JPS60218325A - 多価肺炎球菌ワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、“°Ｃ”多糖が実質的に存在しない精製され
た肺炎球菌莢膜多糖（ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｔ　ｃａ
ｐｓｕｌａｒ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）から成
る多価肺炎球菌ワクチンに関する。本発明は、また、デ
ンマーク表示によると、３．５．９Ｖ、ＩＯＡ、ＩＩＡ
、１５Ｂ、１７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆおよび３３Ｆ型であ
るｌＯの肺炎球菌型の各々を特別に精製して１本発明の
精製された免疫原多糖を生成することに関する。

本発明の多価肺炎球菌ワクチン中に存在する他の肺炎球
菌型は、デンマーク表示よると、１．２．４．６Ａ、６
Ｂ、７Ｆ、８．９Ｎ、１２Ｆ、１４．１８Ｃ，１９Ｆ、
２０．２３Ｆおよび３３Ｆであり、これらは米国特許第
４，２４２，５０１号中に示されているようにして精製
することができる。

本発明において有用な各型の肺炎球菌培養物は、多数の
培養研究所に貯蔵されておりかつ前記研究所から世界中
において入手することができる。アメリカン・タイプ・
カルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）（Ｔｈｅ　Ａｍｅ
ｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃ
ｔｉｎ。

１２３０１　Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋ
ｖｉ　ｌｉｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、Ｕ、Ｓ。

Ａ、２０８５２）は、本発明の肺炎球菌型のすべてを自
由に入手可能であるとして記載している。

１９８２年のＡＴＣＣカタログは、これらの型を次のよ
うに表示している（表工参照）ニー人ユー デンマーク の型の命名　米国の命　カタログの番号汰−−−−　各
法−− ｔ　１　６３０１ ２　２　６３０２ ３　３　６３０３ ４　４　６３０４ ５　５　６３０５ ６Ａ　６　６３０６ ６Ｂ　２６　６３２６ ７Ｆ　５１　１０３５１ ８　８　６３０８ ９Ｎ　９　６３０９ ９Ｖ　６８　１０３６８ １０Ａ　３４　８３３４ １１Ａ　４３　１０３４３ １２Ｆ　１２　６３１２ １４　１４　６３１４ １５Ｂ　５４　１０３５４ １７Ｆ　１７　６３１７ １８Ｃ５６１０３５６ １９Ａ　５７　１０３５７ １９Ｆ　１９　６３１９ ２０　２０　６３２０ ２２Ｆ　２２　６３２２ ２３Ｆ　２３　６３２３ ２５　２５　６３２５ ３３Ｆ　７０　１０３７０ ワクチンの製造における重要な工程は、適当な抗体の生
産を起こす保持された物質の性質を損失しないで、異質
物質を除去するように、免疫原物質を精製することであ
る。多糖類のこのような性質は、多糖類の「自然状態の
立体配置（ｎａｔｖｅ　５ｔａｔｅ　ｃｏｎｆｉｇｕｒ
ａｔｉ。

ｎ）」と呼ぶことができるものの保持にあるように思わ
れる。

多糖類から分離すべき材料のうちに、タンパク質、核酸
、および“Ｃ”多糖がある。“ＣＩＩ多糖は、デンマー
ク表示で肺炎球菌型４，７Ｆおよび１４中に高濃度で存
在し、そして米国特許第４゜２４２．５０１号中に示さ
れているようにしてそれから分離することができる。

核酸類（２６０ＭＵの光を吸収する）は肺炎球菌多糖類
の製造において満足すべきレベルに減少させることは困
難である。この問題は、免疫原性を保持しながら、より
容易に精製される髄膜炎菌多糖により提供される場合と
対照的である。骨髄脱炎多糖は、米国特許第３，６３６
，１９２号（Ｇｏｔｓｈｌｉｃｈ）中に示されている比
較的過酷な方法である。８５の特定の型の肺炎球菌が存
在する。これらの型は米国およびデンマークの両者の命
名系により表示される。ここに引用する型の表示はデン
マークの番号による。各型は汚染物質を排除する特定の
方法を必要とするように思われるが、単一の方法をすべ
ての型の肺炎球菌多糖類に適用することはできない。さ
らに、特定の適切な方法は予測不可能であるように思わ
れる。

種々の肺炎球菌多糖類を精製するために使用される異る
手順の例として、あるものは沈殿のために大量のエタノ
ールを必要とし、このアルコールは、核酸類が３Ａアル
コールを用いて低級アルコールの範囲において沈殿する
ので、核酸類から部分的に分離することができる。３Ａ
アルコール１よ５％の無水メタノールおよび９５％の無
水エタノールである。無水エタノールは本質的に同一の
方法でふるまうであろうから、完全に同等であると考え
られる。この明細書を通じて、「アルコール」という用
語は、特記しないかぎり、３Ａアルコールを表示する。

他の型では、多糖類は３０〜５０％の範囲において沈殿
し、こうしてアルコールは分離沈殿剤として有効ではな
い。対照的に、他の型は注意して調節された量の硫酸プ
ロタミンにより核酸類から分離することができる。これ
らの型では、硫酸プロタミンの最適濃度（０，０２〜０
．２０％）において、核酸類は沈殿し、高速遠心により
沈降させることができる。しかしながら、構成成分の核
酸を沈殿させるために要求される量を超える、この系に
おける過剰量の硫酸プロタミンは多糖類を追加的に沈殿
させる。他の型の肺炎球菌多糖の精製の例は、３ｆｆ！
！肺炎球菌にしばしば用いられる精製により提供され、
この多糖は核酸からの分離が困難である。酢酸カルシウ
ムを酢酸ナトリウムの代わりに３型肺炎球菌多糖の溶液
中の電解質として使用すると、多糖は最小量のアルコー
ル（１，０〜１２％）で沈殿させることができる。しか
しながら、この方法は時には実質的な量の核酸を上澄み
相中に溶解させることがある。多糖−核酸混合物と硫酸
アンモニウムとの反応における種々の肺炎球菌多糖の型
の挙動は、また変動する。ある多糖類ｔ＊５ｏ〜６０％
において硫酸アンモニウムにより沈殿し、これに対して
他のものは沈殿しない。１５多糖は硫酸アンモニウムで
沈殿せず、これに対して３型および４型は硫酸アンモニ
ウムで５０％の飽和にすることにより核酸からある程度
分離することができる。上の解説および次の参考文献か
ら明らかなように、８５以上の型の肺炎球菌が存在しか
つ実際的なワクチンの製造は多くの種の肺炎球菌からの
多糖分画からなる多価ワクチンを必要とし、各分画が比
較的自然状態の立体配　Ｉ置を保持するという事実を見
ると、すべての型に適用可能な肺炎球菌多糖から汚染物
質を除去する満足すべき方法は存在しない［Ｇｕｙ、Ｒ
，Ｃ。

Ｗ、、Ｈｏｗ、Ｊ、、５ｔａｃｅｙ、Ｍ、、Ｈｅｉｄｅ
ｌｂｅｒｇｅｒ、Ｍ、、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２４
２：２１　（１９６７）；Ｂｒｏｗｎ　、Ｒ，、Ｊ　、
Ｉｍｍｕｎｏ　ｌ　、３７　：　４４５（１９３９）；
Ｇｌａｕｄｅｍａｎｓ、Ｃ，Ｐ。

Ｊ、、Ｔｒｅｆｆｅｒｓ、Ｈ，Ｐ、、Ｃａｒｂ。

ｈｙｄｒａｔｅ　Ｒｅｓ、４．（１９６７）；Ｋａｂａ
ｔ　、Ｅ、Ａ、、Ｅｘｐ、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ、Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｃ，Ｔｈｏｍａｓ、ｐｕｂｌｉ
ｓｈｅｒ、ｐｐ、８３８−８４２（１９６７）。

肺炎球菌多糖の他の汚染物質はタンパク質である。アル
コールの沈殿はタンパク賀汚染物質のレベルの低下にお
いて有効であるが、この汚染を非経口的生成物のために
満足すべきレベルに低下させることは不可能である。タ
ンパク質のレベルを低下させるために普通に用いられる
１つの方法は、肺炎球菌多糖類とタンパク質との混合物
を有機溶媒に暴露することである。例えば、［セバグ（
Ｓｅｖａｇ）Ｊ（７）手順［Ｓｅｖａｇ　、Ｍ、Ｇ、。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｚ、、２ヱ２：４１９（１９３４）］
は、クロロホルムとブタノールとの混合物とともに４〜
６時間激しく振盪することにより抽出し１次いで低速度
で遠心することからなる。界面に集まる変性したタンパ
ク質を、次いで水相から多糖類と分離することができる
。しかしながら、この手順は、抽出が肺炎球菌多糖類に
しばしば悪影響を及ぼし、肺炎球菌多糖類を破壊し、解
重合し、あるいは自然状態の立体配置を損失させるので
、不満足である。得られるものは、免疫原として有効で
ない多糖類である。他の手順、例えば、硫酸アンモニウ
ムの沈殿およびモレキュラーシーブを用いてタンパク質
の汚染を減少することができるが、このような手順は溶
液中の多くの異る大きさおよび型のタンパク質類のうち
の各群のタンパク質類およびペプチド類に対して特異的
である。ここで再び、多糖類の変動性は、菌株に依存し
て、用いる特定のタンパク質の分離工程の有効性を決定
する。さらに、１つの手順はすべての肺炎球菌莢膜多糖
類の精製において有効ではなく、かつ特定の肺炎球菌莢
膜多糖の挙動の予測は不可能であるように思われると結
論することができる。

しかしながら、高い純度でかつ免疫原性を保持して肺炎
球菌莢膜多糖を精製するある数の方法が今回発見された
。これらの精製は、特定的にはｌＯの型の肺炎球菌の精
製に関する。これらの型は、３，５．９ｖ、ＩＯＡ、Ｉ
ＩＡ、１５Ｂ、１７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆおよび３３Ｆ型
（デンマーク表示）である。

本発明の主題は、デンマーク表示により、ｌ、２．３．
４．５，６Ｂ、７Ｆ、８．９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、ＩＩＡ
、１２Ｆ、１４．１５Ｂ、１７Ｆ、１８ｃ、１９Ａ、１
９Ｆ、２０．２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆ型と、６Ａお
よび２５型のθ〜１または両者との群から成り、かつ“
Ｃ１１多糖が実質的に存在しない、有効免疫原量の肺炎
球菌莢膜多糖、および４．７Ｆおよび１４型の主要汚染
物質の組み合わせの多価ワクチンである。この明細書に
おいて定義されているように、１１　Ｃ１１多糖が実質
的に存在しないとは０．５％より少ない°“Ｃ”多糖を
意味する。この多価ワクチンの調製に対する中心は、こ
のワクチンにおいて使用する１０の型の各々の精製され
た莢膜多糖を調製する方法である。肺炎球菌バクテリア
が適当な発酵法により静止生長相に生長した後、有効量
のナトリウムデオキシコレートの添加してすべてのバク
テリア細胞を溶解しかつ細胞に関連する多糖を媒質中に
解放することにより停止する。細胞の破片を媒質から除
去し、１または２回のアルコール沈殿を行なう。この手
順は、タンパク質を含む汚染物質のきわめて多くを肺炎
球菌多糖類から除去する。

注意して調節したアルコール沈殿は、本発明の方法にお
いてすべての多糖類の精製における主要工程であり、各
多糖をアルコールにより少なくとも５回沈殿させる。こ
れはより過酷なりロロホルムーブタノール抽出を回避す
る。

２つの型のアルコール沈殿を使用する。

第１に、十分なアルコールを試料に添加して多糖類を沈
殿させる。次いで、この沈降物を上澄みから遠心により
分離し、蒸留水中に再溶解させる。

第２の型は、分別アルコール沈殿である。多糖類を沈殿
させない最大量のアルコールを添加する。次いで汚染物
質の沈降物を遠心により除去し、十分量のアルコールを
上澄みへ添加して多糖類を沈殿させる。次いで多糖類の
沈降物を遠心により収穫し、そして多糖類を蒸留水中に
再溶解させる。

両方の型の沈殿の終りにおいて、水中に解しない特定の
物質は多糖ではなく、遠心または濾過により除去される
。

数回のアルコール沈殿を実施した後における、臭化ヘキ
サデシルトリメチルアンモニウム［セタブロン（ｃｅｔ
ａｖｌｏｎ）］の処理は最も有効であり、精製手順にお
ける初期の工程における使用よりも改良されている。

セタブロンは、本発明の肺炎球菌型の大部分にとって、
重要な分離工程である。これらの型において、この工程
は注意して調節された条件下でタンパク質および核酸の
汚染物質よりも優先的に多糖類を沈殿させるか、あるい
は逆に、汚染物質を優先的に沈殿させる。次いで沈殿し
た多糖類を、塩化ナトリウム（通常０．２５）中に可溶
化し。

遠心して、前記塩中に不溶性である汚染する高分子を除
去する。臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウムおよ
び塩の濃度は多糖の精製に最適に変えることができるが
、この手順は沈殿する３、５、ＩＩＡ、１５Ｂ、１７Ｆ
および２２Ｆ型に有効であることが明らかにされた。

４つの型（９Ｖ、１９Ａ、２３Ｆｔｌ：び３３Ｆ）は臭
化ヘキサデシルトリメチルアンモニウムにより沈殿しな
い。これらに４つの型の場合において、臭化ヘキサデシ
ルトリメチルアンモニウムを添加し、そして生ずる沈殿
を遠心分離し、廃棄する。臭化ヘキサデシルトリメチル
アンモニウムはアルコール中に可溶性であるので、引き
統〈アルコール沈殿はそれ以上の多糖の精製および残留
する臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウムの除去の
両者において有効である。この一般的もくろみは、ある
数の肺炎球菌多糖の型に対して変動を伴なって適当な広
い手順である。ＩＯＡ型は、セタブロンの使用により精
製されないといくことにおいて独特である。

セタブロンを効果的に除去するアルコールの処理後、特
定の菌株に対して独特である汚染物質のために異る工程
を組み込むことができる。次いで、肺炎球菌多糖を透析
し、凍結乾燥し、そして−２０℃以下において乾燥粉末
として貯蔵することができる。

ワクチンは、防腐剤を含有する適当な緩衝液、例えば、
リン酸塩緩衝液中に多糖類を溶解し、次いで減菌濾過す
ることによってつくることができる。

肺炎球菌多糖の普通の精製法は、次のように要約するこ
とができる： デオキシコレートにより溶解された培養物↓ ２回の分別アルコール沈殿 ↓ セタブロン処理 ↓ ３回のアルコール沈殿 ↓ 活性炭 ↓ 透析 裁 ↓　１ 凍結乾燥 本発明の目的は、“Ｃ”多糖汚染が実質的に存在しない
、ｌ、２．３．４．５，６Ｂ、７Ｆ。

８、９Ｎ、　９Ｖ、ＩＯＡ、ＩＩＡ、１２Ｆ、１４、１
５Ｂ、１７Ｆ、　１８Ｃ１１９Ａ、　１９Ｆ。

２０．２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆ型と、６Ａおよび２
５型のＯ〜１つまたは両者についての、高度に精製され
た効果的に免疫原性の多価肺炎球菌多糖ワクチンを提供
することである。

本発明の特定の目的は、°“Ｃ”′多糖汚染が実質的に
存在しない、ｌ、？、３．４．５．６Ｂ、７Ｆ、８．９
Ｎ、９Ｖ、ＩＯＡ、ＩＩＡ、１２Ｆ、１４．１５Ｂ、１
７Ｆ、１８Ｃ，１９Ａ、１９Ｆ、２０．２２Ｆ、２３Ｆ
および３３Ｆ５と、６Ａおよび２５型の０−１つまたは
両者についての、高度に免疫原性の肺炎球菌多糖ワクチ
ンを提供することである。

本発明の他の目的は、３．５．９■、ＩＩＡ、１５Ｂ、
１７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆおよび３３Ｆ型肺炎球菌の免疫
学的に活性な莢膜多糖を精製するりｉ汁を視（其するこ
）−〒ある一 ゛Ｃ”多糖が存在しない有効な多価肺炎球菌ワクチンは
、０．０１％のシメロサル（ｔｈｅｍｅｒ　ｏ　ｓ　ａ
　１）の十分に凍結乾燥された免疫学的に活性な肺炎球
菌多糖を含有する０、１モルのリン酸塩緩衝剤の溶液に
添加して、約ｌＯＯミクログラム／　ｍ　ｌ　／型の最
終濃度を生成させることによって調製することができる
。免疫を提供するための多糖の精確な濃度が肺炎球菌の
型および免疫化すべき個体の両者とともに変動するので
、これは一般に有効量である。

この混合物を約４℃において約４時間かきまぜ、滅菌濾
過する。１つの実施態様において、１．２．３．４．５
．６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８．９Ｎ、９Ｖ、ＩＯＡ、ＩＩＡ
、１２Ｆ、１４．１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ，１９Ａ、１
９Ｆ、２０．２２Ｆ、２３Ｆ、２５および３３Ｆ型の凍
結乾燥された肺炎球菌多糖の各々の１．０ｍｇを０．０
１％のシメロサルを含有する０、１モルのリン酸塩緩衝
液と一緒にして１Ｏｃｃの最終体積とし、約４℃におい
て約４時間かきまぜる。４．７Ｆ、および１４型を”Ｃ
１１多糖を本質的に含まず（０゜５％より少ない存在す
る°“ＣＩＩ多糖）かつ有効な免疫原性を示す状態で添
加する。

好ましい実施態様において、上の手順を利用するが、２
３の肺炎球菌型のみを使用する。これらの型は１．２．
３．４４５．６Ｂ、７Ｆ、８．９Ｎ、９Ｖ、ＩＯＡ、Ｉ
ＩＡ、１２Ｆ、１４，１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ１１９Ａ
、１９Ｆ、２０．２２Ｆ、２３Ｆ、２５および３３Ｆ型
である。自然状態の立体配置を損失せず、それゆえ有効
免疫原性を損失せずに、利用する各肺炎球菌型を精製す
ることは、上の有効な多価ワクチンの調製に対して重要
である。後の実施例において、ｌＯは特定の炎球菌型か
ら純粋な免疫学的に活性な多糖を得る特定の方法を例示
する。これらの型は温血動物における特定の免疫原の応
答を生じさせるために利用することができ、あるいは多
価ワクチンとして組み合わせで利用することができる。

前述の２種類の多価ワクチンは、本発明の２５の精製さ
れた肺炎球菌莢膜多糖類を全体的にあるいは部分的に利
用して調製されうる多価ワクチンの多くの組み合わせを
単なる例示として理解されるであろう。

これらの実施例は１次の順序で配置される二火差潰　−
Ｌとたヨ」Ｌ　−乙配Ｕ詠Ｊ二１　３　３ ２　５　５ ３　９Ｖ　６８ ４　１０Ａ　３４ ５　１１Ａ　４３ ６　１５Ｂ　５４ ７　１７Ｆ　１７ ８　１９Ａ　５７ ９　２２Ｆ　２２ １０　３３Ｆ　７０ デンマ一ク表示により１．２，４．８，１２Ｆ、２５．
６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｎ、１４．１９Ｆ、２０．２３Ｆ
および１８ｃ型である炎球菌型は、引用によってここに
加える、米国特許第４゜２４２．５０１号に記載されて
いるように調製することができる。

３００〜５００１の培地を使用して、３型肺炎球菌をこ
のよな肺炎球菌の生長の適する条件下で生長させて静止
相に到達させる。次いでバクテリアを適当な溶解剤（ｌ
ｙｓａｎｔ）、ここではナトリウムデオキシコレートの
１０％の滅菌濾過した溶液の添加により溶解する。他の
洗剤のような多くの溶解法および音波の破裂のような機
械的方法およびフランス（Ｆ　ｒ　ｅ　ｎ　ｃ　ｈ）圧
力細胞を使用することができる。すべては本発明の方法
において完全に同等の材料を生成するであろう。ナトリ
ウムデオキシコレートを使用するとき、適当な溶解濃度
は約（ｍｌ−０，２％であることがわかった。すべての
バクテリア細胞を溶解して、細胞に関連する多糖を培地
中に解放する。濁った培地を遠心により清浄にする。こ
こで、１６ｆ１１シヤープレス（Ｓ　ｈ　ａ　ｒ　ｐ　
ｌ　ｅ　ｓ）遠心機を１６．００Ｏｒｐｍおよび３６〜
４０Ｍ／時の流速で使用すると同時に約２〜ｌＯ°Ｃの
温度を維持した。このようにして集められた細胞の破片
（ｄｅｂｒｉｓ）を廃棄する。多糖を含む上澄みをｐＨ
約６．６に調節する。これらの実施例において、ＰＨの
調節は通常８モルの酢酸の添加により達成された。予備
工程において表示された精確なｐＨ値は一般的なもので
あり、好ましいモードを指示するだけであることに注意
すべきである。有用なＰＨ範囲は、すべての炎球菌型と
ともに広く変動することを理解すべきである。セタブロ
ンを利用する沈殿工程のみは、高度に特定のＰＨの観測
を必要とする。同様に、酢酸は１種の酸性化剤の単なる
例示である。酢酸は付随する緩衝作用をもつ酢酸ナトリ
ウムの使用を可能とするが、他の酸類、塩基類および緩
衝剤類の他のｐＨ調節系は当業者にとって明らかであろ
う。上の手順により、本発明の精製法のための原料の多
糖懸濁液が調製される。

原料の多糖上澄みに、酢酸ナトリウムを上澄みおよびア
ルコールに対して約４％の最終濃度に添加する。ＰＨを
約６．７に、好ましいモードにおいて、±０．１に８モ
ルの酢酸で調節する。アルコールをＯ，ｔＳ〜０．５容
量、好ましくは０゜２５容量で、２〜６℃の温度におい
てかきまぜながらゆっくり添加する。ｐＨを約７．０に
、好ましいモードにおいて、±０．１に８モルの酢酸で
調節する。多糖の沈殿はゆっくり形成し、この混合物を
一夜約１６〜２０時間静置し、そして遠心する。肺゛炎
球菌多糖類は不安定化する傾向があり、それらは低温に
おいて取扱われ、こうして１６〜２０時間の期間の間、
多糖の沈殿を冷時に、ここでは約４℃に保持すべきであ
る。多糖の沈殿は、かきなぜながら、十分な量、通常約
１００文の、４％の酢酸ナトリウム溶液中に溶解し、低
温、約４℃は好ましい、ブレンダー内の短時間の機械的
かきまぜ（４〜６秒）はこの溶解を促進する。濁りが存
在するとき、この溶液を低温、約２〜６℃および約１６
〜１８ＪＬ／時の流速において、濾過または遠心により
清浄化することができる。

（Ｂ）第１１」≦し二配沈尉 これは第１アルコール分別沈殿におけるように、上で形
成した多糖含有上澄みを、ｐＨ約６゜６に８モルの酢酸
で調節し１．好ましいモードにおいて±０．１に達成す
る。酢酸ナトリウムを約４％の最終濃度に添加し、そし
てＰＨを約６．７に調節し、そして±０．１は上のよう
に好ましい。

約０．２５〜０．６容量、好ましい実施態様にお　（い
て０．４容量のアルコールを添加し、ｐＨ７に調節し、
第１アルコール沈殿において前述のように処理し、かき
まぜなたら冷却し、ｐＨを調節し、静置し、そして濾過
または遠心により清浄化する。このように除去された多
糖沈殿を５０文の水中に再溶解し、そして水を凍結乾燥
により除去する。乾燥粉末を２００１の水中に再溶解し
、遠心して濁りを除去する。ＣＰＸ　ＩＯｃおよびＣＰ
Ｘ　７０Ｃパツド（ＡＭＦ　ＣＵＮＯ）ｔたは同等物を
装填したナイアグラ（Ｎｉａｇｒａ）フィルタープレス
を使用して、上澄みを濾過する。部分的に精製された多
糖上澄み流体流体をＰＨ約６．６に、好ましいモードに
おいて±０゜１に調節する。多糖を完全に沈殿させるた
めに、酢酸ナトリウムを約４％の最終濃度に添加し、そ
してｐＨを第１アルコール沈殿において記載したように
約６．７に、好ましいモードにおいて±０．１に調節し
、そして約０．１〜０．５容量のアルコールを好ましい
実施態様において０．５容量の最終最小濃度に添加し、
そしてｐＨを７に調節する０次いで、静置し、第１アル
コール沈殿におけるように、沈殿し、遠心し、再び約２
００文の冷ピロゲン不合水中に、好ましい実施態様にお
いて約４℃において再溶解する。

次いで多糖溶液を室温（２１〜２５℃）に加温し、そし
てｐＨを約７．４±０．１に炭酸ナトリウム溶液で調節
する。０．４％の炭酸ナトリウムの濃度は、この調節溶
液に便利であることがわかった。

かきまぜながら、セタブロンの１０％の溶液を０．１〜
０，５容量％：好ましくは０．３容量％にゆっくり添加
する。沈殿が形成するまで、ここで約９０分間、静置し
、この混合物を約４℃に再冷却し、そして沈殿を遠心に
より除去する。６〜８文／時の流速および７〜１４°Ｃ
の温度を好ましい実施態様において使用するが、これら
の範囲は一般的である。この手順を用いると、３型肺炎
球菌多糖は多少の不純物とともにセタズロンによす沈殿
する。濁った懸濁液を濾過または遠心し、冷却し、ここ
で６〜７文／時の流速および７〜１２℃の温度を使用す
る。多糖はここで溶液中に存在し、一方核酸および他の
不純物を廃棄可能な遠心沈降物である。この手順は、ア
ルコール沈殿後に残留する核酸およびタンパク質不純物
の大部分を除去する。

次いで多糖を再沈殿させ、上澄みをＰＨ約６゜６に調節
し、そして酢酸ナトリウムを約４％に添加する。次いで
ｐＨを約６．７に上昇させ、約０．５０容量のアルコー
ルを添加し、そしてＰＨを７に約４℃において１６〜２
０時間調節し、多糖を再び遠心し、多糖をピロゲン不合
水中に再溶解し、約４０文は適当である。この手順をさ
らに２回反復して多糖をさらに精製し、痕跡量のセタブ
ロンを除去し、最後の沈殿を約２０１の水中に再溶解す
る。

この明細書を通じて、セタブロンの濃度は１０％の溶液
に基づく％の値で表わす。セタブロン溶液の濃度の変更
は、同等の最終濃度に到達させるために添加するこのよ
うな溶液の量を相応して変更することを理解すべきであ
る。

（Ｄ）　面庄皮り精１ 次いで、多糖溶液を、まだ冷たい間、ｐＨを約６．１に
調節し、そして塩化ナトリウムを０．１５モルの濃度に
する。活性炭の２０％懸濁液をかきまぜながら添加して
、３〜７％、好ましくは５％の活性炭の濃度にする。こ
の混合物を、約４°Ｃに約３０分間冷却静置する。この
混合物を濾過して活性炭を除去し、さらにｌ系列の遠心
機および／または膜フィルターに通過させることにより
清浄化する。好ましい実施態様において、ｃｐｘ−１Ｑ
Ｃ（ＡＭＦ−ＣＵＮＯ）フィルターを使用し１次いで１
．２．０．６５．０．４５および０．２２ｕミリポア（
Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）膜を使用する。この手順の間、２
６０　ｍ　ｕにおける光学濃度を核酸濃度についての対
照標準として使用することができ、そしてＬｏｗｒｙ、
ｅｔａｌ、の方法を使用してタンパク質含量を監視する
ことができる。

得られた濾液を、室温、はぼ２１〜２５℃に加温した後
、透析する。ここで、１０，０００の分子酸のカットオ
フ（ｃｕｔ　ｏｆｆ）の中空繊維のカートリッジを含有
するＤＣ３０型アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）装置を使用し
、すべての残留す゛　る塩化ナトリウムを除去した。次
いで、透析濾過液（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｅ）を急速凍
結し、そして凍結乾燥して精製された肺炎球菌多糖粉末
。

ここで３型、が残る。この粉末を低い湿度においてびん
中に収穫し、次いでこれを密封し、冷時に貯蔵する。−
２０℃以下が適当であることがわかった。

上の方法は汚染物質のタンパク質および核酸の９９％よ
り多くを除去すると同時に、生成物の免疫原性を保持し
た。

明細書を通じて、活性炭の濃度は２０％の活性炭懸濁液
に基づく容量％で表わす。このような懸濁液の濃度の変
更は、同等の最終濃度に到達させるために必要とするこ
のような懸濁液の量に相応して変更することを理解すべ
きである。

原料の多糖は、３型について実施例１に記載した方法に
おけるようにして、５型発酵肉汁のリゼイトから調製す
る。

原料の多糖上澄みに、酢酸ナトリウムを上澄みおよびア
ルコールに対して約４％の最終濃度に添加する。ｐＨを
約６．７に、好ましいモードにおいて、±０．１に８モ
ルの酢酸で調節する。アルコールを０．２５〜０．８容
量、好ましくは０゜５容量で、２〜６℃の温度において
かきまぜながらゆっくり添加する。ｐＨを約７．０に、
好ましいモードにおいて、±ｏ、ｌに８モルの酢酸で調
節する。沈殿はゆっくり形成し、この混合物を一夜約１
６〜２０時間静置する。肺炎球菌多糖類は不安定化する
傾向があり、それらは低温において最もよく取扱われる
。こうして１６〜２０時間の期間の間、多糖の沈殿を冷
時に、ここでは約４℃に保持すべきである。前述の分別
の方法は、肺炎球菌多糖の精製におけるアルコール沈殿
工程の標準である。上の方法の他の型についての変動は
、アルコールの容量および特定の型に使用する工程の順
序に主として依存するが、それらに限定されない。沈殿
した汚染物質は、遠心により、約１６〜２０文／時の波
速および低温、好ましくは約２〜約６°Ｃの温度におい
て均一　に排除されるであろう。

部分的に精製された多糖を含有する上澄みは、ＰＨ約６
．６に上のように調節し、次の工程のアルコールを添加
するときの最終体積に対して４％の最終濃度に酢酸ナト
リウムを添加し、次いでｐＨを約６．７に調節する。５
型について、アルコールを最小的０．９〜１．４容量に
添加し、そしてＰＨを７に調節する。５型では、好まし
い最終アルコール濃度は合計の多糖沈殿について約１．
２５容量を超えなくてはならない。

次いで、混合物を、第１アルコール分別沈殿におけるよ
うに低温において匹敵する時間の間装置し、同様に遠心
するが、これはこの工程において沈殿した多糖である。

多糖の沈殿は、かきなぜながら、十分な量、通常約４０
文の水中に溶解し、低温、約４℃は好ましい。濁りが存
在するとき、この溶液を低温、約２〜６℃において、濾
過または遠心により清浄化することができる。

（Ｂ）　２）■アルコール これは第１アルコール分別沈殿におけるように、上で形
成した多糖含有上澄みを、ｐＨ約６゜６に８モルの酢酸
で調節し、好ましいモードにおｔｚ％−１（ｆ：°°”
［ｍ＊ｔ６・＃＃＋　）　！Ｊ−２”１４　１％の最終
濃度に添加し、そしてＰＨを約６．７に調節し、そして
±０．１は上のように好ましい。

約０．２５〜０．８０容量、好ましい実施態様において
０．５容量のアルコールを添加し、ｐＨ７に調節し、第
１分別アルコール沈殿において前述のように処理し、か
きまぜなたら冷却し、ｐＨを調節し、静置し、そして濾
過または遠心により清節化する。このように除去された
沈殿、部分的に精製された多糖上澄み流体をｐＨ約６．
６に、好ましいモードにおいて±０．１に調節する。多
糖な完全に沈殿させるために、酢酸ナトリウムを約４％
の最終濃度に添加し、そしてｐＨを第１分別アルコール
沈殿において記載したように約６．７に、好ましいモー
ドにおいて±０．１に調節する。約０．９〜１．４容量
のアルコールを好ましい実施態様において１．２５容量
の最終最小濃度に添加し、そしてｐＨを７に調節する。

次いで、静置し、第１分別アルコール沈殿におけるよう
に、沈殿し、遠心し、再び約４０文の冷ピロゲン不合水
中に、好ましい実施態様において約４℃において再溶解
する。

（Ｃ）　、ヒヘキサデシルトリメチルアンモ二次いで多
糖溶液を室温（２１〜２５℃）に加温し、モしてｐＨを
約７．４±０．１に炭酸ナトリウム溶液で調節する。０
．４％の炭醸ナトリウムｔ：ｒ４度は、この調節溶液に
便利であることがわかった。

かきまぜながら、セタブロンの１０％の溶液をｔ、ｏ〜
５．０容量％、好ましくは２．００容量％にゆっくり添
力Ｕする。沈殿が形成するまで、ここで約９０分間、静
置し、この混合物を約４℃に再冷却し、そして沈殿を遠
心により除去する。６〜８文／時の流速および７〜１４
°Ｃの温度を好ましい実施態様において使用するが、こ
れらの範囲は一般的である。この手順を用いると、５型
肺炎球菌多糖は多少の不純物とともにセタブロンにより
沈殿する。濁った懸濁液を濾過または遠心し、冷却し、
ここで６〜７見／時の流速および７〜１２℃の温度を使
用する。多糖はここで溶液中に存在し、一方核酸および
他の不純物を廃棄可能な遠心沈降物である。この手順は
、アルコール分別後に残留する核酸およびタンパク質不
純物の大部分を除去する。

次いで多糖を再沈殿させ、上澄みをｐＨ約６゜６に調節
し、そして酢酸ナトリウムを約４％に添加する。次いで
ｐＨを約６６７に上昇させ、約１．２５容量のアルコー
ルを添加し、そしてｐＨを７に約４℃において１６〜２
０時間調節し、多糖を再び遠心し、多糖をピロゲン不合
水中に再溶解し、約４０Ｊｌは適当である。この手順を
さらに２回反復して多糖をさらに精製し、痕跡量のセタ
ブロンを除去し、最後の沈殿を約２０文の水中に再溶解
する。

（Ｄ）　面比炭辺趙１ 次いで、多糖溶液を、まだ冷たい間、ｐＨを約６．１に
調節し、そして塩化ナトリウムを０．１５モルの濃度に
する。活性炭の２０％懸濁液をかきまぜながら添加して
、２〜７％、好ましくは５％の活性炭の濃度にする。こ
の混合物を、約４℃に約３０分間冷却静置する。この混
合物を濾過して活性炭を除去し、さらにｌ系列のフィル
ターパッドまたは膜に通過させることにより清浄化する
。好ましい実施態様において、ＣＰＸ−１０ｃ（ＡＭＦ
−ＣＵＮＯ）フィルターを使用し、次いテｌ　、　２．
０．６５．０．４５および０．２２ｕミリボア（Ｍｉ　
ｌ　ｌ　ｉ　ｐ　ｏ　ｒ　ｅ）　（２９３ｍｍ）膜を使
用する。この手順の間、２６０ｍｕにおける光学濃度を
核酸濃度についての対照標準として使用することができ
、そしてＬｏｗｒｙ　、ｅ　ｔａｌ、の方法を使用して
タンパク質含量を監視することができる。

得られた濾液な、室温、はぼ２１〜２５℃に加温した後
、透析濾過（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉ。

ｎ）する、ここで、１０，０００の分子量のカットオフ
の中空繊維のカートリッジを含有するＤＣ３０型アミコ
ン装置を使用し、すべての残留する塩化ナトリウムを除
去した０次いで、透析濾過液を急速凍結し、そして凍結
乾燥して精製された肺炎球菌多糖粉末、ここで５型、が
残る。この粉末を低い湿度においてびん中に収穫し、次
いでこれを密封し、冷時に貯蔵する。−２０℃以下が適
当であることがわかった。

上の方法は汚染物質のタンパク質の９０％より多くおよ
び汚染物質の核酸の９９％より多くを除去すると同時に
、生成物の免疫原性を保持した。

原料の多糖は、３型について実施例１に記載した方法に
おけるようにして、９■型発酵肉汁のリゼイトから調製
する。

原料の多糖上澄みに、酢酸ナトリウムを上澄みおよびア
ルコールに対して約４％の最終濃度に添加する。ｐＨを
約６．７に、好ましいモードにおいて、±０．１に８モ
ルの酢酸で調節する。アルコールを０．２５〜０．８容
量、好ましくは０゜５容量で、２〜６℃の温度において
かきまぜながらゆっくり添加する。ｐＨを約７．０に、
好ましいモードにおいて、±０．１に８モルの酢酸で調
節する。沈殿はゆっくり形成し、この混合物を一夜約１
６〜２０時間静置する。肺炎球菌多糖類は不安定化する
傾向があり、それらは低温において最もよく取扱われる
。こうして１６〜２０時間の期間の間、多糖の沈殿を冷
時に、ここでは約４℃に保持すべきである。前述の分別
の方法は、肺炎球菌多糖の精製におけるアルコール沈殿
工程の標準である。上の方法の他の型についての変動は
、アルコールの容量および特定の型に使用する工程の順
序に主として依存するが、それらに限定されない。沈殿
した汚染物質は、遠心により、約１６〜２０又／時の流
速および低温、好ましくは約２〜約６℃の温度において
均一に排除されるであろ部分的に精製された多糖を含有
する上澄みは、ｐＨ約６．６に上のように調節し、次の
工程のアルコールを添加するときの最終体積に対して４
％の最終濃度に酢酸ナトリウムを添加し、次いでｐＨを
約６．７に調節する。９■型について、アルコールを最
小的１．２５〜２．２５容量に添加し、そしてｐＨを７
に調節する。９■型では、好ましい最終アルコール濃度
は合計の多糖沈殿について約１．７５容量を超えなくて
はならない。

次いで、混合物を、第１アルコール分別沈殿におけるよ
うに低温において匹敵する時間の間装置し、同様に遠心
するが、これはこの工程において沈殿した多糖である。

多糖の沈殿は、かきなぜながら、十分な量、通常約４０
文の水中に溶解し、低温、約４℃は好ましい。濁りが見
えるとき、この溶液を低温４約２〜６℃および約６〜７
ｆｌ／時において、濾過または遠心により清浄化するこ
とができる。

（Ｂ）　−Ｊ２　ｌアルコール これは第１アルコール分別沈殿におけるように、−ヒで
形成した多糖含有上澄みを、ｐＨ約６゜６に８モルの酢
酸で調節し、好ましいモードにおいて±０．１に達成す
る。酢酸ナトリウムを約４％の最終濃度に添加し、モし
てｐＨを約６．７に調節し、そして±０．１は上のよう
に好ましい。

約０．１５〜０．３５容量、好ましい実施態様において
０．２５容量のアルコールを添加し、ＰＨ７に調節し、
第１分別アルコール沈殿において前述のように処理し、
かきまぜなたら冷却し、ＰＨを調節し、静置し、モして
直通または遠心により清浄化する。このように除去され
た沈殿、部分的に精製された多糖上澄み流体をｐＨ約６
．６に、好ましいモードにおいて±０．１に調節する。

多糖を完全に沈殿させるために、酢酸ナトリウムを約４
％の最終濃度に添加し、そしてＰＨをｔｊ４ｉ分　１１ 別アルコール沈殿において記載したように約６゜７に、
好ましいモードにおいて±０．１に調節する。約１．２
５〜２．２５容量のアルコールを好ましい実施態様にお
いて１．７５容量の最終最小濃度に添加し、そしてｐＨ
を７に調節する・次いで、静置し、第１分別アルコール
沈殿におけるように、沈殿し、遠心し、再び約４０文の
冷ビロゲン不合水中に、好ましい実施態様において約４
℃において再溶解する。

次いで多糖溶液を室温（２１〜２５℃）に加温し、そし
てｐＨを約７．４±０．１に炭酸ナトリウム溶液で調節
する。０．４％の炭酸ナトリウムの濃度は、この調節溶
液に便利であることがわかった。

塩化ナトリウムを０．１５モルに添加し、かきまぜなが
ら、セタブロンの１０％の溶液を０．０５〜１．０容量
％、好ましくは０．２容量％にゆっくり添加する。沈殿
が形成するまで、ここで約９０分間、静置し、この混合
物を約４℃に再冷却し、そして沈殿を遠心により除去す
る。６〜８交／時の流速および７〜１４℃の温度を好ま
しい実施態様において使用するが、これらの範囲は一般
的である。この手順を用いると、９ｖ型肺炎球菌多糖は
セタブロンにより沈殿しない。沈殿を廃棄する。多糖は
ここで溶液中に存在し、一方核酸および他の不純物を廃
棄可能な遠心沈降物である。この手順は、アルコール分
別後に残留する核酸およびタンパク質不純物の大部分を
除去する。

次いで多糖を含有する上澄みを再沈殿させ、上澄みをｐ
Ｈ約６．６に調節し、そして酢酸ナトリウムを約４％に
添加する。次いでｐＨを約６．７に上昇させ、約１．７
５容量のアルコールを添加し、そしてｐＨを７に約４℃
において１６〜２０時間調節し、多糖を再び遠心し、多
糖をピロゲン不合水中に再溶解し、約４０文は適当であ
る。この手順をさらに２回反復して多糖をさらに精製し
、痕跡量のセタブロンを除去し、最後の沈殿を約２０１
の水中に再溶解する。

（Ｄ）　危比皮辺趙１ 次いで、多糖溶液を、まだ冷たい間、ｐＨを約６．１に
調節し、そして塩化ナトリウムを０．１５モルの濃度に
する。活性炭の２０％懸濁液をかきまぜながら添加して
、２〜７％、好ましくは５％の活性炭の濃度にする。こ
の混合物を、約４°Ｃに約３０分間冷却静置する。この
混合物を濾過して活性炭を除去し、さらに１系列のフィ
ルターパッドまたは膜に通過させることにより清浄化す
る。好ましい実施態様において、ＣＰＸ−１０Ｃ（ＡＭ
Ｆ−ＣＵＮＯ）フィルターを使用し、次いで１．２．０
．６５．０．４５および０．２２ｕミリポア（２９３ｍ
ｍ）膜を使用する。この手順の間、２６０　ｍ　ｕにお
ける光学濃度を核酸濃度についての対照標準として使用
することができ、そしてＬｏｗｒｙ、ｅｔ　ａｌ、（７
）方法を使用してタンパク質含量を監視することができ
る。

得られた濾液を、室温、はぼ２１〜２５℃に加温した後
、透析濾過する。ここで、ｉｏ、ｏｏ。

の分子量のカットオフの中空繊維のカートリッジを含有
するＤＣ３０型アミコン装置を使用し、すべての残留す
る塩化ナトリウムを除去した。次いで、透析濾過液を急
速凍結し、そして凍結乾燥して精製された肺炎球菌多糖
粉末、ここで９■型、が残る。この粉末を低い湿度にお
いてびん中に収穫し、次いでこれを密封し、冷時に貯蔵
するわ一２０℃以下が適当であることがわかった。

上の方法は汚染物質のタンパク質および核酸の９９％よ
り多くを除去すると同時に、生成物の免疫原性を保持し
た。

原料の多糖は、３型について実施例１に記載した方法に
おけるようにして、ＩＯＡ型発酵肉汁のリゼイトから調
製する。

の゛　：ｌＯＡノ （Ａ）、１）１アルコール 原料の多糖上澄みに、酢酸ナトリウムを上澄みおよびア
ルコールに対して約４％の最終濃度に添加する。ｐＨを
約６．７に、好ましいモードにおいて、±０．１に８モ
ルの酢酸で調節する。アルコールを０．２５〜０．８容
量、好ましくは０゜５容量で、２〜６℃の温度において
かきまぜながらゆっくり添加する。ＰＨを約７．０に、
好ましいモードにおいて、±０．１に８モルの酢酸で調
節する。沈殿はゆっくり形成し、この混合物を一夜約１
６〜２０時間静置する。肺炎球菌多糖類は不安定化する
傾向があり、それらは低温において最もよく取扱われる
。こうして１６〜２０時間の期間の間、多糖の沈殿を冷
時に、ここでは約４℃に保持すべきである。前述の分別
の方法は、肺炎球菌多糖の精製におけるアルコール沈殿
工程の標準である。上の方法の他の型についての変動は
、アルコールの容量および特定の型に使用する工程の順
序に主として依存するが、それらに限定されない。沈殿
した汚染物質は、遠心により、約１６〜２０立／時の流
速および低温、好ましくは約２〜約６℃の温度において
均一に排除されるであろう。

部分的に精製された多糖を含有する上澄みは、ｐＨ約６
．６に上のように調節し、次の工程のアルコールを添加
するときの最終体積に対して４％の最終濃度に酢酸ナト
リウムを添加し、次いでｐＨを約６．７に調節する。Ｉ
ＯＡ型について、アルコールを最小的１．０〜１．５容
量に添加し、そしてｐＨを７に調節する。ＩＯＡ型では
、好ましい最終アルコール濃度は合計の多糖沈殿につい
て約１．５０容量を超えなくてはならない。

次いで、混合物を、第１アルコール分別沈殿におけるよ
うに低温において匹敵する時間の間装置し、同様に遠心
するが、これはこの工程において沈殿した多糖である。

多糖の沈殿は、かきなぜながら、十分な量、通常的４０
５Ｌの水中に溶解し、低温、約４℃は好ましい。濁りが
見えるとき、この溶液を低温、約２〜６℃および約６〜
７交／時において、濾過または遠心により清浄化するこ
とができる。

（Ｂ）　Ｊ２　１アルコール゛ これは第１アルコール分別沈殿におけるように、上で形
成した多糖含有上澄みを、ｐＨ約６゜６に８モルの酢酸
で調節し、好ましいモードにおいて±０．１に達成する
。酢酸ナトリウムを約４％の最終濃度に添加し、そして
ＰＨを約６．７に調節し、そして±０．１は上のように
好ましい。

約０，２５〜０．８容量、好ましい実施態様において０
．５容量のアルコールを添加し、ＰＨ７に調節し、第１
分別アルコール沈殿において前述のように処理し、かき
まぜなたら冷却し、ｐＨを調節し、静置し、そして濾過
または遠心により清浄化する。このように除去された沈
殿１部分的に精製された多糖上澄み流体をｐＨ約６．６
に、好ましいモードにおいて±０．１に調節する。多糖
を完全に沈殿させるために、酢酸ナトリウムを約４％の
最終濃度に添加し、そしてｐＨを第１分別アルコール沈
殿において記載したように約６．７に、好ましいモード
において±０．１に調節する。約１．０〜２．０容量の
アルコールを好ましい実施態様において１．５容量の最
終最小濃度に添加し、そしてｐＨを７に調節する。次い
で、静置し、第１分別アルコール沈殿におけるように、
沈殿し、遠心し、再び約４０文の冷ビロゲン不合水中に
、好ましい実施態様において約４℃において再溶解する
。

次いで多糖を再沈殿させ、上澄みをＰＨ約６゜６に調節
し、そして酢酸ナトリウムを約４％に松属する。次いで
ｐＨを約６．７に１昇させ、約１．５容量のアルコール
を添加し、そしてｐＨを７に約４℃において１６〜２０
時間調節し、多糖を再び遠心し・多糖をピ０ゲ′不含水
中１再溶解　ｊし、約２０又は適当である。

（Ｃ）　固性炭五趙１ 次いで、多糖溶液を、まだ冷たい間、ｐＨを約６．１に
調節し、そして塩化ナトリウムを０．１５モルの濃度に
する。活性炭の２０％懸濁液をかきまぜながら添加して
、２〜７％、好ましくは５％の活性炭の濃度にする。こ
の混合物を、約４℃に約３０分間冷却静置する。この混
合物を濾過して活性炭を除去し、さらに１系列のフィル
ターパッドまたは膜に通過させることにより清浄化する
。好ましい実施態様において、ＣＰＸ−１０Ｃ（ＡＭＦ
−ＣＵＮＯ）フィルターを使用し、次いで１．２．０．
６５．０．４５および０．２２ｕミリボア（２９３ｍｍ
）膜を使用する。この手順の間、２６０ｍｕにおける光
学濃度を核酸濃度についての対照標準として使用するこ
とができ、そしてＬｏｗｒｙ、ｅｔ　ａｌ、（７）方法
を使用してタンパク質含量を監視することができる。

得られた濾液を、室温、はぼ２１〜２５℃に加温した後
、透析濾過する。ここで、１０，０００の分子量のカー
／　）オフの中空繊維のカートリッジを含有するＤＣ３
０型アミコン装置を使用し、すべての残留する塩化ナト
リウムを除去した。次いで、透析濾過液を急速凍結し、
そして凍結乾燥して精製された舖炎球菌多糖粉末、ここ
でＩＯＡ型、が残る。この粉末を低い湿度においてびん
中に収穫し、次いでこれを密封し、冷時に貯蔵する。−
２０℃以下が適当であることがわかった。

上の方法は汚染物質のタンパク質の９９％より多くおよ
び汚染物質の核酸の９０％より多くを除去すると同時に
、生成物の免疫原性を保持した。

原料の多糖は、３型について実施例１に記載した方法に
おけるようにして、１１Ａ型発酵肉汁のリゼイトから調
製する。

の　Ｊ （Ａ）　ｌ　１アルコール 原料の多糖上澄みに、酢酸ナトリウムを上澄みおよびア
ルコールに対して約４％の最終濃度に添加する。ＰＨを
約６．７に、好ましいモードにおいて、±０．１に８モ
ルの酢酸で調節する。アルコールを０．７５〜１．２５
容量、好ましくは１．０容量で、２〜６℃の温度におい
てかきまぜながらゆっくり添加する。ｐＨを約７．０に
、好ましいモードにおいて、±０．１に８モルの酢酸で
調節する。沈殿はゆっくり形成し、この混合物を一夜約
１６〜２０時間静置する。肺炎球菌多糖類は不安定化す
る傾向があり、それらは低温において最もよく取扱われ
る。こうして１６〜２０時間の期間の間、多糖の沈殿を
冷時に、ここでは約４℃に保持すべきである。前述の分
別の方法は、肺炎球菌多糖の精製におけるアルコール沈
殿工程の標準である。上の方法の他の型についての変動
は、アルコールの容量および特定の型に使用する工程の
順序に主として依存するが、それらに限定されない。沈
殿した汚染物質は、遠心により、約１６〜２０又／時の
流速および低温、好ましくは約２〜約６℃の温度におい
て均一に排除されるであろう。

部分的に精製された多糖を含有する上澄みは、ｐＨ約６
．６に上のように調節し、次の工程のアルコールを添加
するときの最終体積に対して４％の最終濃度に酢酸ナト
リウムを添加し、次いでｐＨを約６．７に調節する。Ｉ
ＩＡ型について、アルコールを最小的１．５〜２．２５
容量に添加し、そしてｐＨを７に調節する。ＩＩＡ型で
は、好ましい最終アルコール濃度は合計の多糖沈殿につ
いて約２．０容量を超えなくてはならない。

次いで、混合物を、第１アルコール分別沈殿におけるよ
うに低温において匹敵する時間の間装置し、同様に遠心
するが、これはこの工程において沈殿した多糖である。

多糖の沈殿は、かきなぜながら、十分な量、通常約４０
文の水中に溶解し。

低温、約４℃は好ましい、濁りが見えるとき、この溶液
を低温、約２〜６℃および約６〜７立／時において、濾
過または遠心により清浄化することができる。

（Ｂ）ｌノ　１アルコール これは第１アルコール分別沈殿におけるように、上で形
成した多糖含有上澄みを、ＰＨ約６゜６に８モルの酢酸
で調節し、好ましいモードにおいて±０．１に達成する
。酢酸ナトリウムを約４％の最終濃度に添加し、そして
ｐＨを約６．７に調節し、そして±Ｏ６ｌは上のように
好ましい。

約０．７５〜１．２５容量、好ましい実施態様において
１．００容量のアルコールを添加し、ＰＨ７に調節し、
第１分別アルコール沈殿において前述のように処理し、
かきまぜなたら冷却し、ＰＨを調節し、静置し、そして
濾過または遠心により清浄化する。このように除去され
た沈殿、部分的に精製された多糖上澄み流体をｐＨ約６
．６に、好ましいモードにおいて±０．１に調節する。

多糖を完全に沈殿させるために、酢酸ナトリウムを約４
％の最終濃度に添加し、そしてＰＨを第１分別アルコー
ル沈殿において記載したように約６゜７に、好ましいモ
ードにおいて±０．１に調節する。約１．５０〜２．２
５容量のアルコールを好ましい実施態様において２．０
０容量の最終最小濃度に添加し、そしてＰＨを７に調節
する。次いで、静置し、第１分別アルコール沈殿におけ
るように、沈殿し、遠心し、再び約４０文の冷ピロゲン
不合水中に、好ましい実施態様において約４℃において
再溶解する。

次いで多糖溶液を室温（２１〜２５℃）に加温し、そし
てＰＨを約７．４±０．１に炭酸ナトリウム溶液で調節
する。０．４％の炭酸ナトリウムの濃度は、この調節溶
液に便利であることがわかった。

かきまぜながら、セタブロンの１０％の溶液を１．５〜
５．０容星％、好ましくは３．０容量％にゆっくり添加
する。沈殿が形成するまで、ここで約９０分間、静置し
、この混合物を約４℃に再冷却し、そして沈殿を遠心に
より除去する。６〜８９．７時の流速および７〜１４℃
の温度を好ましい実施態様において使用するが、これら
の範囲は一般的である。この手順を用いると、ＩＩＡ型
肺炎球菌多糖は多少の不純物とともにセタブロンにより
沈殿する。沈殿を４０１の約０．２５モルの塩化ナトリ
ウム中に再溶解し、かきまぜながら、ここで約４°Ｃに
、冷却する。濁った懸濁液を濾過または遠心し、冷却し
、ここで約６〜７！ｌ／時の流速および７〜１２℃の温
度を用いる６多糖はここで溶液中に存在し、一方核酸お
よび他の不純物を廃棄可能な遠心沈降物である。この手
順は、アルコール分別後に残留する核酸およびタンパク
質不純物の大部分を除去する。

次いで多糖を再沈殿させ、上澄みをｐＨ約６゜６に調節
し、そして酢酸ナトリウムを約４％に添加する。次いで
ＰＨを約６．７に上昇させ、約２容量のアルコールを添
加し、モしてｐＨを７に約４°Ｃにおいて１６〜２０時
間調節し、多糖を再び遠心し、多糖をピロゲン不合水中
に再溶解し、約４０９、は適当である。この手順をさら
に２回反復して多糖をさらに精製し、痕跡量のセタブロ
ンを除去し、最後の沈殿を約２０文の水中に再溶解する
。

ＣＤ）　固咀炭五精１ 次いで、多糖溶液を、まだ冷たい間、ｐＨを約６．１に
調節し、そして塩化ナトリウムを０．１５モルの濃度に
する。活性炭の２０％懸濁液をかきまぜながら添加して
、２〜７％、好ましくは５％の活性炭の濃度にする。こ
の混合物を、約４℃に約３０分間冷却静置する。この混
合物を濾過して活性炭を除去し、さらに１系列のフィル
ターパッドまたは膜に通過させることにより清浄化す６
□。い￥１や４３おいア、。１゜−０゜。　］・（ＡＭ
Ｆ−ＣＵＮＯ）フィルターを使用し、次いテｌ　、　２
．０．６５．０．４５および０−２２ｕミリポア（２９
３ｍｍ）膜を使用する。この手順の間、２６０ｍｕにお
ける光学濃度を核酸濃度についての対照標準として使用
することができ、そしてＬｏｗｒｙ、ｅｔ　ａｔ、の方
法を使用してタンパク質含量を監視することができる。

得られた濾液を、室温、はぼ２１〜２５°Ｃに加温した
後、透析濾過する。ここで、ｔｏ、ｏｏ。

の分子量のカットオフの中空繊維のカートリッジを含有
するＤＣ３０型アミコン装置を使用し、すべての残留す
る塩化ナトリウムを除去した。次いで、透析濾過液を急
速凍結し、そして凍結乾燥して精製された肺炎球菌多糖
粉末、ここでＩＩＡ型、が残る。この粉末を低い湿度に
おいてびん中に収穫し、次いでこれを密封し、冷詩に貯
蔵する。−２０℃以下が適当であることがわかった。

上の方法は汚染物質のタンパク質および核酸の９９％よ
り多くを除去すると同時に、生成物の免疫原性を保持し
た。

災墓１Ｊ 原料の多糖は、３型について実施例１に記載した方法に
おけるようにして、１５Ｂ型発酵肉汁のリゼイトから調
製する。

原料の多糖上澄みに、酢酸ナトリウムを上澄みおよびア
ルコールに対して約４％の最終濃度に添加する。ｐＨを
約６．７に、好ましいモードにおいて、±０．１に８モ
ルの酢酸で調節する。アルコールを０．４〜１．０容量
、好ましくは０．７５容量で、２〜６℃の温度において
かきまぜながらゆっくり添加する。ｐＨを約７．０に、
好ましいモードにおいて、±０．１に８モルの酢酸で調
節する。沈殿はゆっくり形成し、この混合物を一夜約１
６〜２０時間静置する。肺炎球菌多糖類は不安定化する
傾向があり、それらは低温において最もよく取扱われる
。こうして１６〜２０時間の期間の間、多糖の沈殿を冷
時に、ここでは約４℃に保持すべきである。前述の分別
の方法は、肺炎球菌多糖の精製におけるアルコール沈殿
工程の標準である。上の方法の他の型についての変動は
、アルコールの容量および特定の型に使用する工程の順
序に主として依存するが、それらに限定されない。沈殿
した汚染物質は、遠心により、約１６〜２０文／時の流
速および低温、好ましくは約２〜約６°Ｃの温度におい
て均一に排除されるであろう。

部分的に精製された多糖を含有する上澄みは、ｐＨ約６
．６に上のように調節し、次の工程のアルコールを添加
するときの最終体積に対して４％の最終濃度に酢酸ナト
リウムを添加し、次いでｐＨを約６，７に調節する。１
５Ｂ型について、アルコールを最小的１．５〜２．２５
容量に添加し、そしてｐＨを７に調節する。１５Ｂ型で
は、好ましい最終アルコール濃度は合計の多糖沈殿につ
いて約１．７５容量を超えなくてはならない。

次いで、混合物を、第１アルコール分別沈殿におけるよ
うに低温において匹敵する時間の間装置し、同様に遠心
するが、これはこの工程において沈殿した多糖である。

多糖の沈殿は、かきなぜながら、十分な量、通常約４０
文の水中に溶解し、低温、約４°Ｃは好ましい。濁りが
見えるとき、この溶液を低温、約２〜６℃および約６〜
７！ｌ／時において、濾過または遠心により清浄化する
ことができる。

（Ｂ）　２／　Ｉアルコール これは第ｌアルコール分別沈殿におけるように、上で形
成した多糖含有上澄みを、ＰＨ約６゜６に８モルの酢酸
で調節し、好ましいモードにおいて±０．１に達成する
。酢酸ナトリウムを約４％の最終濃度に添加し、そして
ｐＨを約６．７に調節し、そして±０．１は上のように
好ましい。

約０．４〜１．０容量、好ましい実施態様において０．
７５容量のアルコールを添加し、ｐＨ７に調節し、第１
分別アルコール沈殿において前述のように処理し、かき
まぜなたら冷却し、ｐＨを調節し、静置し、そして濾過
または遠心により清浄化する。このように除去された沈
殿、部分的に精製された多糖上澄み流体をｐＨ約６．６
に、好ましいモードにおいて±０．１に調節する。多糖
を完全に沈殿させるために、酢酸ナトリウムを約４％の
最終濃度に添加し、そしてＰＨを第１分別アルコール沈
殿において記載したように約６．７に、好ましいモード
において±０．１に調節する。約１．５〜２．２５容量
のアルコールを好ましい実施態様において１．７５容量
の最終最小濃度に隋加し、そしてＰＨを７に調節する。

次いで、静置し、第１分別アルコール沈殿におけるよう
に、沈殿し、遠心し、再び約４０ｆＬの冷ピロゲン不合
水中に、好ましい実施態様において約４℃において再溶
解する。

（Ｃ）　ヒヘキサーシルトリメ　ルアンモニウム　セ　
ブロン　１ 次いで多糖溶液を室温（２１〜２５°Ｃ）に加温し、そ
してｐＨを約７，４±０．１に炭酸ナトリウム溶液で調
節する。０．４％の炭酸ナトリウムの濃度は、この調節
溶液に便利であることがわかった。

かきまぜながら、セタブロンの１０％の溶液を２．０〜
５．０容量％、好ましくは３．０容量％にゆっくり添加
する。沈殿が形成するまで、ここで約９０分間、静置し
、この混合物を約４℃に再冷却し、そして沈殿を遠心に
より除去する。６〜８文／ＩＦ￥＝の流速および７〜１
４℃の温度を好ましい実施態様において使用するが、こ
れらの範囲は一般的である。この手順を用いると、１５
Ｂ型肺炎球菌多糖は多少の不純物とともにセタブロンに
より沈殿する。沈殿を４０文の約０．２５モルの塩化ナ
トリウム中に再溶解し、かきまぜながら、ここで約４°
Ｃに、冷却する。濁った懸濁液を濾過または遠心し、冷
却し、ここで約６〜７文／時の流速および７〜１２℃の
温度を用いる。多糖はここで溶液中に存在し、一方接酸
および他の不純物を廃棄可能な遠心沈降物である。この
手順は、アルコール分別後に残留する核酸およびタンパ
ク質不純物の大部分を除去する。

次いで多糖を再沈殿させ、上澄みをｐＨ約６゜６に調節
し、そして酢酸ナトリウムを約４％に添加する。次いで
ＰＨを約６．７に上昇させ、約ｘ、７Ｆｌｆｆｉのアル
コールを添加し、そしてｐＨを７に約４℃において１６
〜２０時間調節し、多糖を再び遠心し、多糖をピロゲン
不合水中に再溶解し、約４０文は適当である。この手順
をさらに２回反復して多糖をさらに精製し、痕跡量のセ
タブロンを除去し、最後の沈殿を約２０文の水中に再溶
解する。濁りが見えるとき、この溶液を低温、約２〜６
℃および約６〜７５Ｌ／時の流速において濾過または遠
心により清浄することができる。

（Ｄ）　パび 得られた濾液を、室温、はぼ２１〜２５℃に加温した後
、透析濾過する。ここで、１０，０００の分子量のカッ
トオフの中空ｍ＃Ｉのカートリッジを含有するＤＣ３０
型アミコン装置を使用し、すべての残留する塩化ナトリ
ウムを除去した。次いで、透析濾過液を急速凍結し、そ
して凍結乾燥して精製された肺炎球菌多糖粉末、ここで
１５Ｂ型、が残る。この粉末を低い湿度においてびん中
に収穫し、次いでこれを密封し、冷時に貯蔵する。−２
０℃以下が適当であることがわかった。

ｈの方法は汚染物質のタンパク賀の９８％より多くおよ
び汚染物質の核酸の９９％より多くを除去すると同時に
、生成物の免疫原性を保持した。

原料の多糖は、３型について実施例１に記載した方法に
おけるようにして、１７Ｆ型発酵肉汁のリゼイトから調
製する。

原料の多糖上澄みに、酢酸ナトリウムを上澄みおよびア
ルコールに対して約４％の最終濃度に添加する。ＰＨを
約６．７に、好ましいモードにおいて、±０．１に８モ
ルの酢酸で調節する。アルコールを０．２５〜０．７５
容量、好ましくは０．５容量で、２〜６℃の温度におい
てかきまぜながらゆっくり添加する。ｐＨを約７．０に
、好ましいモードにおいて、±０．１に８モルの酢酸で
調節する。沈殿はゆっくり形成し、この混合物を一夜約
１６〜２０時間約４℃において静置する。肺炎球菌多糖
類は不安定化する傾向があり、それらは低温において最
もよく取扱われる。こうして１６〜２０時間の期間の間
、多糖の沈殿を冷時に、ここでは約４℃に保持すべきで
ある。前述の分別の方法は、肺炎球菌多糖の精製におけ
るアルコール沈殿工程の標準である。上の方法の他の型
についての変動は、アルコールの容量および特定の型に
使用する工程の順序に主として依存するが、それらに限
定されない。沈殿した汚染物質は、遠心により、約１６
〜２０文／時の流速および低温、好ましくは約２〜約６
℃の温度において均一に排除されるであろう。

部分的に精製された多糖を含有する上澄みは、ＰＨ約６
．６に上のように調節し、次の工程のアルコールを添加
するときの最終体積に対して４％の最終濃度に酢酸ナト
リウムを添加し、次いでＰＨを約６．７に調節する。１
７Ｆ型について、アルコールを最小的１．０〜１．５容
量に添加し、そしてｐＨを７に調節する。１７Ｆ型では
、好ましい最終アルコール濃度は合計の多糖沈殿につい
て約１．２５容量を超えなくてはならない。

次いで、混合物を、第１アルコール分別沈殿におけるよ
うに低温において匹敵する時間の間静置し、同様に遠心
するが、これはこの工程において沈殿した多糖である。

多糖の沈殿は、かきなぜながら、十分な量、通常約４０
文の水中に溶解し、低温、約４℃は好ましい。濁りが見
えるとき、この溶液を低温、約２〜６℃および約６〜７
２／時において、濾過または遠心により清浄化すること
ができる。

（Ｂ）　２１アルコール゛′ これは第１アルコール分別沈殿におけるように、上で形
成した多糖含有上澄みを、ｐＨ約６゜６に８モルの酢酸
で調節し、好ましいモードにおいて±０．１に達成する
。酢酸ナトリウムを約４％の最終濃度に添加し、そして
ＰＨを約６．７に調節し、そして±０．１は上のように
好ましい。

約０．２５〜０．７５容量、好ましい実施態様において
０．５０容量のアルコールを添加し、ｐＨ７に調節し、
第１分別アルコール沈殿において前述のように処理し、
かきまぜなたら冷却し、ｐＨを調節し、静置し、そして
濾過または遠心により清浄化する。このように除去され
た沈殿、部分的に精製された多糖上澄み流体をＰＨ約６
．６に、好ましいモードにおいて±０．１に調節する。

多糖を完全に沈殿させるために、酢酸ナトリウムを約４
％の最終濃度に添加し、モしてｐＨｆｒ：第１分別アル
コール沈殿において記載したように約６゜７に、好まし
いモードにおいて±０．１に調節する。約１．０〜１．
５容量のアルコールを好ましい実施態様において１．２
５容量の最終最小濃度に添加し、そしてＰＨを７に調節
する。次いで。

静置し、第１分別アルコール沈殿におけるように、沈殿
し、遠心し、再び約４０文の冷ビロゲン不合水中に、好
ましい実施態様において約４°Ｃにおいて再溶解する。

次いで多糖溶液を室温（２１〜２５℃）に加温し、そし
てｐＨを約７．４±０．１に炭酸ナトリウム溶液で調節
する。０．４％の炭酸ナトリウムの濃度は、この調節溶
液に便利であることがわかった。

かきまぜながら、セタブロンの１０％の溶液を２．０〜
５．０容量％、好ましくは３．０容量％にゆっくり添加
する。沈殿が形成するまで、ここで約９０分間、静置し
、この混合物を約４°Ｃに再冷却し、そして沈殿を遠心
により除去する。６〜８文／時の流速および７〜１４°
Ｃの温度を好ましい実施態様において使用するが、これ
らの範囲は一般的である。この手順を用いると、１７Ｆ
型肺炎球菌多糖は多少の不純物とともにセタブロンによ
り沈殿する。沈殿を４０文の約０．２５モルの１ｈ化ナ
トリウム中に再溶解し、かきまぜながら。

ここで約４°Ｃに、冷却する。濁った懸濁液を濾過また
は遠心し、冷却し、ここで約６〜７２／時の流速および
７〜１２℃の温度を用いる。多糖はここで溶液中に存在
し、一方核酸および他の不純物を廃棄可能な遠心沈降物
である。この手順は、アルコール分別後に＠留する核酸
およびタンパク質不純物の大部分を除去する。

次いで多糖を再沈殿させ、上澄みをｐＨ約６゜６に調節
し、そして酢酸ナトリウムを約４％に添加する。次いで
ｐＨを約６．７に上昇させ、約１．２５容量のアルコー
ルを添加し、そしてｐＨを７に約４°Ｃにおいて１６〜
２０時間調節し、多糖を再び遠心し、多糖をピロゲン不
合水中に再溶解し、約４０又は適当である。この手順を
さらに２回反復して多糖をさらに精製し、痕跡量のセタ
ブロンを除去し、最後の沈殿を約２０文の水中に再溶解
する。

（Ｄ）　直江炭五星１ 次いで、多糖溶液を、まだ冷たい間、ＰＨを約６．１に
調節し、そして塩化ナトリウムを０．１５モルの濃度に
する。活性炭の２０％懸濁液をかきまぜながら添加して
、２〜７％、好ましくは５％の活性炭の濃度にする。こ
の混合物を、約４℃に約３０分間冷却静置する。この混
合物を濾過して活性炭を除去し、さらにｌ系列のフィル
ターパッドまたは膜に通過させることにより清浄化する
。好ましい実施態様において、ＣＰＸ−１０Ｃ（ＡＭＦ
−ＣＵＮＯ）フィルターを使用し、次いで１．２．０．
６５．０．４５および０．２２ｕミリボア膜を使用する
。この手順の間、２６０ｍｕにおける光学濃度を核酸濃
度についての対照標準として使用することができ、そし
てＬｏｗｒｙ、ｅｔ　ａｌ、の方法を使用してタンパク
質含量を監視することができる。

得られた濾液を、室温、はぼ２１〜２５℃に加温した後
、透析濾過する。ここで、１０，０００の分子量のカッ
トオフの中空繊維のカートリッジを含有するＤＣ３０型
アミコン装置を使用し、すべての残留する塩化ナトリウ
ムを除去した。次いで、透析症過液を急速凍結し、そし
て凍結乾燥して精製された肺炎球菌多糖粉末、ここで１
７Ｆ型、が残る。この粉末を低い湿度においてびん中に
収穫し１次いでこれを密封し、冷時に貯蔵する。−２０
℃以下が適当であることがわがった。

一ヒの方法は汚染物質のタンパク質および核酸の９９％
より多くを除去すると同時に、生成物の免疫原性を保持
した。

原料の多糖は、３型について実施例１に記載した方法に
おけるようにして、１９Ａ型発酵肉汁のリゼイトから調
製する。

原料の多糖上澄みに、酢酸ナトリウムを上澄みおよびア
ルコールに対して約４％の最終濃度に添加する。ＰＨを
約６．７に、好ましいモードにおいて、±０．１に８モ
ルの酢酸で調節する。アルコールを０．５〜１．０容量
、好ましくは０．７　１（ ５容量で、２〜６℃の温度においてかきまぜながらゆっ
くり添加する。ｐＨを約７．０に、好ましいモードにお
いて、±０．１に８モルの酢酸で調節する。沈殿はゆっ
くり形成し、この混合物を一夜約１６〜２０時間静置す
る。肺炎球菌多糖類は不安定化する傾向があり、それら
は低温において最もよく取扱われる。こうして１６〜２
０時間の期間の間、多糖の沈殿を冷時に、ここでは約４
℃に保持すべきである。前述の分別の方法は、肺炎球菌
多糖の精製におけるアルコール沈殿工程の標準である。

上の方法の他の型についての変動は、アルコールの容量
および特定の型に使用する工程の順序に主として依存す
るが、それらに限定されない。沈殿した汚染物質は、遠
心により、約６〜７又／時の流速および低温、好ましく
は約２〜約６℃の温度において均一に排除されるであろ
う。

部分的に精製された多糖を含有する上澄みは、ｐＨ約６
．６に上のように調節し、次の工程のアルコールを添加
するときの最終体積に対して４％の最終濃度に酢酸ナト
リウムを添加し、次いでｐＨを約６．７に調節する。１
９Ａ型について、アルコールを最小的１．５〜２．０容
量に添加し、そしてＰＨを７に調節する。１９Ａ型では
、好ましい最終アルコール濃度は合計の多糖沈殿につい
て約１．７５容量を超えなくてはならない。

次いで、混合物を、第１アルコール分別沈殿におけるよ
うに低温において匹敵する時間の間装置し、同様に遠心
するが、これはこの工程において沈殿した多糖である。

多糖の沈殿は、かきなぜながら、十分な量、通常約４０
文の水中に溶解し、低温、約４°Ｃは好ましい。濁りが
見えるとき、この溶液を低温、約２〜６℃および約６〜
７又／時において、極過または遠心により清浄化するこ
とができる。

（Ｂ）第２１アルコール′ これは第１アルコール分別沈殿におけるように、上で形
成した多糖含有上澄みを、ｐＨ約６゜６に８モルの酢酸
で調節し、好ましいモードにおいて±０．１に達成する
。酢酸ナトリウムを約４％の最終濃度に添加し、そして
ｐＨを約６．７に調節し、そして±０．１は上のように
好ましい。

約０．７５〜１．２５容量、好ましい実施態様において
１．０容量のアルコールを添加し、ＰＨ７に調節し、第
１分別アルコール沈殿において前述のように処理し、か
きまぜなたら冷却し、ｐＨを調節し、静置し、そして濾
過または遠心により清浄化する。このように除去された
沈殿、部分的に精製された多糖上澄み流体をｐＨ約６．
６に、好ましいモードにおいて±０．１に調節する。多
糖を完全に沈殿させるために、酢酸ナトリウムを約４％
の最終濃度に添加し、そしてＰＨを第１分別アルコール
沈殿において記載したように約６．７に、好ましいモー
ドにおいて±０．１に調節する。約１．５〜２．０容量
のアルコールを好ましい実施態様において１．７５容量
の最終最小濃度に添加し、そしてＰＨを７に調節する。

次いで、静置し、第１分別アルコール沈殿におけるよう
に、沈殿し、遠心し、再び約４（ｌの冷ピロゲン不合水
中に、好ましい実施態様において約４°Ｃにおいて再溶
解する。

次いで多糖溶液を室温（２１〜２５℃）に加温し、そし
てｐＨを約７．４±０．１に炭酸ナトリウム溶液で調節
する。０．４％の炭酸ナトリウムの濃度は、この調節溶
液に便利であることがわかった。

塩化ナトリウムを０．１５モルにかきまぜながら添加し
、セタブロンの１０％の溶液を０．０５〜０．２容量％
、好ましくは０．０７５容量％にゆっくり添加する。沈
殿が形成するまで、ここで約９０分間、静置し、この混
合物を約４℃に再冷却し、そして沈殿を遠心により除去
する。６〜８文／時の流速および７〜１４℃の温度を好
ましい実施態様において使用するが、これらの範囲は一
般的である。この手順を用いると、１９Ａ型肺炎球菌多
糖はセタブロンにより沈殿しない。沈殿を廃棄する。多
糖はここで溶液中に存在し、一方核酸および他の不純物
を廃棄可能な遠心沈降物である。この手順は、アルコー
ル分別後に残留する核酸およびタンパク質不純物の大部
分を除去する。

次いで多糖を含有する上澄みを再沈殿させ、上澄みをｐ
Ｈ約６．６に調節し、そして酢酸ナトリウムを約４％に
添加する。次いでｐＨを約６．７に上昇させ、約１．７
５容量のアルコールを添加し、そしてｐＨを７に約４℃
において１６〜２０時間調節し、多糖を再び遠心し、多
糖をピロゲン不合水中に再溶解し、約４０見は適当であ
る。この手順をさらに２回反復して多糖をさらに精製し
、朕跡量のセタブロンを除去し、最後の沈殿を約２０！
；Ｌの水中に再溶解する。

（Ｄ）　固士皮五端１ 次いで、多糖溶液を、まだ冷たい間、ｐＨを約６．１に
調節し、そして塩化ナトリウムを０．１５モルの濃度に
する。活性炭の２０％懸濁液をかきまぜながら添加して
、２〜７％、好ましくは５％の活性炭の濃度にする。こ
の混合物を、約４℃に約３０分間冷却静置する。この混
合物を濾過して活性炭を除去し、さらにｌ系列のフィル
ターパッドまたは膜に通過させることにより清浄化する
。好ましい実施態様において、ＣＰＸ−１０ｃ（ＡＭＦ
−ＣＵＮＯ）フィルターを使用し、次いで１．２．０．
６５．０．４５および０．２２ｕミリボア膜を使用する
。この手順の間、２６０ｍｕにおける光学濃度を核酸濃
度についての対照標準として使用することができ、そし
てＬｏｗｒｙ、ｅｔ　ａｌ、の方法を使用してタンパク
質含量を監視することができる。

得られた濾液を、室温、はぼ２１〜２５℃に加温した後
、透析濾過する。ここで、ｉｏ、ｏｏ。

の分子量のカッ′トオフの中空繊維のカートリッジを含
有するＤＣ３０型アミコン装置を使用し、すべての残留
する塩化ナトリウムを除去した。次いで、透析濾過液を
急速凍結し、そして凍結乾燥して精製された肺炎球菌多
糖粉末、ここで１９Ａ型、が残る。凍結乾燥前に、０．
０１％〜２５％、好ましくは０．２％のグリシンを透析
濾過液に添加する。この粉末を低い湿度においてびん中
に収穫し、次いでこれを密封し、冷時に貯蔵する。−２
０℃以下が適当であることがわかった。

上の方法は汚染物質のタンパク質および核酸の９９％よ
り多くを除去すると同時に、生成物の免疫原性を保持し
た。

原料の多糖は、３型について実施例１に記載した方法に
おけるようにして、２２Ｆ型発酵肉汁のリゼイトから調
製する。

の°：２２Ｆ１ （Ａ）　Ｉ　Ｉアルコール 原料の多糖上澄みに、酢酸ナトリウムを上澄みおよびア
ルコールに対して約４％の最終濃度に添加する。ＰＨを
約６．７に、好ましいモードにおいて、±０．１に８モ
ルの酢酸で調節する。アルコールを０．２５〜０．７５
容量、好ましくは０．５容量で、２〜６℃の温度におい
てかきまぜなかもゆっくり添加する。ｐＨを約７．０に
、好ましいモードにおいて、±０．１に８モルの酢酸で
調節する。沈殿はゆっくり形成し、この混合物を一夜約
１６〜２０時間静置する。肺炎球菌多糖類は不安定化す
る傾向があり、それらは低温において最もよく取扱われ
る。こうして１６〜２０時間の期間の間、多糖の沈殿を
冷時に、ここでは約４℃に保持すべきである。前述の分
別の方法は、肺炎球菌多糖の精製におけるアルコール沈
殿工程の標準である。上の方法の他の型についての変動
は、アルコールの容量および特定の型に使用する　東工
程の順序に主として依存するが、それらに限定されない
。沈殿した汚染物質は、遠心により、約１６〜２０ｆＬ
／時の流速および低温、好ましくは約２〜約６℃の温度
において均一に排除されるであろう。

部分的に精製された多糖を含有する上澄みは、ｐＨ約６
．６に上のように調節し、次の工程のアルコールを添加
するときの最終体積に対して４％の最終濃度に酢酸ナト
リウムを添加し、次いでｐＨを約６．７に調節する。２
２Ｆ型について、アルコールを最小的１．２５〜１．７
５容量に添加し、そしてｐＨを７に調節する。２２Ｆ型
では、好ましい最終アルコール濃度は合計の多糖沈殿に
ついて約１．５０容量を超えなくてはならな（、Ｘ。

次いで、混合物を、第１アルコール分別沈殿におけるよ
うに低温において匹敵する時間の間装置し、同様に遠心
するが、これはこの工程において沈殿した多糖である。

多糖の沈殿は、かきなぜながら、十分な量、通常約４０
立の水中に溶解し、低温、約４℃は好ましい。濁りが見
えるとき、この溶液を低温、約２〜６℃および約６〜７
見／時において、濾過または遠心により清浄化すること
ができる。

（Ｂ）　２　アルコール これは第１アルコール分別沈殿におけるように、上で形
成した多糖含有上澄みを、ｐＨ約６゜６に８モルの酢酸
で調節し、好ましいモードにおいて±０．１に達成する
。酢酸ナトリウムを約４％の最終濃度に添加し、そして
ｐＨを約６．７に調節し、そして±０．１は上のように
好ましい。

約０．２５〜０．７５容量、好ましい実施態様において
０．５０容量のアルコールを添加し、ｐＨ７に調節し、
第１分別アルコール沈殿において前述のように処理し、
かきまぜなたら冷却し、ｐＨを調節し、静置し、そして
鹸過または遠心により清浄化する。このように除去され
た沈殿、部分的に精製された多糖上澄み流体をｐＨ約６
．６に、好ましいモードにおいて±０．１に調節する。

多糖を完全に沈殿させるために、酢酸ナトリウムを約４
％の最終濃度に添加し、そしてｐＨを第１分別アルコー
ル沈殿において記載したように約６゜７に、好ましいモ
ードにおいて±０．１に調節する。約１．２５〜１．７
５容量のアルコールを好ましい実施態様において１．５
０容量の最終最小濃度に添加し、そしてＰＨを７に調節
する。次いで、静置し、第１分別アルコール沈殿におけ
るように、沈殿し、遠心し、再び約４０１の冷ピロゲン
不合水中に、好ましい実施態様において約４℃において
再溶解する。

次いで多糖溶液を室温（２１〜２５℃）に加温し、そし
てＰＨを約７．４±０．１に炭酸ナトリウム溶液で調節
する。０．４％の炭酸ナトリウムの濃度は、この調節溶
液に便利であることがわかった。

かきまぜながら、セタブロンの１０％の溶液を２．０〜
５．０容量％、好ましくは３．０容量％にゆっくり添加
する。沈殿が形成するまで、ここで約９０分間、静置し
、この混合物を約４℃に再冷却し、そして沈殿を遠心に
より除去する。６〜８文／時の流速および７〜１４℃の
温度を好ましい実施態様において使用するが、これらの
範囲は一般的である。この手順を用いると、２２Ｆ型肺
炎球菌多糖は多少の不純物とともにセタブロンにより沈
殿する。沈殿を４０文の約０．２５モルの塩化ナトリウ
ム中に再溶解し、かきまぜながら、ここで約４℃に、冷
却する。濁った懸濁液を濾過または遠心し、冷却し、こ
こで約６〜７立／時の流速および７〜１２℃の温度を用
いる。多糖はここで溶液中に存在し、一方接酸および他
の不純物を廃棄可能な遠心沈降物である。この手順は、
アルコール分別後に残留する核酸およびタンパク質不純
物の大部分を除去する。

次いで多糖を再沈殿させ、上澄みをｐＨ約６゜６に調節
し、そして酢酸ナトリウムを約４％に添加する。次いで
ＰＨを約６．７に上昇させ、約１．５容量のアルコール
を添加し、そしてｐＨを７に約４℃において１６〜２０
時間調節し、多糖を再び遠心し、多糖をピロゲン不合水
中に再溶解し、約４０ｓＬは適当である。この手順をさ
らに２回反復して多糖をさらに精製し、痕跡量のセタブ
ロンを除去し、最後の沈殿を約２０文の水中に再溶解す
る。

（Ｄ）　盾仕皮ム精１ 次いで、多糖溶液を、まだ冷たい間、ｐＨを約６．１に
調節し、そして塩化ナトリウムを０．１５モルの濃度に
する。活性炭の２０％懸濁液をかきまぜながら添加して
、２〜７％、好ましくは５％の活性炭の濃度にする。こ
の混合物を、約４℃に約３０分間冷却静置する。この混
合物を濾過して活性炭を除去し、さらにｌ系列のフィル
ターパッドまたは膜に通過させることにより清浄化する
。好ましい実施態様において、ＣＰＸ−１０Ｃ（ＡＭＦ
−ＣＵＮＯ）フィルターを使用し、次いで１．２．０．
６５．０．４５および０．２２ｕミリポア膜を使用する
。この手順の間、２６０ｍｕにおける光学濃度を核酸濃
度についての対照標準として使用することができ、そし
てＬｏｗｒｙ、ｅｔ　ａｌ、の方法を使用してタンパク
質含量を監視することができる。

得られた濾液な、室温、はぼ２１〜２５°Ｃに加温した
後、透析濾過する。ここで、１０，０００の分子量のカ
ットオフの中空繊維のカートリッジを含有するＤＣ３０
型アミコン装置を使用し、すべての残留する塩化ナトリ
ウムを除去した。次いで、透析濾過液を急速凍結し、そ
して凍結乾燥して精製された肺炎球菌多糖粉末、ここで
２２Ｆ型、が残る。この粉末を低い湿度においてびん中
に収穫し、次いでこれを密封し、冷時に貯蔵する。−２
０℃以下が適当であることがわかった。

上の方法は汚染物質のタンパク質および核酸の９９％よ
り多くを除去すると同時に、生成物の免疫原性を保持し
た。

実［ 原料の多糖は、３型について実施例１に記載した方法に
おけるようにして、３３Ｆ型発酵肉汁のリゼイトから調
製する。

原料の多糖上澄みに、酢酸ナトリウムを上澄みおよびア
ルコールに対して約４％の最終濃度に添加する。ｐＨを
約６．７に、好ましいモードにおいて、±０．１に８モ
ルの酢酸で調節する。アルコールを０．２５〜０．７５
容量、好ましくは０．５容量で、２〜６℃の温度におい
てかきまぜながらゆっくり添加する。ｐＨを約７．０に
、好ましいモードにおいて、±０．１に８モルの酢縁で
調節する。沈殿はゆっくり形成し、この混合物を一夜約
１６〜２０時間静置する。肺炎球菌多糖類は不安定化す
る傾向があり、それらは低温において最もよく取扱われ
る。こうして１６〜２０時間の期間の間、多糖の沈殿を
冷時に、ここでは約４°Ｃに保持すべきである。前述の
分別の方法は、肺炎球菌多糖の精製におけるアルコール
沈殿工程の標準である。上の方法の他の型についての変
動は、アルコールの容量および特定の型に使用する工程
の順序に主として依存するが、それらに限定されない。

沈殿した汚染物質は、遠心により、約１６〜２０１／時
の流速および低温、好ましくは約２〜約６℃の温度にお
いて均一に排除されるであろう。

部分的に精製された多糖を含有する上澄みは、ＰＨ約６
．６に上のように調節し、次の工程のアルコールを添加
するときの最終体積に対して４％の最終濃度に酢酸ナト
リウムを添加し、次いでｐＨを約６．７に調節する。３
３Ｆ型について、アルコールを最小的１．２５〜１．７
５容量に添加５、おし−ｒｐＨを江調節する。３３　Ｆ
ｙＪｉ−７’　！は、好ましい最終アルコール濃度は合
計の多糖沈殿について約１．５０容量を超えなくてはな
らない。

次いで、混合物を、第１アルコール分別沈殿におけるよ
うに低温において匹敵する時間の間装置し、同様に遠心
するが、これはこの工程において沈殿した多糖である。

多糖の沈殿は、かきなぜながら、十分な量、通常約４０
交の水中に溶解し、低温、約４℃は好ましい。濁りが見
えるとき、この溶液を低温、約２〜６℃および約６〜７
文／時において、濾過または遠心により清浄化すること
ができるや （Ｂ）　２　１アルコール これは第１ア）ｆコール分別沈殿におけるように、上で
形成した多糖含有上澄みを、ｐＨ約６゜６に８モルの酢
酸で調節し、好ましいモードにおいて±Ｏ９ｌに達成す
る。酢酸ナトリウムを約４％の最終濃度に添加し、そし
てｐＨを約６．７に調節し、そして±０．１は上のよう
に好ましい。

約０．２５〜０．７５容量、好ましい実施態様において
０．５０容量のアルコールを添加し、ＰＨ７に調節し、
第１分別アルコール沈殿において前述のように処理し、
かきまぜなたら冷却し、ＰＨを調節し、静置し、そして
濾過または遠心により清浄化する。このように除去され
た沈殿、部分的に精製された多糖上澄み流体をｐＨ約６
．６に、好ましいモードにおいて±０．１に調節する。

多糖を完全に沈殿させるために、酢酸ナトリウムを約４
％の最終濃度に添加し、そしてｐＨを第１分別アルコー
ル沈殿において記載したように約６゜７に、好ましいモ
ードにおいて±０．１に調節する。約１．２５〜１．７
５容量のアルコールを好ましい実施態様において１．５
０容量の最終最小濃度に添加し、そしてｐＨを７に調節
する９次いで、静置し、第１分別アルコール沈殿におけ
るように、沈殿し、遠心し、再び約４０５Ｌの冷ビロゲ
ン不合水中に、好ましい実施態様において約４℃におい
て再溶解する。

（ｃ）　Ｍ　ヘキサーシルトリメチルアンモニラム　セ
タブロン　１・ 次いで多糖溶液を室温（２１〜２５°Ｃ）に加温し、そ
してｐＨを約７．４±０．１に炭酸ナトリウム溶液で調
節する。０．４％の炭酸ナトリウムの濃度は、この調節
溶液に便利であることがわかった。

塩化ナトリウムを０．１５モルにかきまぜながら添加し
、セタブロンの１０％の溶液を１．０〜５．０容量％、
好ましくは３．０容量％にゆっくり添加する。沈殿が形
成するまで、ここで約９０分間、静置し、この混合物を
約４℃に再冷却し、そして沈殿を遠心により除去する。

６〜８交／時の流速および７〜１４°Ｃの温度を好まし
い実施態様において使用するが、これらの範囲は一般的
である。この手順を用いると、３３Ｆ型肺炎球菌多糖は
セタブロンにより沈殿しない。沈殿を廃棄する。多糖は
ここで溶液中に存在し、一方核酸および他の不純物を廃
棄可能な遠心沈降物である。この手順は、アルコール分
別後に残留する核酸およびタンパク質不純物の大部分を
除去する。

次いで多糖を再沈殿させ、上澄みをＰＨ約６゜６に調節
し、そして酢酸ナトリウムを約４％に添加する。次いで
ｐＨを約６．７に上昇させ、約１．５容量のアルコール
を添加し、そしてｐＨを７に約４℃において１６〜２０
時間調節し、多糖を再び遠心し、多糖をピロゲン不合水
中に再溶解し、約４０見は適当である。この手順をさら
に２回反復して多糖をさらに精製し、痕跡量のセタブロ
ンを除去し、最後の沈殿を約２０文の水中に再溶解する
。

（Ｄ）　危性次り精１ 次いで、多糖溶液を、まだ冷たい間、ｐＨを約６．１に
調節し、そして塩化ナトリウムを０．１５モルの濃度に
する。活性炭の２０％懸濁液をかきまぜながら添加して
、２〜７％、好ましくは５％の活性炭の濃度にする。こ
の混合物を、約４℃に約３０分間冷却静置する。この混
合物を濾過して活性炭を除去し、さらにｌ系列のフィル
ターパッドまたは膜に通過させることにより清浄化する
。好ましい実施態様において、ＣＰＸ−１０Ｃ（ＡＭＦ
−ＣＵＮＯ）フィルターを使用し、次いテ１　、２．０
．６５．０．４５および０．２２ｕミリボア膜を使用す
る。この手順の間、２６０ｍｕにおける光学濃度を核酸
濃度についての対照標準として使用することができ、そ
してＬｏｗｒｙ、ｅｔ　ａｌ、の方法を使用してタンパ
ク賀含量を監視することができる。

得られた濾液を、室温、はぼ２１〜２５℃に加温した後
、透析濾過する。ここで、１０，０００の分子量のカッ
トオフの中空繊維のカートリッジを含有するＤＣ３０型
アミコン装置を使用し、すべての残留する塩化ナトリウ
ムを除去した０次いで、透析濾過液を急速凍結し、そし
て凍結乾燥して精製された肺炎球菌多糖粉末、ここで３
３Ｆ型、が残る。この粉末を低い湿度においてびん中に
収穫し、次いでこれを密封し、冷時に貯蔵する。−２０
°Ｃ以下が適当であることがわがった。

上の方法は汚染物質のタンパク賀の９７％より多くおよ
び汚染物質の核酸の９９％より多くを除去すると同時に
、生成物の免疫原性を保持した。

特許出願人　アメリカン・サイアナミド會カンパニー 第１頁の続き ０発　明　者　ジエイムズ・ディ・イ　アングリツシュ
　ム ［相］発明者　ウエンリイ・リン　°アル” メリカ合衆国ニュージャーシイ州０７６４９オラデル・
エルストリート　よ処 メリカ合衆国ニューヨーク州１０９５６二二−シテイ・
ホーγベニュー　８９

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、有効量の免疫学的に精製された肺炎球菌莢膜多糖（
   “Ｃ”′多糖が実質的に存在しない）からなり、前記肺
   炎球菌莢膜多糖は肺炎球菌型（デンマーク表示）■、２
   ．３．４，５．６Ｂ、７Ｆ、８．９Ｎ、９■、ＩＯＡ、
   ＩＩＡ、１２Ｆ、１４．１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ１１９
   Ａ、１９Ｆ、２０．２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆと、６
   Ａおよび２５の０〜ｌまたは両者とから成る多価肺炎球
   菌ワクチンにおいて、効果的に免疫源の３型肺炎球菌多
   糖は清澄化された発酵リゼイト（Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ
   ｏｎ　１ｙｓａｔｅ）から精製され、前記精製は、（ａ
   ）　０　、１５〜０　、５容量のアルコールで沈殿させ
   、前記リゼイトはＰＨ約６．７にあり、約４％の最終酢
   酸ナトリウム濃度を有しかつ２〜６°Ｃの温度にあり、 （ｂ）このような沈殿を再溶解させ、 （ｃ）工程（ａ）を約０．２５〜０．６容量のアルコー
   ルで反復し、 （ｄ）工程（ｂ）を反復し、 （ｅ）工程（ａ）を約０．１〜０．５容量のアルコール
   で反復し、 （ｆ）工程（ｂ）を反復し、 （ｇ）工程（ｆ）の多糖からの不純物を、２１〜２５℃
   の温度およびｐＨ７，４±０．１、および１０％のセタ
   ブロン溶液に基づいて０．１〜０．５容量％のセタブロ
   ン濃度において、セタブロンで分別沈殿させ、 （ｈ）多糖をＰＨ約６．７において約４％の酢酸ナトリ
   ウムおよび約０．５０容量のアルコールで再沈殿させ、
   そしてピロゲン不合水中に再溶解させ、 （ｉ）工程（ｈ）を２回反復し、 （Ｄ工程（ｉ）の多糖溶液を、ＰＨ６，１および０．１
   ５モルの塩化ナトリウム濃度において２０％の活性炭懸
   濁液に基づいて３〜７％の濃度に懸濁した活性炭を添加
   するｑとにより、活性炭で精製し、そしてこの溶液を冷
   時に約３０分間静置し、そして前記活性炭を濾過し、 （ｋ）前記溶液を蒸留水に対して透析濾過し、そして （１）得られた生成物を凍結しかつ凍結乾燥する、 ことからなる方法によって実施することを特徴とする多
   価肺炎球菌ワクチン。 ２、有効量の免疫学的に精製された肺炎球菌莢膜多糖（
   ｉｎ　Ｃ＋＋多糖が実質的に存在しない）からなり、前
   記肺炎球菌莢膜多糖は肺炎球菌型（デンマーク表示）１
   ．２．３．４．５．６Ｂ、７Ｆ、８．９Ｎ、９Ｖ、ＩＯ
   Ａ、ＩＩＡ、１２Ｆ、１４．１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ，
   １９Ａ、１９Ｆ、２０．２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆと
   、６Ａおよび２５のθ〜１または両者とから成る多価肺
   炎球菌ワクチンにおいて、効果的に免疫源の５型肺炎球
   菌多糖は清澄化された発酵リゼイトから精製され、前記
   精製は、 （ａ）０．２５〜０．８容量のア）ｌ／　Ｄ　−）Ｉｙ
   　’ｔ’分別沈殿させ、前記リゼイトはｐＨ約６．７に
   あり、約４％の最終酢酸ナトリウム濃度を有しかつ２〜
   ６℃の温度にあり、そしてそのように沈殿した汚染物質
   を除去し、 （ｂ）５型の多糖を約０．９〜約１．４容量のアルコー
   ルでＰＨ約６．７において沈殿させ、（Ｃ）このような
   沈殿を集めかつ再溶解し、（ｄ）工程（ａ）を約０．２
   ５〜０．８０容量のアルコールで反復し、 （ｅ）工程（ｂ）を約０．７〜１．４容量のアルコール
   で反復し、次いで工程（Ｃ）を反復し、（ｆ）工程（’
   ｅ　）の再溶解した沈殿を、２１〜２５℃の温度および
   ｐＨ７，４±０．１、および１０％のセタブロン溶液に
   基ツいて１．０〜５゜０容量％のセタブロン濃度におい
   て、セタブロンで分別沈殿させ、 （ｇ）沈殿した多糖を除去し、そして前記多糖を約０．
   ２５モルのＮａＣ１中に冷却しながら再溶解し、 （ｈ）多糖をｐＨ約６．７において約４％の酢酸ナトリ
   ウムおよび約１容量のアルコールで再沈殿させ、そして
   ピロゲン不合水中に再溶解させ、（ｉ）工程（ｈ）を２
   回反復し、 （ｊ）工程（ｉ）の多糖溶液を、ｐＨ６，１および０．
   １５モルの塩化ナトリウム濃度において、２０％の活性
   炭懸濁液に基づいて２〜７％の濃度に懸濁した活性炭を
   添加することにより、活性炭で精製し、そしてこの溶液
   を冷時に約３０分間静置し、そして前記活性炭を濾過し
   、 （ｋ）前記溶液を蒸留水に対して透析錨過し、そして （１）得られた生成物を凍結しかつ凍結乾燥する、 ことからなる方法によって実施することを特徴とする多
   価肺炎球菌ワクチン。 ３、有効量の免疫学的に精製された肺炎球菌莢膜多糖（
   １１ＣＩ＋多糖が実質的に存在しない）からなり、前記
   肺炎球菌莢膜多糖は肺炎球菌型（デンマーク表示）ｌ、
   ２．３．４．５．６Ｂ、７Ｆ、８．９Ｎ、９Ｖ、ＩＯＡ
   、ＩＩＡ、１２Ｆ、１４．１５Ｂ、１７Ｆ、１８ｃ、１
   ９Ａ、１９Ｆ、２０．２−２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆと
   、６Ａおよび２５の０〜ｌまたは両者とから成る多価肺
   炎球菌ワクチンにおいて、効果的に免疫源の９■型肺退
   球菌多糖は清澄化された発酵リゼイトから精製され、前
   記精製は、 （ａ）０．２５〜０．８容量のアルコールテ分別沈殿さ
   せ、前記リゼイトはｐＨ約６．７にあり、約４％の最終
   酢酸ナトリウム濃度を有しかつ２〜６℃の温度にあり、
   そしてそのように沈殿した汚染物質を除去し、 （ｂ）９Ｖ型の多、糖を約１．２５〜約２．２５容量の
   アルコールでｐＨ約６．７において沈殿させ、 （Ｃ）このような沈殿を集めかつ再溶解し、（ｄ）工程
   （ａ）を約０．１５〜０．３５容量のアルコールで反復
   し、 （ｅ）工程（ｂ）を反復しかつ工程（Ｃ）を反復し、 （ｆ）工程（ｅ）の多糖から不純物を、２１〜２５°Ｃ
   の温度および０．１５モルのＮａＣｌおよびｐＨ７，４
   ±０．１、および１０％のセタブロン溶液に基づいて０
   ．０５〜１．０容量％のセタブロン濃度において、セタ
   ブロンで分別沈殿させ（ｇ）多糖をｐＨ約６．７におい
   て約４％の酢酸ナトリウムおよび約１．７５容量のアル
   コールで再沈殿させ、そしてピロゲン不合水中に再溶解
   させ、 （ｈ）工程（ｇ）を２回反復し、 （ｉ）工程（ｈ）の多糖溶液を、ｐＨ６，１および０．
   １５モルの塩化ナトリウム濃度において、２０％の活性
   炭懸濁液に基づいて２〜６％の濃度に懸濁した活性炭を
   添加することにより、活性炭で精製し、そしてこの溶液
   を冷時に約３０分間静置し、そして前記活性炭を濾過し
   、 （ｊ）前記溶液を蒸留水に対して透析濾過し、そして （、ｋ）得られた生成物を凍結しかつ凍結乾燥する。 ことからなる方法によって実施することを特徴とする多
   価肺炎球菌ワクチン。 ４、有効量の免疫学的に精製された肺炎球菌莢膜多糖（
   “Ｃ１１多糖が実質的に存在しない）からなり、前記肺
   炎球菌莢膜多糖は肺炎球菌型（デンマーク表示）ｌ、２
   ．３．４．５．６Ｂ、７Ｆ、８．９Ｎ、９Ｖ、ＩＯＡ、
   ＩＩＡ、１２Ｆ、１４．１５Ｂ、１７Ｆ、１８ｃ、１９
   Ａ、１９Ｆ、２　１０．２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆと
   、６Ａおよび２５の０〜１才たは両者とから成る多価肺
   炎球菌ワクチンにおいて、効果的に免疫源のＩＯＡ型肺
   炎球菌多糖は清澄化された発酵リゼイトから精製され、
   前記精製は、 （ａ）０．２５〜０．８容量のアルコールで分別沈殿さ
   せ、前記リゼイトはｐＨ約６．７にあり、約４％の最終
   酢酸ナトリウム濃度を有しかつ２〜６℃の温度にあり、
   そしてそのように沈殿した汚染物質を除去し、 （ｂ）ＩＯＡ型の多糖を約１．０〜約１．５容量のアル
   コールでｐＨ約６．７において沈殿させ（Ｃ）このよう
   な沈殿を集めかつ再溶解し、（ｄ）工程（ａ）を約０．
   ２５〜０．８容量のアルコールで反復し、 （ｅ）工程（ｂ）を約１．０〜２．０のアルコールで反
   復しかつ工程（Ｃ）を反復し、（ｆ）工程（、ｅ）の多
   糖溶液を、ｐＨ６，１および０．１５モルの塩化ナトリ
   ウム濃度において２０％の活性炭懸濁液に基づいて２〜
   ６％の濃度に懸濁した活性炭を添加することにより、活
   性炭で精製し、そしてこの溶液を冷時に約３０分間静置
   し、そして前記活性炭を濾過し、 （ｇ）前記溶液を蒸留水に対して透析濾過し、そして （ｈ）得られた生成物を凍結しかつ凍結乾燥する、 ことからなる方法によって実施することを特徴とする多
   価肺炎球菌ワクチン。 ５、有効量の免疫学的に精製された肺炎球菌莢膜多糖（
   “Ｃ゛多糖実質的に存在しない）からなり、前記肺炎球
   菌莢膜多糖は肺炎球菌型（デンマーク表示）１．２．３
   ．４．５．６Ｂ、７Ｆ、８．９Ｎ、９ｖ、ＩＯＡ、ＩＩ
   Ａ、１２Ｆ、１４．１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ，１９Ａ、
   １９Ｆ、２０．２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆと、６Ａお
   よび２５の０〜ｌまたは両者とから成る多価肺炎球菌ワ
   クチンにおいて、効果的に免疫源のＩＩＡ型肺炎球菌多
   糖は清澄化された発酵リゼイトから精製され、前記精製
   は、 （ａ）０．７５〜１．２５容量のアルコールで分別沈殿
   させ、前記リゼイトはｐＨ約６．７にあり、約４％の最
   終酢酸ナトリウム濃度を有しかつ２〜６°Ｃの温度にあ
   り、そしてそのように沈殿した汚染物質を除去し、 （ｂ）ＩＩＡ型の多糖を約１．５０〜約２．２５容量の
   アルコールでｐＨ約６．７において沈殿させ、 （Ｃ）このような沈殿を集めかつ再溶解し、（ｄ）工程
   （ａ）を約０．７５〜１．２５容量のアルコールで反復
   し、 （ｅ）工程（ｃ）を１．５０〜約２．２５容量のアルコ
   ールで反復し、次いで工程（Ｃ）を反復し、 （ｆ）工程（ｅ）の再溶解した沈殿を、２１〜２５℃の
   温度およびｐＨ７，４±０．１、および１０％のセタブ
   ロン溶液に基づいて１．５〜５゜０容量％のセタブロン
   濃度において、セタブロンで分別沈殿させ、 （ｇ−）沈殿した多糖を取り出し、そして多糖を約０．
   ２５モルのＮａＣ１中に冷時に再溶解し、（ｈ）多糖を
   ｐＨ約６．７において約４％の酢酸ナトリウムおよび約
   ２．０容量のアルコールで再沈殿させ、そしてピロゲン
   不合水中に再溶解させ、 （ｉ）工程（ｈ）を２回反復し、 （Ｄ工程（ｉ）の多糖溶液を、ｐＨ６，１および０．１
   ５モルの塩化ナトリウム濃度において、２０％の活性炭
   懸濁液に基づいて２〜５％の濃度に懸濁した活性炭を添
   加することにより、活性炭で精製し、そしてこの溶液を
   冷時に約３０分間静置し、そして前記活性炭を濾過し、 （ｋ）前記溶液を蒸留水に対して透析濾過し。 そして （１）得られた生成物を凍結しかつ凍結乾燥する、 ことからなる方法によって実施することを特徴とする多
   価肺炎球菌ワクチン。 ６、有効量の免疫学的に精製された肺炎球菌莢膜多糖（
   １１Ｃ１１多糖が実質的に存在しない）からなり、前記
   肺炎球菌莢膜多糖は肺炎球菌型（デンマーク表示）ｌ、
   ２．３．４．５．６Ｂ、７Ｆ、８．９Ｎ、９Ｖ、ＩＯＡ
   、ＩＩＡ、１２Ｆ、１４．１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｇ、１
   ９Ａ、１９Ｆ、２０．２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆと、
   ６Ａおよび２５のθ〜ｌまたは両者とから成る多価肺炎
   球菌ワクチンにおいて、効果的に免疫源の１５Ｂ型肺炎
   球菌多糖は清澄化された発酵リゼイトから精製され、前
   記精製は、 （ａ）０．４〜１．ｏ容量のアルコールで沈殿させ、前
   記リゼイトはｐＨ約６．７にあり、約４％の最終酢酸ナ
   トリウム濃度を有しかつ２〜６°Ｃの温度にあり、そし
   て沈殿しない汚染物質を除去し、 （ｂ）このような沈殿を集めかつ再溶解し、′（Ｃ）工
   程（ａ）を約１．５〜２．２５容量のアルコールで反復
   し、 （ｄ）工程（ｂ）を反復し、 （ｅ）工程（Ｃ）の溶解した多糖の分画を、２１〜２５
   ℃の温度およびｐＨ７，４±０．１においてセタブロン
   、およびセタブロン溶液で分別沈殿させ、 （ｆ）沈殿した多糖を取り出し、そして多糖を約０．２
   ５モルのＮａＣ１中に冷時に再溶解し、（ｇ）多糖をｐ
   Ｈ約６．７において約４％の酢酸ナトリウムおよび約０
   ．４〜１．０容量のアルコールで再沈殿させ、そしてピ
   ロゲン不合水中に再溶解させ、 （ｈ）工程（ｇ）を２回反復し、 （ｉ）前記溶液を蒸留水に対して透析濾過し、そして （ｊ）得られた生成物を凍結しかつ凍結乾燥する、 ことからなる方法によって実施することを特徴とする多
   価肺炎球菌ワクチン。 ７、有効量の免疫学的に精製された肺炎球菌莢膜多糖（
   “Ｃ”多糖が実質的に存在しない）からなり、前記肺炎
   球菌莢膜多糖は肺炎球菌型（デンマーク表示）ｌ、２．
   ３．４．５．６Ｂ、７Ｆ、８．９Ｎ、９Ｖ、ＩＯＡ、１
   １Ａ、１２Ｆ、１４．１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ，１９Ａ
   、１９Ｆ、２０．２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆと、６Ａ
   および２５の０〜ｌまたは両者とから成る多価肺炎球菌
   ワクチンにおいて、効果的に免疫源の１７Ｆ型肺炎球菌
   多糖は清澄化された発酵リゼイトから精製され、前記精
   製は、 （ａ）０．２５〜０．７５容量のアルコールで分別沈殿
   させ、前記リゼイトはＰＨ約６．７にあり、約４％の最
   終酢酸ナトリウム濃度を有しかつ２〜６℃の温度にあり
   、そしてそのように沈殿した汚染物質を除去し、 （ｂ）１７Ｆ型の多糖を約１．０〜約１．５容量のアル
   コールでｐＨ約６．７において沈殿させ（Ｃ）このよう
   な沈殿を集めかつ再溶解し、（ｄ）工程（ａ）を約０．
   ２５〜０．７５容量のアルコールで反復し、 （ｅ）工程（ｂ）を１．０〜約１．５容量のアルコール
   で反復し、次いで工程（Ｃ）を反復し、（ｆ）工程（ｅ
   ）の再溶解した沈殿を、２１〜２５℃の温度およびｐＨ
   ７，４±ｏ、ｉ、および１０％のセタブロン溶液に基づ
   いて１．０〜３゜５容量％のセタブロン濃度において、
   セタブロンで分別沈殿させ、 （ｇ）沈殿した多糖を取り出し、そして多糖を約０．２
   ５モルのＮａＣ１中に冷時に再溶解し、（ｈ）多糖をＰ
   Ｈ約６．７において約４％の酢　（酸ナトリウムおよび
   約１．２５容量のアルコールで再沈殿させ、そしてピロ
   ゲン不合水中に再溶解させ、 （ｉ）工程（ｈ）を２回反復し、 （ｊ）工程（ｉ）の多糖溶液を、ｐＨ６，１および０．
   １４モルの塩化ナトリウム濃度において、２０％の活性
   炭懸濁液に基づいて３．０〜６゜０％の濃度に懸濁した
   活性炭を添加することにより、活性炭で精製し、そして
   この溶液を冷時に約３０分間静置し、そして前記活性炭
   を濾過し、（ｋ）前記溶液を蒸留水に対して透析濾過し
   、そして （１）得られた生成物を凍結しかつ凍結乾燥する、 ことからなる方法によって実施することを特徴とする多
   価肺炎球菌ワクチン。 ８、有効量の免疫学的に精製された肺炎球菌莢膜多糖（
   “Ｃ１１多糖が実質的に存在しない）からなり、前記肺
   炎球菌莢膜多糖は肺炎球菌型（デンマーク表示）ｌ、２
   ．３．４．５．６Ｂ、７Ｆ、８．９Ｎ、９■、ＩＯＡ、
   ＩＩＡ、１２Ｆ、１４．１５Ｂ、　１７Ｆ、　１８Ｃ，
   １９Ａ、１９Ｆ、　２０．２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆ
   と、６Ａおよび２５の０〜ｌまたは両者とから成る多価
   肺炎球菌ワクチンにおいて、効果的に免疫源の１９Ａ型
   、ｍｒ炎球菌多糖は清澄化された発酵リゼイトから精製
   され、前記精製は、 （ａ）１．５〜１．０容量のアルコールで分別沈殿させ
   、前記リゼイトはｐＨ約６．７にあり、約４％の最終酢
   酸ナトリウム濃度を有しかつ２〜６°Ｃの温度にあり、
   そしてそのように沈殿した汚染物質を除去し、 （ｂ）１９Ａ型の多糖を約１．５０〜約２．２５容量の
   アルコールでｐＨ約６．７において沈殿させ、 （Ｃ）このような沈殿を集めかつ再溶解し、（ｄ）工程
   （ａ）を約０．５〜１．０容量のアルコールで反復し、 Ｃｅ）工程（ｂ）を反復し、次いで工程（Ｃ）を反復し
   、 （ｆ）工程（ｅ）を反復し、 （ｇ）工程（ｆ）の多糖から不純物を、２１〜２５℃の
   温度、０．１５モル（７）ＮａＣ１およびＰＨ７，４±
   ０．１、および１０％のセタブロン溶液に基づいて０．
   ０５〜０．２容量％のセタブロン濃度において、セタブ
   ロンで分別沈殿させ、（ｈ）多糖をｐＨ約６．７におい
   て約４％の酢酸ナトリウムおよび約１．７５容量のアル
   コールで再沈殿させ、そしてピロゲン不合水中に再溶解
   させ、 （ｉ）工程（ｈ）を２回反復し、 （ｊ）工程（１）の多糖溶液を、ｐＨ６，１および０．
   １５モルの塩化ナトリウム濃度において、２０％の活性
   炭懸濁液に基づいて３〜７％の濃度に懸濁した活性炭を
   添加することにより、活性炭で精製し、そしてこの溶液
   を冷時に約３０分間静置し、そして前記活性炭を濾過し
   、 （ｋ）前記溶液を蒸留水に対して透析濾過し、そして （１）得られた生成物を凍結しかつ凍結乾燥する、 ことからなる方法によって実施することを特徴とする多
   価肺炎球菌ワクチン。 ９、有効量の免疫学的に精製された肺炎球菌莢膜多糖（
   “Ｃ１１多糖が実質的に存在しない）からなり、前記肺
   炎球菌莢膜多糖は肺炎球菌型（デンマーク表示）ｌ、２
   ．３．４．５．６Ｂ、７Ｆ、８．９Ｎ、９Ｖ、ＩＯＡ、
   ＩＩＡ、１２Ｆ、１４．１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ１１９
   Ａ、１９Ｆ、２０．２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆと、６
   Ａおよび２５のＯ〜１または両者とから成る多価肺炎球
   菌ワクチンにおいて、効果的に免疫源の２２Ｆ型肺炎球
   菌多糖は清澄化された発酵リゼイトから精製され、前記
   精製は、 （ａ）０．２５〜０．７５容量のアルコールで分別沈殿
   させ、前記リゼイトはｐＨ約６．７にあり、約４％の最
   終酢酸ナトリウム濃度を有しかつ２〜６°Ｃの温度にあ
   り、そしてそのように沈殿した汚染物質を除去し、 （ｂ）２２Ｆ型の多糖を約１．２５〜約１．７容量のア
   ルコールでｐＨ約６．７において沈殿させ１ 、（Ｃ）このような沈殿を集めかつ再溶解し、（ｄ）工
   程（ａ）を約０．２５〜０．７５容量のアルコールで反
   復し、 （ｅ）工程（ｂ）を１．２５〜約１．７５容量のアルコ
   ールで反復し、次いで工程（Ｃ）を反復し、 （ｆ）工程（ｅ）の再溶解した沈殿を、２１〜２５℃の
   温度およびｐＨ７，４±０．１、および１０％のセタブ
   ロン溶液に基づいて２．０〜５゜０容量％のセタブロン
   濃度において、セタブロンで分別沈殿させ、 （ｇ）沈殿した多糖を除去し、そして多糖を約０．２５
   モルのＮａＣ１中に冷時に再溶解し、（ｈ）多糖をｐＨ
   約６．７において約４％の酢酸ナトリウムおよび約１．
   ５容量のアルコールで再沈殿させ、そしてピロゲン不合
   水中に再溶解させ、 （ｉ）工程（ｈ）を２回反復し、 （ｊ）工程（ｉ）の多糖溶液を、ｐＨ６，１および０．
   １５モルの塩化ナトリウム濃度において、２０％の活性
   炭懸濁液に基づいて３〜７％の濃度に懸濁した活性炭を
   添加することにより、活性炭で精製し、そしてこの溶液
   を冷時に約３０分間静置し、そして前記活性炭を濾過し
   、 （ｋ）前記溶液を蒸留水に対して透析濾過し、そして （１）得られた生成物を凍結しかつ凍結乾燥する、 ことからなる方法によって実施することを特徴、とする
   多価肺炎球菌ワクチン。 １０、有効量の免疫学的に精製された肺炎球菌莢膜多糖
   （Ｃ１１多糖が実質的に存在しない）からなり、前記肺
   炎球菌莢膜多糖は肺炎球菌型（デンマーク表示）ｌ、２
   ．３．４．５．６Ｂ、７Ｆ、８．９Ｎ、９Ｖ、ＩＯＡ、
   ＩＩＡ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、　１７Ｆ、１８Ｃ，１
   ９Ａ、１９Ｆ、２０．２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆと、
   ６Ａおよび２５のθ〜１または両者とから成る多価肺炎
   球菌ワクチンにおいて、効果的に免疫源の３３Ｆ型肺炎
   球菌多糖は清澄化された発酵リゼイトから精製され、前
   記精製は、 （ａ）０．２５〜０．７５容量のアルコールで分別沈殿
   させ、前記リゼイトはＰＨ約６．７にあり、約４％の最
   終酢酸ナトリウム濃度を有しかつ２〜６℃の温度にあり
   、そしてそのように沈殿した汚染物質を除去し、 （ｂ）３３Ｆ型の多糖を約１．２５〜約１．７５容量の
   アルコールでｐＨ約６．７において沈殿させ、 （Ｃ）このような沈殿を集めかつ再溶解し、（ｄ）工程
   （ａ）を約０．２５〜０．７５容量のアルコールで反復
   し、 （ｅ）工程（ｂ）を反復し、かつ工程（Ｃ）を反復し、 （ｆ）工程（ｅ）の多糖から不純物を、２１〜２５℃の
   温度、Ｏ，１５％ルのＮａｃｌおよびＰＨ７，４±０．
   １、およびｏ、ｉ〜０．３容量％のセタブロン濃度にお
   いて、セタブロンで分別沈殿させ、 （ｇ）多糖をｐＨ約６．７において約４％の酢酸ナトリ
   ウムおよび約１．５容量のアルコールで再沈殿させ、そ
   してピロゲン不合水中に再溶解させ、 （ｈ）工程（ｇ）を２回反復し、 （ｉ）工程（ｈ）の多糖溶液を、ｐＨ６，１および０，
   １５モルの塩化ナトリウム濃度において、２０％の活性
   炭懸濁液に基づいて２〜６％の濃度に懸濁した活性炭を
   添加することにより、活性炭で精製し、そしてこの溶液
   を冷時に約３０分間静置し、そして前記活性炭を濾過し
   、　］（ｋ）前記溶液を蒸留水に対して透析濾過し、そ
   して （ｊ）得られた生成物を凍結しかつ凍結乾燥する、 ことからなる方法によって実施することを特徴とする多
   価肺炎球菌ワクチン。