項記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ヘイエンガ，カーク ジェイ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94402 サン マテオ ベイリッジ ウ ェイ 1640 (72)発明者 アーノルド，レイモンド イー アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94133 サン フランシスコ ロンバー ド ストリート 894 (56)参考文献 特開 昭57−63083（ＪＰ，Ａ) 特開 平１−168284（ＪＰ，Ａ)

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】発酵酵素を付加的に含む水性発酵ビールか
   ら微生物学的に生成されるキモシンを回収する方法であ
   って、発酵ビールに有効量のポリエチレングリコールと
   無機塩を加えて２相系を形成し、発酵ビール−ポリエチ
   レングリコール−無機塩混合物がキモシンリッチで発酵
   ポリペプチドプアのポリマー相とキモシンプアで発酵ポ
   リペプチドリッチの塩相に分離するのを許容し、そして
   キモシンリッチで発酵ポリペプチドプアのポリマー相を
   回収することからなる方法。
2. 【請求項２】発酵ポリペプチドを付加的に含む水性発酵
   ビールから微生物学的に生成されるキモシンを回収する
   方法であって、水性混合物のpHを約３未満に調整し、発
   酵混合物に有効量のポリエチレングリコールと無機塩を
   加えて２相系を形成し、発酵ビール−ポリエチレングリ
   コール−無機塩混合物がキモシンリッチで発酵ポリペプ
   チドプアのポリマー相とキモシンプアで発酵ポリペプチ
   ドリッチの塩相に分離するものを許容し、そしてキモシ
   ンリッチで発酵ポリペプチドプアのポリマー相を回収す
   ることからなる方法。
3. 【請求項３】発酵ポリペプチドを付加的に含む水性発酵
   ビールから微生物学的に生成されるキモシンを回収およ
   び純化する方法であって、 ａ）有効量のポリエチレングリコールおよび無機塩を発
   酵ビールに加えて２相系を形成し、 ｂ）発酵ビール−ポリエチレングリコール−無機塩混合
   物が、キモシンリッチで発酵ポリペプチドプアのポリエ
   チレングリコール相とキモシンプアで発酵ポリペプチド
   リッチの塩相に分離するのを許容し、 ｃ）キモシンリッチで発酵ポリペプチドプアのポリエチ
   レングリコール相を回収し、 ｄ）キモシンがイオン交換樹脂に結合しかつポリエチレ
   ングリコールがイオン交換樹脂を通過する条件下で、キ
   モシンリッチで発酵ポリペプチドプアのポリエチレング
   リコール相をイオン交換樹脂と接触させ、そして ｅ）イオン交換樹脂からキモシンを回収する、 各工程から成ることを特徴とする方法。