JPH0584092A - バクテリオシンの生産方法 - Google Patents
バクテリオシンの生産方法Info
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- JPH0584092A JPH0584092A JP10492891A JP10492891A JPH0584092A JP H0584092 A JPH0584092 A JP H0584092A JP 10492891 A JP10492891 A JP 10492891A JP 10492891 A JP10492891 A JP 10492891A JP H0584092 A JPH0584092 A JP H0584092A
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- JP
- Japan
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- bacteriocin
- liquid
- production method
- pediococcus
- filtration residue
- Prior art date
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- Pending
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
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- Separation Using Semi-Permeable Membranes (AREA)
- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 ペジオコックス属の菌株によって産生される
バクテリオシンの活性を、培養物の精製によって高め
る。 【構成】 ペジオコックス属菌株の培養物上澄液を限外
濾過により精製処理して、約４０００−５０００ダルト
ンの分子量のバクテリオシンを含み、沸騰水中で安定で
あり、食品中で細菌の生育を阻害すると共に食品の風味
を害しない濾過残分を取得する。限外濾過は、バクテリ
オシンの分子量に対応する孔径よりも大きな孔径を有す
る限外濾過膜を用いて実施する。
バクテリオシンの活性を、培養物の精製によって高め
る。 【構成】 ペジオコックス属菌株の培養物上澄液を限外
濾過により精製処理して、約４０００−５０００ダルト
ンの分子量のバクテリオシンを含み、沸騰水中で安定で
あり、食品中で細菌の生育を阻害すると共に食品の風味
を害しない濾過残分を取得する。限外濾過は、バクテリ
オシンの分子量に対応する孔径よりも大きな孔径を有す
る限外濾過膜を用いて実施する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明はペジオコックス由来の
バクテリオシンを限外濾過によって精製する方法に、関
するものである。より詳しくいうとこの発明は、精製さ
れたバクテリオシンが精製後にも活性を保持する方法に
係る。
バクテリオシンを限外濾過によって精製する方法に、関
するものである。より詳しくいうとこの発明は、精製さ
れたバクテリオシンが精製後にも活性を保持する方法に
係る。
【０００２】
【従来の技術】タンパク質は無機塩を用いる沈澱、有機
溶媒、イオン交換、分子ふるいクロマトグラフィー、及
び限外濾過を含む各種の手段を用いて単離できる。それ
ぞれのタンパク質はこれらの各方法に対し異別に反応
し、達成される精製度と回収タンパク質の活性は大きく
異なっている。１９６０年代に発達した限外濾過は、各
種のタンパク質を精製するため成功のうちに利用されて
来ている。各種型式のタンパク質限外濾過膜及び装置が
開発されて来ている。
溶媒、イオン交換、分子ふるいクロマトグラフィー、及
び限外濾過を含む各種の手段を用いて単離できる。それ
ぞれのタンパク質はこれらの各方法に対し異別に反応
し、達成される精製度と回収タンパク質の活性は大きく
異なっている。１９６０年代に発達した限外濾過は、各
種のタンパク質を精製するため成功のうちに利用されて
来ている。各種型式のタンパク質限外濾過膜及び装置が
開発されて来ている。
【０００３】接線流濾過（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ ｆｌ
ｏｗ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）は、比較的大きな残留分
子を濾過膜の表面を横切る向きに掃引することによって
なされる分離法である。本方法は濾過膜を透過する物質
（濾液）または濾過膜によって拘束残留せしめられる物
質（濾過残分−ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）を精製し収集する
ために、用いることができる。細孔寸法或は遮断分子量
（ｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｔ ｃｕｔｏｆｆ―ＭＷ
ＣＯ）よりも小さな分子は膜を透過することができて、
より高分子量の分子から分離される。
ｏｗ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）は、比較的大きな残留分
子を濾過膜の表面を横切る向きに掃引することによって
なされる分離法である。本方法は濾過膜を透過する物質
（濾液）または濾過膜によって拘束残留せしめられる物
質（濾過残分−ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）を精製し収集する
ために、用いることができる。細孔寸法或は遮断分子量
（ｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｔ ｃｕｔｏｆｆ―ＭＷ
ＣＯ）よりも小さな分子は膜を透過することができて、
より高分子量の分子から分離される。
【０００４】分子濾過は、約１０-3から１０-1（１０か
ら１０００オングストローム）の間の寸法をもつ分子が
分離される障壁濾過（ｂａｒｒｉｅｒ ｆｉｌｔｒａｔ
ｉｏｎ）形式のものである。分子は分子量遮断によって
選択的に分離される。その分離は約１０−１００ｐｓｉ
（０．７０−７．０ｋｇ／ｃｍ2）の圧力で達成され
る。フィルターは一般に中空繊維膜、プレート及びフレ
ーム、及びらせんチューブである。この種の装置は当業
者によく知られているものである。
ら１０００オングストローム）の間の寸法をもつ分子が
分離される障壁濾過（ｂａｒｒｉｅｒ ｆｉｌｔｒａｔ
ｉｏｎ）形式のものである。分子は分子量遮断によって
選択的に分離される。その分離は約１０−１００ｐｓｉ
（０．７０−７．０ｋｇ／ｃｍ2）の圧力で達成され
る。フィルターは一般に中空繊維膜、プレート及びフレ
ーム、及びらせんチューブである。この種の装置は当業
者によく知られているものである。
【０００５】Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅ
ｅｒｉｎｇ Ｎｅｗｓ ３２−５４（１９８９年４月１
０日発行）は、タンパク質の折りたたみ（フォールディ
ング）と活性に対する影響について論じている。タンパ
ク質の形状（形態）の変化により生物活性が変化する。
タンパク質の形状は、タンパク質が精製されるときに変
化しうる。この結果は、増殖培地からのペジオコックス
由来のバクテリオシンを精製するときに見出された。こ
れらのバクテリオシンを精製しようと試みると、単離さ
れるタンパク質の量は精製工程の結果として増すけれど
も活性の喪失が生じた。このことからして精製工程がペ
ジオコックス由来のバクテリオシンの構造を、活性を減
少させるように変更することが判明した。
ｅｒｉｎｇ Ｎｅｗｓ ３２−５４（１９８９年４月１
０日発行）は、タンパク質の折りたたみ（フォールディ
ング）と活性に対する影響について論じている。タンパ
ク質の形状（形態）の変化により生物活性が変化する。
タンパク質の形状は、タンパク質が精製されるときに変
化しうる。この結果は、増殖培地からのペジオコックス
由来のバクテリオシンを精製するときに見出された。こ
れらのバクテリオシンを精製しようと試みると、単離さ
れるタンパク質の量は精製工程の結果として増すけれど
も活性の喪失が生じた。このことからして精製工程がペ
ジオコックス由来のバクテリオシンの構造を、活性を減
少させるように変更することが判明した。
【０００６】他の問題はペジオコックス由来のバクテリ
オシンを、それが混入される食品の風味に対して関与し
ないように精製する点にある。そのためには単位体積当
りの高いバクテリオシン活性が要求される。このような
精製を行なうことは、バクテリオシンが食品中で使用す
べきものである限り本質的に重要である。
オシンを、それが混入される食品の風味に対して関与し
ないように精製する点にある。そのためには単位体積当
りの高いバクテリオシン活性が要求される。このような
精製を行なうことは、バクテリオシンが食品中で使用す
べきものである限り本質的に重要である。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】したがってこの発明の
目的とするところは、ペジオコックス由来のバクテリオ
シンを精製により単位体積当り増大された活性をもつよ
うに生産する方法を提供するにある。またこの発明は、
殺菌に有効な濃度で食品に対し何らの風味も付け加えな
いバクテリオシンを提供することも、一つの目的とす
る。さらにこの発明は、比較的単純で経済的に実施でき
るバクテリオシンの生産方法を提供することも目的とす
る。
目的とするところは、ペジオコックス由来のバクテリオ
シンを精製により単位体積当り増大された活性をもつよ
うに生産する方法を提供するにある。またこの発明は、
殺菌に有効な濃度で食品に対し何らの風味も付け加えな
いバクテリオシンを提供することも、一つの目的とす
る。さらにこの発明は、比較的単純で経済的に実施でき
るバクテリオシンの生産方法を提供することも目的とす
る。
【０００８】
【一般的な説明】この発明はバクテリオシンを生産する
方法に係り、同方法は、ペジオコックス属の細菌を液体
固体混合増殖培地中で培養して、液体中にバクテリオシ
ンを産生させ、増殖培地中の液体から固体を除去し、液
体中に存在する不純物を限外濾過により分離して、バク
テリオシンを含む液体増殖培地よりも単位体積当りより
高い活性を有するバクテリオシン含有液体濾過残分を得
るものに、構成される。
方法に係り、同方法は、ペジオコックス属の細菌を液体
固体混合増殖培地中で培養して、液体中にバクテリオシ
ンを産生させ、増殖培地中の液体から固体を除去し、液
体中に存在する不純物を限外濾過により分離して、バク
テリオシンを含む液体増殖培地よりも単位体積当りより
高い活性を有するバクテリオシン含有液体濾過残分を得
るものに、構成される。
【０００９】またこの発明は食品中で使用するためのバ
クテリオシンに係り、同バクテリオシンは、ペジオコッ
クス属の細菌を液体固体混合培地中で培養して、液体増
殖培地中にバクテリオシンを産生させ、液体中に存在す
る不純物を限外濾過により分離してバクテリオシンを含
む液体増殖培地よりも単位体積当りより高い活性を有す
る液体濾過残分であって、それに含まれるバクテリオシ
ンが約４０００から５０００ダルトンの間の分子量を有
し、沸騰水中で安定であり、食品中に存在する細菌の生
育を阻止する濃度で味覚を呈しないものである濾過残分
を得る方法によって生産される。
クテリオシンに係り、同バクテリオシンは、ペジオコッ
クス属の細菌を液体固体混合培地中で培養して、液体増
殖培地中にバクテリオシンを産生させ、液体中に存在す
る不純物を限外濾過により分離してバクテリオシンを含
む液体増殖培地よりも単位体積当りより高い活性を有す
る液体濾過残分であって、それに含まれるバクテリオシ
ンが約４０００から５０００ダルトンの間の分子量を有
し、沸騰水中で安定であり、食品中に存在する細菌の生
育を阻止する濃度で味覚を呈しないものである濾過残分
を得る方法によって生産される。
【００１０】好ましいバクテリオシンは約４０００から
５０００ダルトンの分子量をもつけれども、同バクテリ
オシンはあたかもその３倍以上の分子寸法（約１６，５
００ダルトン）であるかのように分離することを見出し
た。したがって限外濾過は、濾過残分が限外濾過フィル
ターを透過すると考えられるようなバクテリオシンを含
むこととなるように遂行される。
５０００ダルトンの分子量をもつけれども、同バクテリ
オシンはあたかもその３倍以上の分子寸法（約１６，５
００ダルトン）であるかのように分離することを見出し
た。したがって限外濾過は、濾過残分が限外濾過フィル
ターを透過すると考えられるようなバクテリオシンを含
むこととなるように遂行される。
【００１１】ペジオコックス由来の好ましいバクテリオ
シンはペジオコックス・アシディラクティシィ（Ｐｅｄ
ｉｏｃｏｃｃｕｓ ａｃｄｉｌａｃｔｉｃｉ）の菌株、
好ましくはＮＲＲＬ−Ｂ−１８０５０によって生産され
る。本菌株は米国特許第４，８８３，６７３号明細書に
記載されており、また特許手続上の微生物の寄託の国際
的承認に関するブダペスト条約の規定に基いてアメリカ
合衆国、イリノイ州、ペオリアのノーザン リィジョナ
ル リサーチ ラボラトリー（ＮｏｔｈｅｒｎＲｅｇｉ
ｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）
に寄託されている。
シンはペジオコックス・アシディラクティシィ（Ｐｅｄ
ｉｏｃｏｃｃｕｓ ａｃｄｉｌａｃｔｉｃｉ）の菌株、
好ましくはＮＲＲＬ−Ｂ−１８０５０によって生産され
る。本菌株は米国特許第４，８８３，６７３号明細書に
記載されており、また特許手続上の微生物の寄託の国際
的承認に関するブダペスト条約の規定に基いてアメリカ
合衆国、イリノイ州、ペオリアのノーザン リィジョナ
ル リサーチ ラボラトリー（ＮｏｔｈｅｒｎＲｅｇｉ
ｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）
に寄託されている。
【００１２】ペジオコックス・アシディラクティシィ
ＮＲＲＬ−Ｂ−１８０５０によって生産される好ましい
バクテリオシンは、約４０００から５０００ダルトンの
間の分子量を有する。このバクテリオシンの精製物は沸
騰水中で安定であり、活性を保持する。他のペジオコッ
クス由来のバクテリオシンも、この発明の方法によって
単離できる。
ＮＲＲＬ−Ｂ−１８０５０によって生産される好ましい
バクテリオシンは、約４０００から５０００ダルトンの
間の分子量を有する。このバクテリオシンの精製物は沸
騰水中で安定であり、活性を保持する。他のペジオコッ
クス由来のバクテリオシンも、この発明の方法によって
単離できる。
【００１３】限外濾過フィルターはバクテリオシンを濾
過残分中に分離して、濾液中には移動させない。使用す
るフィルターは、濾過残分中にバクテリオシンが含まれ
るように約４０００から１６０００ダルトンの間の分子
を遮断するものであるのが望ましい。
過残分中に分離して、濾液中には移動させない。使用す
るフィルターは、濾過残分中にバクテリオシンが含まれ
るように約４０００から１６０００ダルトンの間の分子
を遮断するものであるのが望ましい。
【００１４】ペジオコックス菌株用の増殖培地は加水分
解されたタンパク質、アミノ酸、糖、及び増殖を促すミ
ネラル添加物を含む。このような培地は当業者によく知
られており、増殖培地の液体中でのバクテリオシンの産
生を最大化するように調製される。限外濾過産物はバク
テリオシンを「塩析」させる硫酸アンモニウムのような
沈澱剤を用いて処理でき、次に沈澱したバクテリオシン
を液体から分離できる。限外濾過産物は緩衝液中で透析
器を通して透析し、低分子量（約１０Ｋダルトン以下）
の化合物を除去できる。
解されたタンパク質、アミノ酸、糖、及び増殖を促すミ
ネラル添加物を含む。このような培地は当業者によく知
られており、増殖培地の液体中でのバクテリオシンの産
生を最大化するように調製される。限外濾過産物はバク
テリオシンを「塩析」させる硫酸アンモニウムのような
沈澱剤を用いて処理でき、次に沈澱したバクテリオシン
を液体から分離できる。限外濾過産物は緩衝液中で透析
器を通して透析し、低分子量（約１０Ｋダルトン以下）
の化合物を除去できる。
【００１５】バクテリオシンを含む限外濾過産物は、食
品中への添加或は他の用途のために乾燥して粉末にする
のが好ましい。こうすることによって不所望の液体が食
品中に導入されるのが阻止され、また荷づくりが容易と
なる。乾燥は凍結乾燥、噴霧乾燥、ドラム乾燥、トレイ
乾燥、或は薄膜乾燥、またはバクテリオシンの熱不活性
化を生じさせない限度内で熱を加える他の任意の方法に
よって、行なえる。限外濾過産物を凍結するのもよく、
その場合も活性が保持される。
品中への添加或は他の用途のために乾燥して粉末にする
のが好ましい。こうすることによって不所望の液体が食
品中に導入されるのが阻止され、また荷づくりが容易と
なる。乾燥は凍結乾燥、噴霧乾燥、ドラム乾燥、トレイ
乾燥、或は薄膜乾燥、またはバクテリオシンの熱不活性
化を生じさせない限度内で熱を加える他の任意の方法に
よって、行なえる。限外濾過産物を凍結するのもよく、
その場合も活性が保持される。
【００１６】食品中で使用する凍結乾燥粉の量は、食品
の重量を基準として約１０パーセントまでである。この
量は重量比で食品の約０．１−１０パーセントであるの
が、好ましい。
の重量を基準として約１０パーセントまでである。この
量は重量比で食品の約０．１−１０パーセントであるの
が、好ましい。
【００１７】結果する限外濾過産物は、１ミリリットル
当り少なくとも１００ＡＵのＡＵ（任意単位）のもので
ある。このＡＵは普通、１ｍｌ当り約１００−１６００
０である。バクテリオシンの１ＡＵは、寒天平板上の１
層のグラム陽性細菌（ペジオコックス・ペントサセウス
−Ｐ． ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ−ＦＢＢ−６３（以前
はペジオコックス・セレビッシェ−Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃ
ｕｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ−ＦＢＢ−６３として知ら
れていたもの））について明白な抑制ゾーンを生じさせ
る培養物上澄液最高希釈物の５マイクロリットル（μ
ｌ）と、定義されている。米国特許第４，８８３，６７
３号明細書及び特開平２−５８４５号公報は、食品中で
のバクテリオシンの使用について述べている。培養物な
いし増殖培地中のバクテリオシンは０．２２ミクロンで
フィルター滅菌され、細菌及び他の細胞汚染物を除去さ
れている。溶液中で種々の分子を分離することは行なわ
れていない。
当り少なくとも１００ＡＵのＡＵ（任意単位）のもので
ある。このＡＵは普通、１ｍｌ当り約１００−１６００
０である。バクテリオシンの１ＡＵは、寒天平板上の１
層のグラム陽性細菌（ペジオコックス・ペントサセウス
−Ｐ． ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ−ＦＢＢ−６３（以前
はペジオコックス・セレビッシェ−Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃ
ｕｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ−ＦＢＢ−６３として知ら
れていたもの））について明白な抑制ゾーンを生じさせ
る培養物上澄液最高希釈物の５マイクロリットル（μ
ｌ）と、定義されている。米国特許第４，８８３，６７
３号明細書及び特開平２−５８４５号公報は、食品中で
のバクテリオシンの使用について述べている。培養物な
いし増殖培地中のバクテリオシンは０．２２ミクロンで
フィルター滅菌され、細菌及び他の細胞汚染物を除去さ
れている。溶液中で種々の分子を分離することは行なわ
れていない。
【００１８】
【明細な説明】菌株：ペジオコックス・アシディラクテ
ィシィＮＲＲＬ−Ｂ−１８０５０の細菌単離物を液体チ
ッ素中で貯蔵し、基本的にはＭＲＳ Ａｇａｒ（アメリ
カ合衆国、ミシガン州、デトロイトのＤｉｆｃｏ社製）
上において３５℃で培養した。
ィシィＮＲＲＬ−Ｂ−１８０５０の細菌単離物を液体チ
ッ素中で貯蔵し、基本的にはＭＲＳ Ａｇａｒ（アメリ
カ合衆国、ミシガン州、デトロイトのＤｉｆｃｏ社製）
上において３５℃で培養した。
【００１９】培地：ペジオコックス・アシディラクティ
シィＮＲＲＬ−Ｂ−１８０５０を、次に述べる組成の培
地を異なった量宛用いて培養した。培地は４％のトウモ
ロコシ浸出液（ミネラル類及びペプチド類）、５％のブ
ドウ糖（糖）、３％の酵母エキス（タンパク質及びビタ
ミン類）、及び１％のＨｙｃａｓｅ（登録商標。アメリ
カ合衆国、ニューヨーク州、ノーウイッチのＳｈｅｆｆ
ｉｅｌｄ社製。酸で加水分解したカゼインタンパク質で
あり、アミノ酸及びタンパク質を遊離する。）を含むも
のであった。この培地をｐＨ７．０に調整し、殺菌し
た。
シィＮＲＲＬ−Ｂ−１８０５０を、次に述べる組成の培
地を異なった量宛用いて培養した。培地は４％のトウモ
ロコシ浸出液（ミネラル類及びペプチド類）、５％のブ
ドウ糖（糖）、３％の酵母エキス（タンパク質及びビタ
ミン類）、及び１％のＨｙｃａｓｅ（登録商標。アメリ
カ合衆国、ニューヨーク州、ノーウイッチのＳｈｅｆｆ
ｉｅｌｄ社製。酸で加水分解したカゼインタンパク質で
あり、アミノ酸及びタンパク質を遊離する。）を含むも
のであった。この培地をｐＨ７．０に調整し、殺菌し
た。
【００２０】バクテリオシンの検定：バクテリオシンの
産生を、ゴンザレツ及びクンカによって以前に報告され
ている方法によって検定した（Ｇｏｎｚａｌｅｚａｎｄ
Ｋｕｎｋａ：Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎ
ｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ５３，２５
３４−２５３８（１９８７））。試料は孔径０．２２μ
ｍのフィルター（アメリカ合衆国、マサチューセッツ
州、ベッドフォードのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．
製）を用いて、フィルター滅菌した。ＭＲＳＡｇａｒ平
板を、指示細胞を植菌した軟寒天（０．８％）で被覆し
た。フィルター滅菌した試料を殺菌希釈水で希釈し、被
覆物の表面に滴下した。
産生を、ゴンザレツ及びクンカによって以前に報告され
ている方法によって検定した（Ｇｏｎｚａｌｅｚａｎｄ
Ｋｕｎｋａ：Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎ
ｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ５３，２５
３４−２５３８（１９８７））。試料は孔径０．２２μ
ｍのフィルター（アメリカ合衆国、マサチューセッツ
州、ベッドフォードのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．
製）を用いて、フィルター滅菌した。ＭＲＳＡｇａｒ平
板を、指示細胞を植菌した軟寒天（０．８％）で被覆し
た。フィルター滅菌した試料を殺菌希釈水で希釈し、被
覆物の表面に滴下した。
【００２１】タンパク質の検定：コック及びプットナム
のマイクロ―ビュレットタンパク質測定法を利用した
（Ｋｏｃｈ ａｎｄ Ｐｕｔｎａｍ：Ａｎａｌｙｔｉｃ
ａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４４，２３９−２４５
（１９７１））。標準タンパク質はウシ血清アルブミン
とした。
のマイクロ―ビュレットタンパク質測定法を利用した
（Ｋｏｃｈ ａｎｄ Ｐｕｔｎａｍ：Ａｎａｌｙｔｉｃ
ａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４４，２３９−２４５
（１９７１））。標準タンパク質はウシ血清アルブミン
とした。
【００２２】以下に掲げる実施例１−３は、種々の型式
の限外濾過に係る。実施例４はバクテリオシンの使用に
係る。実施例５は透析用の緩衝液として炭酸水素アンモ
ニウムを利用する例に係る。得られた凍結乾燥粉末は、
食品中に添加したとき味覚を附加しなかった。
の限外濾過に係る。実施例４はバクテリオシンの使用に
係る。実施例５は透析用の緩衝液として炭酸水素アンモ
ニウムを利用する例に係る。得られた凍結乾燥粉末は、
食品中に添加したとき味覚を附加しなかった。
【００２３】
【実施例１】ＰＡ−１の濃度に対する限外濾過及び硫酸
アンモニウム沈澱法の比較。
アンモニウム沈澱法の比較。
【００２４】ペジオコックス・アシディラクティシィＮ
ＲＲＬ−Ｂ−１８０５０を、前述した培地の２リットル
中において３５℃で１８時間、培養した。１８時間後に
ブロス培養物を８０００×ｇ、４℃で２０分間、遠心分
離処理して細胞と他の細胞性不純物を除去した。上澄液
（１．０リットル）を保留し、各異なった型式で精製し
た。限外濾過はＡｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｍｏｄｅｌ
８２００ Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｃｅｌｌ
（アメリカ合衆国、マサチューセッツ州、ダンバーのＤ
ｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｗ．Ｒ． Ｇｒａｃｅ Ｃｏ．
製）を用いて達成した。上澄液を限外濾過膜ＹＭ１０
（１００００ダルトンの分子量遮断（ＭＷＣＯ））を通
して濾過した。濾過残分を収集して、ＰＡ−１活性につ
いて検定した（表１）。残りの上澄液を次に硫酸アンモ
ニウム沈澱法（５０％ ｗｔ／ｖｏ１）にかけ、ｐＨ
６．０、０．０１モルのトリス−マレアート（Ｔｒｉｓ
−ｍａｌｅａｔｅ）を用い透析し、ＰＡ−１活性につい
て検定した（表１）。
ＲＲＬ−Ｂ−１８０５０を、前述した培地の２リットル
中において３５℃で１８時間、培養した。１８時間後に
ブロス培養物を８０００×ｇ、４℃で２０分間、遠心分
離処理して細胞と他の細胞性不純物を除去した。上澄液
（１．０リットル）を保留し、各異なった型式で精製し
た。限外濾過はＡｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｍｏｄｅｌ
８２００ Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｃｅｌｌ
（アメリカ合衆国、マサチューセッツ州、ダンバーのＤ
ｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｗ．Ｒ． Ｇｒａｃｅ Ｃｏ．
製）を用いて達成した。上澄液を限外濾過膜ＹＭ１０
（１００００ダルトンの分子量遮断（ＭＷＣＯ））を通
して濾過した。濾過残分を収集して、ＰＡ−１活性につ
いて検定した（表１）。残りの上澄液を次に硫酸アンモ
ニウム沈澱法（５０％ ｗｔ／ｖｏ１）にかけ、ｐＨ
６．０、０．０１モルのトリス−マレアート（Ｔｒｉｓ
−ｍａｌｅａｔｅ）を用い透析し、ＰＡ−１活性につい
て検定した（表１）。
【００２５】
【表１】
【００２６】実施例１は、１０，０００ＭＷＣＯの限外
濾過によって、濾過残分中で高い活性を有するバクテリ
オシンの多大な回収が得られることを示している。この
ことは、本タンパク質が約４０００から５０００ダルト
ンの間の分子寸法をもつにも拘らず真実であった。そし
てこの事実は限外濾過に対しバクテリオシンの分子量
が、おそらく分子の凝集が起きることからしてより大で
あるように挙動するということを、示している。
濾過によって、濾過残分中で高い活性を有するバクテリ
オシンの多大な回収が得られることを示している。この
ことは、本タンパク質が約４０００から５０００ダルト
ンの間の分子寸法をもつにも拘らず真実であった。そし
てこの事実は限外濾過に対しバクテリオシンの分子量
が、おそらく分子の凝集が起きることからしてより大で
あるように挙動するということを、示している。
【００２７】
【実施例２】接線流限外濾過によるＰＡ−１の精製。
【００２８】ペジオコックス・アシディラクティシィＮ
ＲＲＬ−Ｂ−１８０５０を、前述した培地の１リットル
中において３５℃で１８時間、培養した。１８時間後に
ブロス培養物を８０００×ｇ、４℃で２０分間、遠心分
離処理した。上澄液（１．０ｌ）を保留し、各異なった
型式の精製を行なった。限外濾過はＭａｎｉｔａｎ（登
録商標）接線流濾過装置（アメリカ合衆国、マサチュー
セッツ州、ベッドフォードのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏ
ｒｐ．製）を用いて行なった。２種の膜プレートセッ
ト、１００，０００（ＭＷＣＯ）及び１０，０００（Ｍ
ＷＣＯ）を、利用した。結果を表２に示す。
ＲＲＬ−Ｂ−１８０５０を、前述した培地の１リットル
中において３５℃で１８時間、培養した。１８時間後に
ブロス培養物を８０００×ｇ、４℃で２０分間、遠心分
離処理した。上澄液（１．０ｌ）を保留し、各異なった
型式の精製を行なった。限外濾過はＭａｎｉｔａｎ（登
録商標）接線流濾過装置（アメリカ合衆国、マサチュー
セッツ州、ベッドフォードのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏ
ｒｐ．製）を用いて行なった。２種の膜プレートセッ
ト、１００，０００（ＭＷＣＯ）及び１０，０００（Ｍ
ＷＣＯ）を、利用した。結果を表２に示す。
【００２９】
【表２】
【００３０】この実施例は多量のバクテリオシンが回収
されたことを示している。この場合にもバクテリオシン
は、その分子寸法がＭＷＣＯよりも小さいにも拘らず濾
過残分中に留められた。
されたことを示している。この場合にもバクテリオシン
は、その分子寸法がＭＷＣＯよりも小さいにも拘らず濾
過残分中に留められた。
【００３１】
【実施例３】らせんカートリッジ限外濾過によるＰＡ−
１の濾過。
１の濾過。
【００３２】ペジオコックス・アシディラクティシィＮ
ＲＲＬ−Ｂ−１８０５０を、前述した培地の３００ガロ
ン（１１４０リットル）中において３５℃で１８時間、
培養した。１８時間後にブロス培養物を遠心分離処理
し、上澄液を保留して各異なった型式の精製を行なっ
た。限外濾過は、接線流を与えるＰＵＦ−１５（登録商
標）パイロットシステム（アメリカ合衆国、マサチュー
セッツ州、ベッドフォードのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏ
ｒｐ．製）を用いて遂行した。上澄液を１００，０００
（ＭＷＣＯ）のポリスルホン製カートリッジを通して濾
過した。この１００，０００（ＭＷＣＯ）の透過物を次
に、１０，０００（ＭＷＣＯ）のセルロース樹脂製カー
トリッジを通して濾過した。結果を表３に揚げる。
ＲＲＬ−Ｂ−１８０５０を、前述した培地の３００ガロ
ン（１１４０リットル）中において３５℃で１８時間、
培養した。１８時間後にブロス培養物を遠心分離処理
し、上澄液を保留して各異なった型式の精製を行なっ
た。限外濾過は、接線流を与えるＰＵＦ−１５（登録商
標）パイロットシステム（アメリカ合衆国、マサチュー
セッツ州、ベッドフォードのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏ
ｒｐ．製）を用いて遂行した。上澄液を１００，０００
（ＭＷＣＯ）のポリスルホン製カートリッジを通して濾
過した。この１００，０００（ＭＷＣＯ）の透過物を次
に、１０，０００（ＭＷＣＯ）のセルロース樹脂製カー
トリッジを通して濾過した。結果を表３に揚げる。
【００３３】
【表３】
【００３４】本実施例は当該タンパク質の最良の回収率
を与えた。バクテリオシンは１０，０００ＭＷＣＯを、
分子寸法がより小さいのにも拘らず透過しなかった。
を与えた。バクテリオシンは１０，０００ＭＷＣＯを、
分子寸法がより小さいのにも拘らず透過しなかった。
【００３５】
【実施例４】ペジオコックス・アシディラクティシィＮ
ＲＲＬ−Ｂ−１８０５０により産生され限外濾過により
濃縮された凍結乾燥バクテリオシンの使用。
ＲＲＬ−Ｂ−１８０５０により産生され限外濾過により
濃縮された凍結乾燥バクテリオシンの使用。
【００３６】バクテリオシンＰＡ−１を、前述した培地
中での発酵により産生させた。同バクテリオシンを次
に、実施例３で述べた方法によって濃縮した。次に濃縮
物を凍結乾燥した。凍結乾燥製品は１６，０００ＡＵ／
ｇの活性をもっていた。
中での発酵により産生させた。同バクテリオシンを次
に、実施例３で述べた方法によって濃縮した。次に濃縮
物を凍結乾燥した。凍結乾燥製品は１６，０００ＡＵ／
ｇの活性をもっていた。
【００３７】市販の滅菌かん詰チキン（鶏肉）に対しリ
ステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏ
ｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）を、過重な負担量である１６
００ＡＵ／ｇの割合で添加して植菌した。チキンを７℃
で貯蔵し、貯蔵時間を異にする複数画分を採取してＭｃ
Ｂｒｉｄｅ´ｓ Ａｇａｒ（アメリカ合衆国、ミシガン
州、デトロイトのＤｉｆｃｏ社製）上で標準的な平板計
数法によりリステリア・モノサイトゲネスの生育につい
て検定した。結果を表４に示す。
ステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏ
ｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）を、過重な負担量である１６
００ＡＵ／ｇの割合で添加して植菌した。チキンを７℃
で貯蔵し、貯蔵時間を異にする複数画分を採取してＭｃ
Ｂｒｉｄｅ´ｓ Ａｇａｒ（アメリカ合衆国、ミシガン
州、デトロイトのＤｉｆｃｏ社製）上で標準的な平板計
数法によりリステリア・モノサイトゲネスの生育につい
て検定した。結果を表４に示す。
【００３８】
【表４】
【００３９】この結果は凍結乾燥バクテリオシンがかん
詰チキンを保護したこと、したがって同バクテリオシン
が加工食品の貯蔵寿命を延ばすのに有用であることを、
示している。食品に対しバクテリオシンが何らの味覚を
附与しないことを確認した。
詰チキンを保護したこと、したがって同バクテリオシン
が加工食品の貯蔵寿命を延ばすのに有用であることを、
示している。食品に対しバクテリオシンが何らの味覚を
附与しないことを確認した。
【００４０】
【実施例５】不所望の低分子量成分を除去するための透
析及び濃縮過程での炭酸水素アンモニウムの使用。
析及び濃縮過程での炭酸水素アンモニウムの使用。
【００４１】ペジオコックス・アシディラクティシィ
を、前述した培地の１リットル中において３５℃で１８
時間、培養した。１８時間後にブロス培養物を８０００
×ｇ、４℃で２０分間、遠心分離処理した。上澄液（１
リットル）を濾過（０．４５ミクロン）し、次に１０
０，０００ＭＷＣＯプレートを備える接線流装置を用い
て限外濾過した。１０，０００ＭＷＣＯプレートを用い
て透過物を、元の体積の２０％（２００ｍｌ）が濾過残
分として残されるまで濃縮した。非透過物（濾過残分）
に等量の炭酸水素アンモニウム緩衝液（０．１モル、ｐ
Ｈ７―８）を加え、次いで体積を２分の１に減少させる
ことによって、透析を実施した。この操作を３回行なっ
て０．０８７５モルの炭酸水素アンモニウムの最終緩衝
液濃度を得た。
を、前述した培地の１リットル中において３５℃で１８
時間、培養した。１８時間後にブロス培養物を８０００
×ｇ、４℃で２０分間、遠心分離処理した。上澄液（１
リットル）を濾過（０．４５ミクロン）し、次に１０
０，０００ＭＷＣＯプレートを備える接線流装置を用い
て限外濾過した。１０，０００ＭＷＣＯプレートを用い
て透過物を、元の体積の２０％（２００ｍｌ）が濾過残
分として残されるまで濃縮した。非透過物（濾過残分）
に等量の炭酸水素アンモニウム緩衝液（０．１モル、ｐ
Ｈ７―８）を加え、次いで体積を２分の１に減少させる
ことによって、透析を実施した。この操作を３回行なっ
て０．０８７５モルの炭酸水素アンモニウムの最終緩衝
液濃度を得た。
【００４２】透析産物を凍結乾燥し、官能テストで評価
した。無細胞のブロス培養物中及びその濃縮物中に存在
する苦味は炭酸水素アンモニウムによる処理試料中に
は、凍結乾燥中に炭酸水素アンモニウムが気化してしま
うことからして存在しなかった。
した。無細胞のブロス培養物中及びその濃縮物中に存在
する苦味は炭酸水素アンモニウムによる処理試料中に
は、凍結乾燥中に炭酸水素アンモニウムが気化してしま
うことからして存在しなかった。
【００４３】バクテリオシンの他の精製法を試みてみた
が、ほとんど成功はみられなかった。これらの他の精製
法には、（１）エタノール沈澱法と分離、（２）透析、
遠心分離及び１０，０００ＭＷＣＯではなく１，０００
ＭＷＣＯでの限外濾過が、含まれる。これらの精製法の
何れも、１ｍｌ当りのＡＵの約４倍を越える増加をもた
らすことはなかった。つまりペジオコックス由来のバク
テリオシンは高活性を生じさせるためには、本発明の方
法によって分離することを必須とするのである。
が、ほとんど成功はみられなかった。これらの他の精製
法には、（１）エタノール沈澱法と分離、（２）透析、
遠心分離及び１０，０００ＭＷＣＯではなく１，０００
ＭＷＣＯでの限外濾過が、含まれる。これらの精製法の
何れも、１ｍｌ当りのＡＵの約４倍を越える増加をもた
らすことはなかった。つまりペジオコックス由来のバク
テリオシンは高活性を生じさせるためには、本発明の方
法によって分離することを必須とするのである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ブレア エス クンカ アメリカ合衆国、34208フロリダ州、ブラ ーデントン、カールトン アームズ サー クル 1235デイ (72)発明者 ジエームズ テイ ヘンダーソン アメリカ合衆国、34207フロリダ州、ブラ ーデントン、フイフス ストリート ウエ スト 6719
Claims (23)
- 【請求項１】 バクテリオシンを生産する方法であっ
て、 ペジオコックス属の細菌を液体固体混合増殖培地中で培
養して、液体中にバクテリオシンを産生させ、 増殖培地中の液体から固体を除去し、 液体中に存在する不純物を限外濾過により分離して、バ
クテリオシンを含む液体増殖培地よりも単位体積当りよ
り高い活性を有するバクテリオシン含有液体濾過残分を
得る生産方法。 - 【請求項２】 バクテリオシンを乾燥して乾燥粉末とす
る請求項１の生産方法。 - 【請求項３】 前記増殖培地がタンパク質、アミノ酸、
糖、及びバクテリオシンの産生を促進するミネラル類を
含むものである請求項１の生産方法。 - 【請求項４】 前記液体濾過残分を沈澱剤を用い処理し
て、バクテリオシンを沈澱させ液体から分離する請求項
１の生産方法。 - 【請求項５】 前記沈澱剤として硫酸アンモニウムを用
いる請求項４の生産方法。 - 【請求項６】 沈澱したバクテリオシンを乾燥して乾燥
粉末とする請求項４の生産方法。 - 【請求項７】 前記液体濾過残分を沈澱剤を用い処理し
てバクテリオシンを沈澱させ液体から分離し、次にバク
テリオシンを緩衝液中に再懸濁させ透析してバクテリオ
シン中の不純物を除去する請求項１の生産方法。 - 【請求項８】 前記緩衝液が炭酸水素アンモニウムを含
むものである請求項７の生産方法。 - 【請求項９】 ペジオコックス属の細菌がペジオコック
ス・アシディラクティシィ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ
ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）である請求項１の生産方
法。 - 【請求項１０】 ペジオコックス属の細菌がペジオコッ
クス・アシディラクティシィ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ
ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）ＮＲＲＬ−Ｂ−１８０５
０である請求項１の生産方法。 - 【請求項１１】 食品中で使用するためのバクテリオシ
ンであって次の方法、すなわち、 ペジオコックス属の細菌を液体固体混合培地中で培養し
て、液体増殖培地中にバクテリオシンを産生させ、 液体中に存在する不純物を限外濾過により分離してバク
テリオシンを含む液体増殖培地よりも単位体積当りより
高い活性を有する液体濾過残分であって、それに含まれ
るバクテリオシンが約４０００から５０００ダルトンの
間の分子量を有し、沸騰水中で安定であり、食品中に存
在する細菌の生育を阻止する濃度で味覚を呈しないもの
である濾過残分を得る方法によって生産されたバクテリ
オシン。 - 【請求項１２】 バクテリオシンが乾燥粉末の形のもの
である請求項１１のバクテリオシン。 - 【請求項１３】 食品に対し１０重量パーセントまでの
添加量で味覚を附与しないものである請求項１１のバク
テリオシン。 - 【請求項１４】 バクテリオシンを生産する前記方法に
おいて限外濾過を、液体から４０００−１６０００ダル
トンの分子量の分子を遮断するように行なって、バクテ
リオシンを含む濾過残分を得る請求項１１のバクテリオ
シン。 - 【請求項１５】 バクテリオシンを生産する前記方法に
おいて前記増殖培地がタンパク質加水分解物、アミノ
酸、糖、及びバクテリオシンの産生を促進するミネラル
類を含むものである請求項１１のバクテリオシン。 - 【請求項１６】 バクテリオシンを生産する前記方法に
おいて前記液体濾過残分を、沈澱剤を用いて処理し、バ
クテリオシンを沈澱させて液体から分離する請求項１１
のバクテリオシン。 - 【請求項１７】 前記沈澱剤として硫酸アンモニウムを
用いてある請求項１６のバクテリオシン。 - 【請求項１８】 バクテリオシンを生産する前記方法に
おいて沈澱したバクテリオシンを、凍結乾燥して乾燥粉
末を得るようにした請求項１６のバクテリオシン。 - 【請求項１９】 寒天平板上で生育させたペジオコック
ス・ペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｐｅｎ
ｔｏｓａｃｅｕｓ）の指示株により検定したとき少なく
とも約１００ＡＵ／ｍｌを含むものである請求項１１の
バクテリオシン。 - 【請求項２０】 バクテリオシンを生産する前記方法に
おいて前記液体濾過残分を沈澱剤を用いて処理し、バク
テリオシンを沈澱させて液体から分離し、次にバクテリ
オシンを緩衝液中に再懸濁させ透析してバクテリオシン
中の不純物を除去するようにした請求項１１のバクテリ
オシン。 - 【請求項２１】 前記緩衝液が炭酸水素アンモニウムを
含むものである請求項２０のバクテリオシン。 - 【請求項２２】 ペジオコックス・アシディラクティシ
ィ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃ
ｉ）によって生産されたものである請求項１１のバクテ
リオシン。 - 【請求項２３】 ペジオコックス・アシディラクティシ
ィ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃ
ｉ）ＮＲＲＬ−Ｂ−１８０５０によって生産されたもの
である請求項１１のバクテリオシン。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US48813290A | 1990-03-05 | 1990-03-05 | |
| US07/488,132 | 1990-03-05 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0584092A true JPH0584092A (ja) | 1993-04-06 |
Family
ID=23938449
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10492891A Pending JPH0584092A (ja) | 1990-03-05 | 1991-03-01 | バクテリオシンの生産方法 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0445414A3 (ja) |
| JP (1) | JPH0584092A (ja) |
| AU (1) | AU628255B2 (ja) |
| CA (1) | CA2031688A1 (ja) |
| DE (1) | DE445414T1 (ja) |
| ES (1) | ES2033628T1 (ja) |
| GR (1) | GR920300017T1 (ja) |
| NZ (1) | NZ236443A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7112323B2 (en) * | 2003-05-07 | 2006-09-26 | Kraft Foods Holdings, Inc. | Intracellular proteinacious antimicrobial agents from lactic acid bacteria derived from fermented food samples |
| JP2007518400A (ja) * | 2003-12-04 | 2007-07-12 | バイオフィルムズ ストラテジーズ， インコーポレイテッド | バイオフィルムの形成を防止、存在するバイオフィルムを減少、および細菌の個体群を減少させるための方法ならびに組成物 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01202277A (ja) * | 1987-02-09 | 1989-08-15 | Microlife Technics Inc | 食品の変敗防止方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4929445A (en) * | 1988-01-25 | 1990-05-29 | Microlife Technics, Inc. | Method for inhibiting Listeria monocytogenes using a bacteriocin |
-
1990
- 1990-12-06 CA CA 2031688 patent/CA2031688A1/en not_active Abandoned
- 1990-12-12 NZ NZ23644390A patent/NZ236443A/en unknown
- 1990-12-20 DE DE1990124948 patent/DE445414T1/de active Pending
- 1990-12-20 EP EP19900124948 patent/EP0445414A3/en not_active Ceased
- 1990-12-20 ES ES90124948T patent/ES2033628T1/es active Pending
-
1991
- 1991-03-01 AU AU72021/91A patent/AU628255B2/en not_active Ceased
- 1991-03-01 JP JP10492891A patent/JPH0584092A/ja active Pending
-
1992
- 1992-08-25 GR GR92300017T patent/GR920300017T1/el unknown
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01202277A (ja) * | 1987-02-09 | 1989-08-15 | Microlife Technics Inc | 食品の変敗防止方法 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7112323B2 (en) * | 2003-05-07 | 2006-09-26 | Kraft Foods Holdings, Inc. | Intracellular proteinacious antimicrobial agents from lactic acid bacteria derived from fermented food samples |
| JP2007518400A (ja) * | 2003-12-04 | 2007-07-12 | バイオフィルムズ ストラテジーズ， インコーポレイテッド | バイオフィルムの形成を防止、存在するバイオフィルムを減少、および細菌の個体群を減少させるための方法ならびに組成物 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| GR920300017T1 (en) | 1992-08-25 |
| NZ236443A (en) | 1992-02-25 |
| EP0445414A3 (en) | 1992-05-20 |
| AU7202191A (en) | 1991-09-05 |
| EP0445414A2 (en) | 1991-09-11 |
| DE445414T1 (de) | 1992-05-21 |
| AU628255B2 (en) | 1992-09-10 |
| CA2031688A1 (en) | 1991-09-06 |
| ES2033628T1 (es) | 1993-04-01 |
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