JPS5843371B2 - ガンマグロブリン ノ セイホウ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はガンマグロブリンの製法に関する。

さらに詳しくは本発明は静脈投与に適した化学的に変性
されていないガンマグロブリンの改良された製法に関す
る。

ガンマグロブリンの単離と精製は医学上、およびとくに
消極的免疫剤の製造のために非常に重要である。

この分離操作はガンマグロブリンに抗体が付随している
ために望ましい。

ガンマグロブリンを採取するための各種の方法がこれま
で発表されている。

ガンマグロブリンはコーン血漿分画■十■中に濃縮され
るものであることが知られている。

（ジャーナル、オブ、クリニカル、インベスチゲイショ
ン２３巻、 ４１７−３２頁（１９４４年）、ジャーナ
ル、オブ、ジ、アメリカン、ケミカル、ソサイエテイ６
８巻４７９頁（１９４６年）参照）商業的には、一般に
免疫血清グロブリンと呼ばれるガンマグロブリンは１６
．５％の筋注剤としてコーン分画■より製造される。

この分画は出発材料の血漿中に存在する防護的抗体の多
くを含んでいる。

しかしながらガンマグロブリンの分子集合体の存在はコ
ーン分画■物質の静注を危険なものとする。

静脈投与は多量のしかも不快でない投与を可能にするか
ら静脈投与に対して安全な製剤が望ましく、そして有意
義な用途を有する。

これまでの静注に対し安全な免疫血清グロブリンを製造
しようとする試みの多くは、コーン分画■より誘導され
た材料を利用している。

酸処理、酵素分解、臭化シアンによる分解およびその他
の類似方法を用いて、研究者らはガンマグロブリン分子
のＦＣ部分を攻撃し、分画操作中に生成した集合体を離
散せしめ、その後生成することを阻止せしめている。

しかしながらこれらの操作についての公表された成果か
ら、化学的に変性されたガンマグロブリン製剤は臨床用
として望ましくない集合、再集合、分裂の程度が一様で
ないことを示している。

最近公表された通常のガンマグロブ１ノンを製造する血
漿コーンアルコール分画法に優る方法では分画操作に沈
殿剤として高分子物質を使用している。

このように、ポルソンらのＢｉｏｃｈｉｍ、 Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ 。

Ａｃｔａ８２．４６３−７５（１９６４）、およびアメ
リカ特許第３，４１５，８０４号によると、ガンマグロ
ブリンの製造に分子量６０００のポリエチレングリコー
ル（ＰＥＧ）を用いている。

しかしながら記載されているその製品は筋注および腹腔
内注射には適するが、静注には不適である。

さらにポルソンらの発表した方法を追試して得た収率は
所望の程度よりはるかに低い。

またこのポルジン法はガンマグロブリン濃縮物の最終分
画に望ましくないエタノールの使用を必要としている。

ポリエチレングリコールを沈殿剤として使用するポルジ
ン法に優る有意義な改良がなされ、同一人に譲渡された
１９７１年１１月８日出願のアメリカ特許出願第１９６
，７４９号に記載されている。

この出願には、出発物質としてコーン分画■を使用し、
静注に適する化学的に変性されない、高純度のガンマグ
ロブリン濃縮物が得られる多段分画法が記載されている
。

この方法でも静脈投与に適した高純度の好ましいガンマ
グロブリン濃縮物が生産できるけれども、本発明によれ
ば、エチレンオキシド−プロピレングリコール縮合生成
物である或種のブロック共重合体を沈殿剤として使用す
る新規な分画法により収率、純度および製品の溶解度の
実質的な改善が達せられることがわかった。

本明細書においては、本発明を構成すると考えられる要
件を指摘し明瞭に記載する特許請求の範囲において本発
明を結論付けているが、本発明は以下の詳細な説明と、
本発明によりブロック共重合体を使用して得られたガン
マグロブリン製品の溶解度が先行技術のポリエチレング
リコールを使用して得た製品よりも有意義にしかも実質
的に向上していることを示している添附図面を参照する
ことにより一層よく理解できるものと信ぜられる。

図面において、第１図は前述の比較製品の時間を函数と
した溶解度曲線のグラフである。

第２図は前述の比較製品を超遠心分離にかけたときの溶
解度曲線のグラフである。

本発明によれば、静注用のガンマグロブリンは全血漿、
もしくはコーン血漿分画Ｉ［＋Ｉ［Ｉ、Ｉもしくは■の
いずれかを前記のブロック共重合体で多段分画すること
によって製造せられる。

本発明に使用するブロック共重合体であるエチレンオキ
シド−プロピレングリコール縮合生成物はエチレンオキ
シドとポリオキシプロピレン重合体とを縮合することに
よって製造することができる。

これらのブロック共重合体の製造に関するものの詳しい
詳細はアメリカ特許第２，６７４，６１９号明細書中に
見られる。

これらのブロック共重合体は次の構造式で示すことがで
きる。

本発明の目的に対しては、これらのブロック重合体は好
ましくは分子中に少なくとも５０係のエチレンオキシド
と、少なくとも９５０のポリオキシプロピレン疎水性ベ
ースとを含んでいる。

エチレンオキシドを５０係以下含む製品は十分に無毒性
でなく、そして９５０以下の分子量の疎水性ベースを持
つ製品は所望の溶解度を持っていない。

この点に関し本発明で使用するブロック共重合体はアメ
リカ特許第３，４５０，５０２号、同第３．５７７，５
２２号、同第３，５９０，１２５号明細書に記載されて
いる代用血漿としておよび人工心肺装置に充填するため
に用いる材料に関係があり、そしてそれらのものを包含
している。

好適なブロック共重合体の例としては、ワイヤンドット
、ケミカル、コーポレイション社より市販されているＦ
１ａおよびＦ−６８″′プルロニツク”ポリオールであ
る。

Ｆ−３８は分子中にポリオキシエチレン親水性単位を８
０係含み、ポリオキシプロピレン疎水性ベースは分子量
９５０を有する。

Ｆ−６８は同様に分子中にポリオキシエチレン親水性単
位を５ｏｑｂ含むが、しかし疎水性ベースは分子量１７
５０を有する。

これら２種の６プルロニツク”ポリオールの総分子量は
それぞれ４７５０および８７５０である。

これらのポリオールのさらに詳しい説明はワイヤンドッ
ト、ケミカル、コーポレイション社の刊行物６ザ、プル
ロニック、グリッド”第６版に見られる。

本発明において出発物質として用いることのできるコー
ン血漿分画１＋ＩＩＩｔｌおよび■は実質的にはアルフ
ァ、ベーター、およびガンマグロブリン（Ｉ、Ｇ、Ｉｇ
Ａ、Ｉ、Ｍ）である。

血漿のガンマグロブリン分画は冷エタノールによる連続
沈殿により得られ、さらに前出のジャーナル、オン、ク
リニカル、インベスチゲイションおよびジャーナル、オ
ン、ジ、アメリカン、ケミカル、ソサイエテイー引用文
献に詳述されている。

これらの分画の各々は凝固因子を含んでおり、これら因
子を本発明のブロック共重合体による分画の前に除去す
ることが望ましい。

凝固因子の除去は、出発物質を通常の生理食塩水に懸垂
しく塩分約ｏ、９％）、ｐＨを約６．５乃至７．０に調
節し、そして少量のリン酸カルシウムを加えることによ
って達成することができる。

好ましくは、出発物質を生理食塩水に約０．５乃至２．
５グラム係Ｃｇ／ｌ ００ＴＬｌ）の濃度でｐＨ約７に
おいて懸垂させる。

この方法に使用するリン酸カルシウムは、好ましくは式
１０Ｃａ０・３Ｐ２０．・Ｈ２ＯもしくはＣａ１０（Ｏ
Ｈ）２（ＰＯ４）４の式で記載することができる三塩基
性の重合型のものである。

重量で約０．５ ％から約２係のリン酸カルシウムの使
用が凝固因子の吸着のために適当で、濃度は約０．５
％乃至１係が好ましい。

吸着された凝固因子は遠心分離およびその他の分離法で
容易に分離することができる。

出発物質として全血漿を用いるときは、凝固因子の分離
に先立ち、ブロック共重合体で、ｐＨ約６．５乃至７．
５で共重合体の最終濃度約１３乃至１６グラム係１．好
ましくは１５グラム係で予備沈殿を行う。

この沈殿工程で、所望のガンマグロブリンは遠心分離お
よびそれに類似の分離手段で上澄液から分離可能な沈殿
中に存置される。

凝固因子を分離したのち、上澄液をブロック共重合体で
分画する。

全血漿およびコーン血漿分画■＋■はアルブミンを含ん
でいるのに対し、分画■および■は含んでいないので、
全血漿および分画■＋■からはブロック共重合体による
沈殿操作によりアルブミンをまず取り除くことが好まし
い。

これは分画■もしくは■の場合は必要としない。

アルブミンの除去は、好ましくはｐＨ約６．５乃至７．
５、共重合体の濃度約１２乃至１６グラム係。

好ましくは１４±０．５グラム係で共重合体による沈殿
によって行われる。

この操作において、アルブミンは上澄液中に残存し、所
望のガンマグロブリンは遠心分離および類似の分離手段
によりアルブミン上澄液より分離可能な沈殿中に存在し
ている。

凝固因子の除去、そして全血漿およびコーン分画■＋■
の場合はアルブミンの除去に続き、各出発物質を前と同
様に通常の生理食塩水に再懸水し、そして以下のような
ブロック共重合体による多段分画に服せしめる。

再懸垂した材料をｐＨ４，５±０．５に調節し、共重合
体を約６．０乃至８．５グラム係の濃度に混和する。

主としてＩ、Ｍ、Ｉ、Ａ、アルファー２マクログロブリ
ンおよびＨＡＡ（オーストラリア抗原）を含んでいる生
成沈殿を上澄液から分離し、ガンマグロブリンを含む該
上澄液をｐＨ約５±０．５に調節する。

上澄液中のブロック共重合体の濃度を次に約８．５乃至
約１０グラム係に上昇し、生成する混液を補体Ｃ３およ
びＣ４を除去するために遠心分離もしくは口過する。

上澄液もしくは０液をそれぞれｐＨ７±０．５に調和し
、共重合体の最終濃度が約１４乃至１６グラム係となる
ようにブロック共重合体と混和する。

生成した沈殿は本発明の目的物であるガンマグロブリン
濃縮物として残す。

次の実施例は本発明を例証するものであるが、本発明は
これら特定の実施例に限定されるものではない。

実施例中、コーン血漿分画■およびコーン血漿分画■は
オンクレー等のジャーナル、オン、ジ、アメリカン、ケ
ミカル、ソサイエテイ７１巻５４１−５０頁（１９４９
年）およびカーク・オスマーのエンサイクロペディア、
オン、ケミカル、チクノロシイ３巻５８５−９２頁（第
２版１９６４年）に記載の方法９により、そしてコーン
血漿分画Ｉ＋Ｉは同じく方法６によって製造した。

実施例 １ コーン分画■＋■のペーストを通常の生理食塩水に濃度
１．５係となるように溶解し、ｐＨを７に調節する。

次に懸垂液にリン酸カルシウム（１０ＣａＯ３Ｐ２０５
・Ｈ２Ｏ）を約１係加え、室温約２５℃）で約６０分間
混合する。

混合液を遠心分離し、生成する沈殿を除去する。

上澄液をとり、ｐＨ７に調節し、プルロニックＦ−３８
（ＰＬＵＲＯ−ＮＩＣ，Ｆ−３８）を濃度１４係になる
ように加える。

混合液を１０℃乃至３０℃で約１乃至４時間混合する。

上澄液を取り除き、残存する沈殿を通常の生理食塩水に
濃度１．５％に再懸垂する。

懸垂液をｐＨ４，５に調節し、プルロニックＦ−３８を
濃度８係に加える。

試料を１０°乃至３０℃で約１乃至４時間混合し、遠心
分離する。

沈殿を除去し、残存する上澄液をｐＨ５に調節する。

プルロニックＦ−３８を濃度９係に加え、試料を１０’
乃至３０℃で約１乃至４時間混合する。

生成物を遠心分離もしくは口過し沈殿を除去する。

残存する上澄液をｐＨ７に調節し、プルロニックＦ−３
８を濃度１６優に加える。

試料を１０℃乃至３０℃で約１乃至４時間混合し、遠心
分離する。

上澄液を除去し、残存する沈殿を本発明の目的物である
ガンマグロブリン濃縮物として取る。

製品をグリシンど食塩水を含有する水溶液に溶解し、好
ましくはグリシン０．３モル、食塩１係の水溶液にタン
パク約２乃至６グラム係の濃度の溶液とする。

この溶液を分画時製品中に残留することがある粒状物を
除去するため清澄化する。

清澄化法としてはセライトを使用するか、アスベストパ
ッドによる口過、およびミリポア口過器による口過など
が好ましい。

実施例 ２ コーン分画■のペーストを実施例１のように通常の生理
食塩水に懸垂し、リン酸カルシウムで吸着し、上澄液を
通常の生理食塩水に再懸垂する。

この再懸垂した材料を実施例１のようにプルロニックＦ
−３８をそれぞれ８％、９％および１６係の濃度で使用
し、ただしプルロニックＦ−３８を１４係の濃度で使用
する予備分画を行うことなく多段分画に服せしめる。

最終製品を所望のガンマグロブリン濃縮物として取る。

実施例 ３ コーン分画■のペーストを実施例２と同様に通常の生理
食塩水に懸垂し、懸垂液をリン酸カルシウムで処理し、
多段分画操作に服せしめる。

最終製品を所望のガンマグロブリン濃縮物として取る。

実施例 ４ 全血漿を通常の生理食塩水に濃度１．５係に溶解し、ｐ
Ｈを７，５に調節する。

プルロニックＦ−３８を濃度１４係に加える。

懸垂液を１０°乃至３０°Ｃで約１乃至４時間混合し遠
心分離する。

上澄液を除去し、残存する沈殿を通常の生理食塩水に再
懸垂し、実施例１の分画操作に服せしめる。

最終製品を所望のガンマグロブリン濃縮物として取る。

実施例 ５ 本発明によるガンマグロブリン製品がポリエチレングリ
コールを使用して得られたガンマグロブリン製品よりも
、その収率、純度および溶解度において有意に、しかも
実質的に改善されていることを示すため、各々の製品に
ついて比較した。

この比較試験においては、実施例１および２の最終ガン
マグロブリン製品と、プルロニックＦ−３８に代えてポ
リエチレングリコール４０００を使用するほかは該実施
例と同一の操作で製造した製品とを使用した。

この比較試験により、ブロック共重合体の場合は分画操
作中に生じた沈殿はよくまとまっており、作業し易いの
に対し、ポリエチレングリコールの場合はまとまりがゆ
るやかで多量のポリエチレングリコールが沈殿中に残留
することが観察された。

ブロック共重合体による沈殿によって得られた最終製品
は、ポリエチレングリコールによって得た製品よりも清
澄性が改善され、外観においてもすぐれていたが、後者
は濁っており、少しの振とうでもすぐに泡立つことが観
察された。

収率および純度の各製品間の差を次表に示す。

上表からブロック共重合体沈殿によって得た製品はポリ
エチレングリコール沈殿によって得た製品よりも有意義
に、しかもかなり収率が高く、純度も高いことがわかる
。

実施例１によって製造したガンマグロブリン製品のペー
ストと、ブロック共重合式の代りにポリエチレングリコ
ールを使用して実施例１によって製造した製品とを０．
３モルグリシン生理食塩水（通常の生理食塩水中にグリ
シン０．３モル濃度）に１６係の濃度に加えた。

タンパク定量のために、２．５，１０，２０，３０およ
び４５分の間隔で混合操作中試料を採取した。

第１図は各沈殿法により製造したガンマグロブリンの溶
解度曲線を示し、プルロニックＦ−３８を使用した操作
によるときの溶解タンパクの量は、１０分抜本リエチレ
ングリコール沈殿によるタンパク量を有意かつ実質的に
上廻ることを示している。

上記のプルロニックＦ−３８およびポリエチレングリコ
ール沈殿法によって製造したガンマグロブリンペースト
から各種タンパク濃度（６ｃＩ）、９係、および１２係
）の溶液を調製した。

すべての試料はよく混合し、超遠心機中で４０．ＯＯＯ
ＲＰＭで４５分間遠心分離し、上澄液のタンパク濃度を
測定した。

第２図はプルロニックＦ−３８分画法によって製造した
ガンマグロブリンペーストは、ポリエチレングリコール
沈殿法で製造したペーストよりもより多くのタンパクが
溶液中に移行したことを示している。

前述の実施例１乃至５で得たのと同様の結果は、これら
実施例において当量のＦ−３８に代えてプルロニックＦ
−６８を使用しても得られる。

当業者には、本発明の精神と範囲から逸脱することなく
他の実施例および前出実施例の変更が明白であろう。

このような当業者に自明な変更および実施例のすべても
本発明の範囲に包含されるものである。

次に本発明の実施態様のいくつかを記載する。

（１）ブロック共重合体は分子中に約８０係のポリオキ
シエチレン親水性単位を含有し、ポリオキシプロピレン
疎水性ベースは分子量９５０を有する特許請求の範囲記
載の方法。

（２）吸着した凝固因子から分離した上澄液をｐＨ約６
．５．ブロック共重合体の最終濃度約１２係乃至１６係
においてブロック共重合体による予備沈殿に服せしめ、
生成する沈殿を次の操作のために使用する追加工程を含
む特許請求の範囲記載の方法。

（３）ブロック共重合体は分子中に約８０係のポリオキ
シエチレン親水性単位を含有し、ポリオキシプロピレン
疎水性ベースは分子量９５０を有する前言改２）項記載
の方法。

（４）出発物質は全血漿で、該全漿をｐＨ約６．５乃至
７．５、ブロック共重合体の最終濃度約１３係乃至１６
係においてブロック共重合体による予備沈殿に服せしめ
、生成する沈殿を次の操作のために使用する追加工程を
含む前記（２）項記載の方法。

（５）ブロック共重合体は分子中に約８０係のポリオキ
シエチレン親水性単位を含有し、ポリオキシプロピレン
疎水性ベースは分子量９５０を有する前言改４）項記載
の方法。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明による製品と従来法による製品との時間
を函数とした溶解度曲線を示すグラフで、第２図はこれ
らの製品を超遠心機にかけたときの溶解度曲線のグラフ
である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 全血漿、コーン血漿分画■＋■、■および■よりな
   る群より選ばれた材料を通常の生理食塩水に懸垂し、ｐ
   Ｈを約６．．５乃至７．５に調節し、懸垂液をリン酸カ
   ルシウムと混合して凝固因子を吸着せしめ、生成する沈
   殿を分離し、そして回収した上澄液を、分子内にエチレ
   ンオキシドを少なくとも約５０係と少なくとも分子量約
   ９５０のポリオキシプロピレン疎水性ベースとを含むエ
   チレンオキシドとポリオキシプロピレン重合体とのブロ
   ック共重合体により、最初ｐＨ約４乃至５．ブロック共
   重合体の最終濃度約６．０％以上約８．５係で沈殿せし
   めて次工程のために上澄液をとり、次いでｐＨ約４．５
   乃至５．５、ブロック共重合体の最終濃度約８．５乃至
   約１０係で沈殿せしめて上澄液をとり、そしてｐＨ約６
   ．５乃至７．５、ブロック共重合体の最終濃度約１４係
   乃至１６係で沈殿せしめて得られる沈殿を活性ガンマグ
   ロブリン濃縮物としてとる連続３回の沈殿処理に服せし
   めることを特徴とする静脈投与に適した高度の可溶性の
   ガンマグロブリン濃縮物の製法。