FI98642C - Menetelmiä mikrobiologisesti tuotetun kymosiinin talteenottamiseksi - Google Patents

Description

98642

Menetelmiä mikrobiologisesti tuotetun kymosiinin talteen-ottamiseksi

Keksinnön tausta 5 1. Keksinnön aihepiiri Tämä keksintö koskee mikrobiologisesti tuotetun kymosiinin talteenottoa. Erityisesti tämä keksintö kohdistuu menetelmiin kymosiinin talteenottamiseksi fermen-taatioliemestä, joka syntyy viljeltäessä mikro-organisme-10 jä/ jotka on manipuloitu tuottamaan kymosiinia. Tämä keksintö koskee edelleen menetelmiä mikrobiologisesti tuotetun kymosiinin selektiiviseksi talteenottamiseksi ja sittemmin puhdistamiseksi.

2. Alan tekninen taso 15 Kymosiini on tunnettu entsyymi, joka on erityisen käyttökelpoinen juuston valmistuksessa. Viime aikoihin asti lähes kaikki kaupallisesti käytetty kymosiini otettiin talteen vasikan 4. mahasta, vaikkakin kymosiinin talteenotto muidenkin nisäkkäiden, kuten lampaan, vuohien 20 jne., mahoista on niinikään entuudestaan tunnettua. Kuitenkin johtuen viimeaikaisesta laskusta vasikkatuotannos-sa tällaiset luontaiset kymosiinilähteet ovat vähentyneet, mikä puolestaan on antanut sysäyksen kymosiinin mikrobiologiselle muodostamiselle. Täten tuoreissa patent-25 tijulkaisuissa ja patenttihakemusjulkaisuissa on julkis tettu, että kymosiinia voidaan tuottaa fermentoimalla geneettisesti manipuloituja mikro-organismeja. Esimerkiksi kymosiinin tuotanto fermentoimalla rihmaisia sieniä, joita on modifioitu geneettisesti ilmentämään ja erittämään 30 kymosiinia, kuvataan Lawlisin et ai. US-patentissa 5 364 770, joka jätettiin 26. helmikuuta 1988 ja joka sisällytetään kokonaisuudessaan tähän viitteeksi. Samoin US-patenttijulkaisussa nro 4 666 847, joka julkaistiin 19. toukokuuta 1987 ja joka sisällytetään kokonaisuudessaan 35 tähän viitteeksi, kuvataan kymosiinin tuotanto fermentoi- 98642 2 maila colia (bakteeri), joka on modifioitu geneettisesti ilmentämään ja erittämään kymosiinia, sekä kymosiinin tuotanto fermentoimalla Saccharomyces cerevisiaetä (hiiva), joka on modifioitu geneettisesti ilmentämään ja erit-5 tämään kymosiinia.

Koska kymosiinin mikrobiologisesta tuotannosta seuraa muidenkin entsyymien kuin kymosiinin ilmentyminen, kymosiinin talteenotto ja puhdistus fermentaatioliemestä on ollut jatkuva ongelma. Esimerkiksi tuotettaessa kymo-10 siinia US-patentin 5 364 770 mukaan alfa-amylaasin, happaman fosfataasin, leu-aminopeptidaasin jne. kaltaisia entsyymejä muodostuu mukaan tällaisessa fermentaatiossa. Tällaisten ylimääräisten entsyymien läsnäolo fermentaatiolie-messä nostaa edelleen vaikeustasoa kymosiinin talteenotos-15 sa ja puhdistuksessa tällaisista liemistä.

Joskin lukuisia menetelmiä julkistetaan entsyymien eristämiseksi fermentaatioliemestä, missään niistä viitteistä, joista hakijat ovat tietoisia, ei spesifisesti julkisteta, että kymosiini voidaan ottaa talteen sekä var-20 sin korkeina määrinä, eli jakaumakertoimet (K) > 85, että selektiivisesti fermentaatioliemestä, joka sisältää muitakin entsyymejä kuin kymosiinia.

Esimerkiksi US-patenttijulkaisussa nro 4 144 130 kuvataan, miten käytetään (1) seosta, jossa on substi-25 tuoimaton tai substituoitu polyalkoholi, polyeetteri, po- lyvinyylipyrrolidoni tai polysakkaridi, jonka molekyyli-paino on korkea, sekä epäorgaanista suolaa, (2) seosta, jossa on ainakin kahta edeltävää polymeeriä, joiden mole-kyylipaino on korkea, solunsisäisten entsyymien talteen-30 ottamiseksi vesiliuoksesta, johon ne ovat vapautuneet soluista. Käytettäessä polyetyleeniglykolin ja epäorgaanisen suolan seosta haluttu solunsisäinen entsyymi menee päällimmäiseen polyetyleeniglykolikerrokseen kun taas solu jäte ja muut fermentaatiotuotteet menevät alempaan suo-35 lapitoiseen kerrokseen. Tässä viitteessä julkistetaan, li 98642 3 että jakaumakertoimet erilaisille glykolikerroksesta talteenotetuille entsyymeille olivat noin 0,3 käsiteltäessä normaalia solumassaa, jolloin niitä voitiin nostaa noin 3:een, kun jäädytetyt solut sekoitettiin veteen ja 5 rikottiin niiden entsyymien vapauttamiseksi. Kuitenkaan tässä viitteessä ei selosteta tai ehdoteta yksittäisen entsyymin selektiivistä talteenottoa, eikä etenkään kymo-siinin fermentaatioliemestä, joka sisältää useamman kuin yhden entsyymin.

10 Vastaavasti US-patenttijulkaisussa nro 4 728 613 julkistetaan menetelmä solunulkoisesti tuotettujen entsyymien, kuten proteaasin, amylaasin ja mikrobisen ren-niinin, talteenottamiseksi fermentaatiotäysliemestä käyttäen epäorgaanista suolaa yhdessä polymeerin kanssa, joka 15 on valittu ryhmästä, jonka muodostavat polyetyleeniglyko- li, polyetyleeniglykolin amiinijohdannainen, polyetylee-niglykolin karboksylaattijohdannainen, polypropyleenigly-koli, polypropyleeniglykolin amiinijohdannainen, polypro-pyleeniglykolin karboksylaattijohdannainen, poly(etylee-20 niglykoli)esteri, polyetyleeni-imiini, trimetyyliaminopo- lyetyleeniglykoli, polyvinyylialkoholi, polyvinyylipyrro-lidoni ja mainittujen seokset. Vaikka tämän viitteen esimerkeissä julkistetaan päästävän jakaumakertoimiin aina noin 80 asti tällaisille solunulkoisille entsyymeille, 25 tässä viitteessä ei spesifisesti julkisteta kymosiinin talteenottoa polyetyleeniglykoli/suola-seoksesta eikä siinä julkisteta kymosiinin selektiivistä talteenottoa fermentaatioliemestä, joka sisältää useamman kuin yhden entsyymin.

30 Samoin Kula et ai., "Purification of Enzymes by

Liquid-Liquid Extraction" (suom. "Entsyymien puhdistus neste-nesteuutolla"), kuvaavat lukuisia menetelmiä entsyymien puhdistamiseksi neste-nesteuutolla. Lukuisten julkistettujen menetelmien puitteissa Kula et ai. julkis-35 tavat, että lisäämällä polyetyleeniglykolin ja epäorgaa- 98642 4 nisen suolan seosta entsyymin sisältävään vesiliuokseen muodostuu kaksifaasisysteemi, Jossa polyetyleeniglykoli-faasi sisältää entsyymin. Kula et ai. julkistavat edelleen sivulla 111, että polymeerin (polyetyleeniglykoli) 5 muodostava faasi voidaan poistaa entsyymistä adsorboimalla entsyymi ioninvaihtajiin; pesemällä pois polymeerin muodostava faasi; ja ottamalla sitten talteen entsyymi. Kuitenkaan tässä viitteessä ei spesifisesti julkisteta kymosiinin talteenottoa polyetyleeniglykoli/suola-seosta 10 käyttäen eikä siinä julkisteta kymosiinin selektiivistä talteenottoa fermentaatioliemestä, joka sisältää useamman kuin yhden entsyymin.

Toisaalta US-patenttijulkaisussa nro 4 508 825 julkistetaan, että solunulkoinen proteaasi ja amylaasi, 15 jotka on tuotettu yhdessä fermentoimalla niitä tuottamaan kykenevää mikro-organismia, erotetaan lisäämällä polyety-leeniglykolia ja kationista epihalogeenihydriini/poly-amiini-kopolymeeriä tai dekstraanipolymeeriä fermentaa-tioalustaan ja antamalla polymeerien erottua faaseiksi 20 runsaasti proteaasia sisältävän faasin ja runsaasti amy-laasia sisältävän faasin muodostamiseksi.

Samoin US-patenttijulkaisussa nro 4 591 563 julkistetaan menetelmä dekstraanisakkaraasientsyymin samanaikaiseksi puhdistamiseksi ja konsentroimiseksi sakkaroo-25 siä sisältävästä kasvualustasta. Erityisesti julkistetun menetelmän mukaan lisätään polyeetteriä kuten polyetylee-niglykolia kahden faasin muodostamiseksi; ensimmäinen on raskas runsaasti dekstraania sisältävä faasi, joka sisältää konsentroidun ja puhdistetun dekstraanisakkaraasient-30 syymin, ja toinen on kevyempi runsaasti polyeetteriä sisältävä faasi, joka sisältää epäpuhtautena läsnä olevia entsyymiaktiivisuuksia, jotka poistetaan.

Edeltävä huomioon ottaen on ilmeistä, että alan teknisen tason puitteissa ei julkisteta mikrobiologisesti 35 tuotetun kymosiinin talteenottoa fermentaatioliemestä 98642 5 käyttäen kaksifaasineste-nesteuuttomenetelmää, jonka ja-kaumakertoimet kyrnosiinille ovat korkeammat kuin noin 85.

Edelleen on ilmeistä, ettei alan teknisen tason puitteissa julkisteta kymosiinin selektiivistä talteenot-5 toa fermentaatioliemestä, joka sisältää muitakin fermen-taatioentsyymejä kuin kymosiinia, eli valtaosa kymosii-nistä otetaan talteen yhdestä kerroksesta kun taas valtaosa muista fermentaatioentsyymeistä otetaan talteen toisesta kerroksesta.

10 Toisaalta kymosiinin teollisen tai kaupallisen mittakaavan tuotantoa mikrobiologisella aktiivisuudella ja kymosiinin sittemmin seuraavaa puhdistusta helpottavat suuresti kymosiinin korkeat jakaumakertoimet neste-neste-kaksifaasisysteemissä sekä myös kymosiinin selektiivinen 15 talteenotto muista liemen sisältämistä fermentaatioentsyymeistä käytettäessä tällaisia kaksifaasisysteemejä.

Täten tämän keksinnön päämääränä on antaa käyttöön tehokkaita menetelmiä mikrobiologisesti tuotetun kymosiinin talteenottamiseksi entsyymien vesiseoksista, jotka on 20 tuotettu fermentoimalla tai muutoin mikrobiologisella aktiivisuudella, ja erityisesti kymosiinin tuottamiseksi kaupallisessa mittakaavassa.

Tämän keksinnön toinen päämäärä on antaa käyttöön talteenottomenetelmä mikrobiologisesti tuotetulle kymosii-25 nille käyttäen neste-nestekaksifaasisysteemiä, jonka jakaumakertoimet kyrnosiinille ovat suurempia kuin noin 85.

Tämän keksinnön päämääränä on edelleen antaa käyttöön talteenottomenetelmä mikrobiologisesti tuotetulle kyrnosiinille käyttäen neste-nestekaksifaasisysteemiä, jol-30 la saadaan kymosiinin selektiivinen talteenotto muista fermentaatioliemen sisältämistä polypeptideistä mukaan lukien muista entsyymeistä.

Tämän keksinnön päämääränä on edelleen antaa käyttöön menetelmä mikrobiologisesti tuotetun kymosiinin tal-35 teenottamiseksi ja puhdistamiseksi.

98642 6 Näihin ja muihin päämääriin päästään esillä olevan keksinnön mukaan kuten esitetään oheisessa yhteenvedossa keksinnöstä, yksityiskohtaisessa kuvauksessa keksinnöstä, esimerkeissä ja patenttivaatimuksissa.

5 Yhteenveto keksinnöstä

Yhtenä näkökohtana tämä keksintö on menetelmä mikrobiologisesti tuotetun kymosiinin talteenottamiseksi vesipitoisesta fermentaatioliemestä, joka sisältää lisäksi fermentaatiopolypeptidejä, jonka menetelmän mukaan fermen-10 taatioliemeen lisätään tehokas määrä polyetyleeniglykolia (PEG) ja epäorgaanista suolaa kaksifaasisysteemin muodostamiseksi , fermentaatioliemi-polyetyleeniglykoli-epäor- gaaninen suola -seoksen annetaan erottua kymosiinia runsaasti, fermentaatiopolypeptidejä niukasti sisältäväksi 15 polymeerifaasiksi ja kymosiinia niukasti, fermentaatiopo lypeptidejä runsaasti sisältäväksi suolafaasiksi ja kymosiinia runsaasti, fermentaatiopolypeptidejä niukasti sisältävä polymeerifaasi otetaan talteen.

Yllättäen tällä talteenottomenetelmällä saadaan 20 kymosiinin selektiivinen talteenotto fermentaatiopolypep- tideistä, joita esiintyy fermentaatioliemessä, ja saadaan samoin kymosiinin talteenotolle jakaumakertoimia, jotka ovat suurempia kuin noin 85 ja edullisesti suurempia kuin noin 100.

25 Yleensä ottaen fermentaatioliemen pH voi olla mikä tahansa pH, jossa kymosiini on stabiili, eli noin 6,5 tai alle. Kuitenkin edullisessa suoritusmuodossa on todettu, että käyttämällä alempia pH-arvoja, eli pH:ta 3 tai alle, ja edullisesti pH:ta noin 2 - noin 2,5, fermentaatiolie-30 meen saadaan korkeampia jakaumakertoimia (korkeampi se- lektiivisyys) kymosiinin erotukselle polyetyleeniglykoli-faasiin, jopa niinkin korkeita kuin 1 000 tai enemmän, verrattuna pH-arvojen > 3 - noin 6,5 käyttöön.

Täten esillä olevan keksinnön edullinen menetelmä-35 näkökohta koskee menetelmää mikrobiologisesti tuotetun li 98642 7 kymosiinin talteenottamiseksi vesipitoisesta fermentaa-tioliemestä, joka sisältää lisäksi fermentaatiopolypepti-dejä, jonka menetelmän mukaan fermentaatioliemen pH säädetään alle noin 3:ksi, minkä jälkeen fermentaatioliemeen 5 lisätään tehokas määrä polyetyleeniglykolia (PEG) ja epäorgaanista suolaa kaksifaasisysteemin muodostamiseksi, fermentaatioliemi-polyetyleeniglykoli-epäorgaaninen suola -seoksen annetaan erottua kymosiinia runsaasti, fermentaa-tiopolypeptidejä niukasti sisältäväksi polymeerifaasiksi 10 ja kymosiinia niukasti, fermentaatiopolypeptidejä runsaasti sisältäväksi suolafaasiksi ja kymosiinia runsaasti, fermentaatiopolypeptidejä niukasti sisältävä polymeerit aasi otetaan talteen.

Tämän keksinnön seuraavana näkökohtana on todettu, 15 että kymosiini voidaan erottaa polyetyleeniglykolifaasista saattamalla polyetyleeniglykolifaasi kosketuksiin io-ninvaihtohartsin kanssa olosuhteissa, joissa kymosiini sitoutuu hartsiin. Näissä olosuhteissa polyetyleeniglyko-li kulkee hartsin läpi, minkä jälkeen kymosiini otetaan 20 talteen hartsista. Täten esillä olevan keksinnön tämä me-netelmänäkökohta koskee menetelmää mikrobiologisesti tuotetun kymosiinin talteenottamiseksi ja puhdistamiseksi vesifermentaatioliemestä, joka sisältää lisäksi fermentaatiopolypeptidejä, jonka menetelmän mukaan: 25 a) fermentaatioliemeen lisätään tehokas määrä po lyetyleeniglykolia (PEG) ja epäorgaanista suolaa kaksifaasisysteemin muodostamiseksi; b) fermentaatioliemi-polyetyleeniglykoli-epäorgaa-ninen suola -seoksen annetaan erottua kymosiinia runsaas- 30 ti, fermentaatiopolypeptidejä niukasti sisältäväksi polyetyleeniglykolif aasiksi ja kymosiinia niukasti, fermentaatiopolypeptidejä runsaasti sisältäväksi suolafaasiksi; c) kymosiinia runsaasti sisältävä, fermentaatiopo-lypeptidejä niukasti sisältävä polyetyleeniglykolifaasi 35 otetaan talteen; 98642 8 d) kymosiinia runsaasti, fermentaatiopolypeptidejä niukasti sisältävä polyetyleeniglykolifaasi saatetaan kosketuksiin ioninvaihtohartsin kanssa olosuhteissa, joissa kymosiini sitoutuu hartsiin ja polyetyleeniglykoli kulkee 5 hartsin läpi; ja e) kymosiini otetaan talteen hartsista.

Keksinnön tämän näkökohdan mukaan ja edellä esitetyistä syistä edullisesti alkuperäisen fermentaatioliemen pH säädetään noin 3:ksi tai alle ennen polyetyleenlglyko- 10 li/suolan lisäämistä liemeen. Samoin edullisesti pH:n tulee pysyä alle noin 3:ssa PEG-faasin erotuksen sekä PEG-faasin kosketuksiin saattamisen ioninvaihtohartsin kanssa aikana.

Yksityiskohtainen kuvaus keksinnöstä 15 Erilaisten entsyymien erotus vesiliuoksista käyt täen polymeerejä kuten polyetyleeniglykolia, jonka mole-kyylipaino vaihtelee, yhdessä muiden polymeerien, esim. dekstraanin, tai epäorgaanisten suolojen kanssa tunnetaan alalla. Tämä keksintö koskee kuitenkin osaltaan sitä 20 odottamatonta havaintoa, että varsin korkeisiin jakauma-kertoimiin mikrobisesti tuotetun kymosiinin, etenkin so-lunulkoisesti tuotetun kymosiinin, uutossa voidaan päästä lisäämällä riittävä määrä sekä polyetyleeniglykolia että epäorgaanista suolaa fermentaatioliemeen kaksifaasisys-25 teemin muodostamiseksi. Näissä olosuhteissa kymosiini lähes kokonaisuudessaan jakautuu polyetyleeniglykolifaa-siin. Tätä osoittavat kymosiinin jakaumakertoimet poly-etyleeniglykolifaasiin, jotka ovat korkeampia kuin noin 85 ja edullisesti korkeampia kuin noin 100.

30 Edelleen tämä keksintö kohdistuu samoin siihen odottamattomaan havaintoon, että uuttaminen (talteenotto) fermentaatioliemestä polyetyleeniglykolia ja epäorgaanista suolaa lisäämällä on erittäin selektiivinen mikrobisesti tuotetulle kymosiinille. Tämä merkitsee, että tämä 35 uuttomenetelmä on selektiivinen kymosiinille ja että muut

II

98642 9 fermentaatioliemen sisältämät polypeptidit (mukaan lukien muut entsyymit) jäävät ensisijaisesti kymosiinia niukasti sisältävään suolafaasiin. Tämä jälkimmäinen havainto on yllättävä etenkin otettaessa huomioon seikka, että alal-5 la, joka käsittelee entsyymien talteenottoa vesiliuoksesta lisäämällä polymeeriä ja epäorgaanista suolaa, ei opasteta yhden entsyymin selektiivistä talteenottoa muista liuoksessa esiintyvistä entsyymeistä.

Kuitenkin ennen kuin tätä keksintöä käsitellään 10 yksityiskohtaisesti määritellään ensin seuraavat ilmaisut: "Mikrobiologisesti tuotettu kymosiini" merkitsee mikrobiologisesti tuotettua polypeptidiä, joka sisältää sikäli riittävän aminohappohomologian luontaisesti esiin-15 tyvään kymosiiniin nähden, että sillä on luontaisesti esiintyvän kymosiinin entsymaattinen aktiivisuus, ja jolla on luontaisesti esiintyvän kymosiinin jakaumaominaisuu-det tässä kuvatussa neste-nestekaksifaasivesisysteemissä. Mikrobiologisesti tuotettu kymosiini valmistetaan yleensä 20 viljelemällä (fermentoimalla) isäntämikro-organismia, eli rihmaista sientä, bakteeria, hiivaa ja samankaltaisia, jotka on transformoitu yhdistelmä-DNA-sekvenssillä, joka koodittaa kymosiinin kokonaisuudessaan tai riittävän osan siitä, jotta tuotetulla polypeptidillä on luontaisesti 25 esiintyvän kymosiinin entsymaattinen aktiivisuus. Katso esimerkiksi US-patenttijulkaisu 5 364 770 sekä US-patent-tijulkaisu nro 4 666 847, joissa julkistetaan sopivia transformoituja isäntämikro-organismeja, jotka kykenevät muodostamaan mikrobiologisesti tuotettua kymosiinia.

30 Mikrobiologisesti tuotettu kymosiini voidaan edel leen luokitella solunsisäisesti tai solunulkoisesti tuotetuksi. Spesifisesti solunsisäisesti tuotettu entsyymi on entsyymi, joka tuotetaan isäntäsoluun ja pysyy siinä fer-mentaation aikana ja joka fermentaation päätyttyä on va-35 pautettava solusta, yleensä rikkomalla solu. Solut voi- 98642 10 daan tappaa ja rikkoa tavanomaisesti lämpöä käyttäen. Katso esimerkiksi Wegner et ai., US-patenttijulkaisu nro 4 601 986. Toinen menetelmä, joka on käyttökelpoinen tietyillä mikro-organismeilla, on osmoottisen paineen muut-5 taminen, mikä rikkoo solut. Katso esimerkiksi Aubert et ai., US-patenttijulkaisu 4 299 858. Toinen tavanomainen menetelmä, jota käytetään solujen rikkomiseksi, on entsyymien lisääminen, jotka rikkovat soluseiniä tai -memb-raaneja. Esimerkkejä tästä menetelmästä julkistavat Sugi-10 yama, US-patentti julkaisu nro 3 816 260; Kobayashi et ai., US-patentti julkaisu nro 3 890 198; ja Kitamura et ai., US-patentti julkaisu nro 3 917 510. Edeltävät patenttijulkaisut sisällytetään tähän viitteiksi.

Solunulkoisesti tuotettu entsyymi on entsyymi, 15 jonka mikro-organismi kykenee kuljettamaan soluseinän läpi ja joka siten tavataan fermentaatioliemestä fermentaa-tion päättyessä ilman solujen erityistä jatkokäsittelyä.

"Luontaisesti tuotetulla kymosiinilla" tarkoitetaan kymosiinia, joka on otettu talteen nisäkäslähteistä, 20 mukaan lukien vasikan 4. maha.

"Fermentaatioliemellä" tarkoitetaan kymosiinia sisältävää liuosta, joka saadaan transformoidun isäntäsolun (mikro-organismin) fermentaatiosta, mukaan lukien mahdolliset liemellä sittemmin suoritettavat jatkokäsittelyt. 25 Tällaisia mahdollisia käsittelyvaiheita ovat esimerkiksi solujen (mikro-organismien) tappaminen fermentaatiolie-messä ennen epäorgaanisen suolan ja polyetyleeniglykolin lisäämistä fermentaatioliemeen. Mikro-organismin tappaminen suoritetaan edullisesti tavalla, jota kuvataan US-pa-30 tenttijulkaisussa 5 378 621, joka sisällytetään tähän viitteeksi. Lisäksi joissakin tapauksissa saattaa olla toivottavaa poistaa solut ja/tai solujäte fermentaatioliemestä ennen epäorgaanisen suolan ja polyetyleeniglykolin lisäämistä. Tällainen poistaminen voidaan suorittaa käyt-35 tämällä suodatusvaihetta, jossa poistuu suurin osa kiinto- 98642 11 aineksesta tai se kokonaisuudessaan mukaan lukien solut ja/tal solujäte. Samoin joissakin tapauksissa saattaa olla toivottavaa säätää liemen pH:ta ennen epäorgaanisen suolan ja polyetyleeniglykolin lisäämistä. Samoin solun-5 sisäisesti tuotetun kymosiinin kyseessä ollen yleisesti rikotut solut poistetaan ja otetaan talteen solunsisäiset kappaleet, jotka sisältävät valtaosan kymosiinista, jota uudelleenlaskostamisen jälkeen käsitellään sitten tämän keksinnön mukaisesti.

10 "Fermentaatiopolypeptideillä" tarkoitetaan poly- peptidejä, muita kuin kymosiinia, joita isäntämikro-orga-nismi saattaa tuottaa fermentaation aikana ja jotka kymosiinin ohella sisältyvät fermentaatioliemeen polyetyleeniglykolin ja epäorgaanisen suolan lisäysajankohtana.

15 Tällaisten fermentaatiopolypeptidien tärkeän osan muodostavat entsyymit, joita muodostuu ohessa fermentaation aikana. Esimerkiksi tuotettaessa kymosiinia solunulkoisesti tapaan, jota kuvataan US-patenttijulkaisussa 5 364 770, tulee tuotetuksi myös alfa-amylaasin, happaman fosfataa-20 sin, leu-aminopeptidaasin jne. kaltaisia entsyymejä, jotka täten tavataan fermentaatioliemestä fermentaation päättyessä. Samoin tuotettaessa kymosiinia solunsisäisesti kymosiinin ohella esiintyviin entsyymeihin voi lukeutua mitä tahansa solunulkoisia entsyymejä, jotka ovat tulleet tuo-25 tetuiksi isäntäsoluja fermentoitaessa, sekä solunsisäisiä entsyymejä, jotka vapautuvat rikottaessa isäntäsolut fermentaation päätteeksi kymosiinin vapauttamiseksi.

"Fermentaatiosivutuotteilla" tarkoitetaan ei-poly-peptidituotteita, jotka sisältyvät fermentaatioliemeen 30 ajankohtana, jona polyetyleeniglykoli ja epäorgaaninen suola lisätään fermentaatioliemeen, mukaan lukien esimerkiksi orgaaniset hapot, kompleksiset hiilihydraatit jne.

"Polyetyleeniglykolilla" tarkoitetaan polyetylee-niglykolia, jonka molekyylipaino voi vaihdella ja jota 98642 12 voidaan käyttää kymosiinin uuttamiseksi tämän keksinnön mukaisesti. Polyetyleeniglykolia on saatavana molekyyli-painorajoissa noin 400 - noin 22 000. Tässä käytettäväksi edullisen polyetyleeniglykolin molekyylipainon tulisi ol-5 la noin 600 - noin 12 000. Erityisen edullinen polyety-leeniglykoli on PEG-8000, eli polyetyleeniglykoli, jonka molekyylipaino on noin 8 000. Käytetyn polyetyleeniglykolin valinta riippuu osaltaan sen seoksen koostumuksesta, josta kymosiini on tarkoitus uuttaa, ja osaltaan menetel-10 män kustannustekijöistä sekä muista tekijöistä.

"Epäorgaanisella suolalla" tarkoitetaan mitä tahansa epäorgaanista suolaa, jota voidaan käyttää kymosiinin uuttamiseksi tämän keksinnön mukaisesti. Sopivia epäorgaanisia suoloja ovat esimerkiksi sulfaattisuolat, fos-15 faattisuolat ja samankaltaiset. Edullisia ovat sulfaatti-suolat, mukaan lukien natriumsulfaatti, magnesiumsulfaatti, ammoniumsulfaatti, ja samankaltaiset. Lisäksi sopivien suolojen seoksia voidaan niinikään käyttää, sekä tällaisten suolojen seoksia yhdessä sellaisen suolan 20 (suolojen) kuten natriumkloridin kanssa, joka yksinään ei jakaudu polyetyleeniglykolia sisältävään kaksifaasisys-teemiin, mutta jonka yhdistettynä sopivaan epäorgaaniseen suolaan tiedetään parantavan entsyymien jakaumakertoimia.

"Jakaumakerroin (K)" määritellään yhtälöllä: 25 K = Ct/Cb jossa Ct merkitsee jakautuneen yhdisteen tasapainopa toisuutta päälifaasissa ja Cj, merkitsee jakautuneen 30 yhdisteen tasapainopitoisuutta pöhjafaasissa. Täten on ilmeistä, että jakautuneen yhdisteen kvantitatiivinen määrä kummassa tahansa faasissa riippuu sen jakaumakertoimesta sekä faasien tilavuudesta. Toisin sanoen, jos jakautuneen yhdisteen jakaumakerroin on yksi (yhdiste on tasaisesti 35 jakautunut pääli- ja pohjafaaseihin), faasit sisältävät li 98642 13 samat määrät jakautunutta yhdistettä vain, jos faasien tilavuudet ovat samat. Jos päälifaasin tilavuus on 10 % poh-jafaasin tilavuudesta, niin silloin kun jakaumakerroin on yksi, päälifaasi sisältää vain 10 % jakautunutta yhdistet-5 tä. Edeltävä huomioon ottaen on edelleen ilmeistä, että jakautuneen yhdisteen hyvin korkea jakaumakerroin on varsin arvokas, koska se mahdollistaa suurten määrien tätä yhdistettä talteenoton ylemmästä faasista silloinkin, kun ylemmän faasin tilavuus on suhteellisen pieni verrattuna 10 pöhjafaasiin. Täten esillä olevassa keksinnössä hyvin kor keat jakaumakertoimet mahdollistavat pienempien määrien polyetyleeniglykolia käytön samalla, kun edelleen päästään hyvin korkeisiin kymosiinisaantoihin.

"Isoelektrisellä pisteellä (IP)" tarkoitetaan 15 pH:ta, jossa polypeptidi on sähköstaattisesti neutraali, eli polypeptidissä on sama lukumäärä positiivisesti ja negatiivisesti varattuja funktionaalisuuksia. Kymosiinin isoelektrinen piste on noin 4,6. Isoelektrisen pisteensä alittavassa pH:ssa kymosiinilla on positiivinen nettova-20 raus; ja isoelektrisen pisteensä ylittävässä pH:ssa kymosiinilla on negatiivinen nettovaraus.

"Ioninvaihtohartsilla" tarkoitetaan proteiinien kanssa yhteensopivaa hartsimaista materiaalia, joka kykenee sitoutumaan sähköstaattisesti varattuihin yhdistei-25 siin. Ioninvaihtohartseja tunnetaan hyvin alalla ja niihin lukeutuu sekä kationin- että anioninvaihtohartseja.

Tämän keksinnön käytännössä kymosiiniliuos saatetaan kosketuksiin ioninvaihtohartsin kanssa olosuhteissa, joissa kymosiini sitoutuu hartsiin. Se, käytetäänkö esil-30 lä olevassa keksinnössä kationin- vai anioninvaihtohart-sia, riippuu polyetyleeniglykolifaasin pH:sta, eli siitä, onko liuoksen pH kymosiinin isoelektrisen pisteen ylä- vai alapuolella. Täten kymosiinia sisältävän liuoksen kosketuksiin saattaminen ioninvaihtohartsin kanssa olo-35 suhteissa, joissa kymosiini sitoutuu hartsiin, viittaa < 98642 14 pelkästään siihen, että liuoksen pH säädetään kymosllnln isoelektrisen pisteen ylä- tai alapuolelle siten, että kymosiini sitoutuu käytettyyn hartsiin.

Liuoksen pH on yleensä noin 6,5 tai alle, joskaan 5 pH-arvot isoelektrisen pisteen läheisyydessä, eli pH:t noin 3,6 - noin 5,0, eivät ole edullisia, mikä johtuu ky-mosiinin alhaisesta sähköstaattisesta nettovarauksesta, joka alentaa sen tehoa hartsiin sitoutumisessa.

Lisäksi pidettäessä polyetyleeniglykolifaasi 10 (liuos) pH:ssa 3,0 - 5,0 kymosiinissa tapahtuu tehokkaampi autolyysi, vaikka autolyysi on huomattavasti hitaampi polyetyleeniglykoliliuoksessa kuin vedessä. Joka tapauksessa vesipitoisen polyetyleeniglykolifaasin pitäminen lukemissa 3,0 - 5,0 johtaa jonkin asteiseen autolyysistä 15 johtuvaan hävikkiin kymosiinisaannossa. Täten käytettäes sä kationinvaihtohartsia liuoksen pH pidetään edullisesti alle noin 3,0:ssa; kun taas käytettäessä anioninvaihto-hartsia pH pidetään edullisesti yli noin 5,0:ssa.

Edullisesti edellä mainituista syistä polyetylee-20 niglykoliliuoksen pH on noin 3 tai vähemmän, edullisesti alle noin 3, ja edullisemmin noin 2 - noin 2,5. Käytettäessä alhaisia pH-arvoja on edelleen todettu, että fer-mentaatiosivutuotteet kulkevat vaikeuksitta hartsin läpi, kun taas korkeammissa pH-arvoissa (5 ja yli) sekä an-25 ioninvaihtohartsia käytettäessä jotkut fermentaatiosivu- tuotteet sitoutuvat irreversiibelisti anioninvaihtohart-siin, mikä lyhentää sen käyttöikää.

Edullisia kationinvaihtohartseja käytettäviksi tässä keksinnössä ovat esimerkiksi IBF SP Spherodex, 30 Pharmacia SP-Sephadex, Indion SP-2, IBF SP-Trisacryl ja samankaltaiset. Edullisia anioninvaihtohartseja käytettäviksi tässä keksinnössä ovat esimerkiksi IBF Q Spherodex, Pharmacia Q-Sephadex, Indion Q-2, IBF Q-Trisacryl ja samankaltaiset .

Il 98642 15 Tämän keksinnön mukaiset menetelmät ovat käyttökelpoisia mikrobisesti tuotetun kymosiinin talteenottami-seksi ja/tai puhdistamiseksi. Mikrobisesti tuotettua ky-mosiinia talteenotettaessa ja puhdistettaessa voidaan 5 käyttää fermentaatiolientä tai -seosta kokonaisuudessaan epäpuhtaassa muodossaan tai haluttaessa fermentaatioseos voidaan ensin suodattaa kiintoaineksen poistamiseksi valtaosin tai kokonaisuudessaan, minkä jälkeen nestemäistä suodosta käytetään tämän keksinnön mukaisissa menetelmis-10 sä.

Tämän keksinnön yhtenä näkökohtana mikrobisesti tuotettu kymosiini otetaan talteen lisäämällä fermentaa-tioliemeen tehokas määrä polyetyleeniglykolia (PEG) ja tehokas määrä epäorgaanista suolaa kaksifaasisysteemin 15 muodostamiseksi. Saadun liuoksen annetaan seistä sen erottamiseksi kymosiinia runsaasti, fermentaatiopolypep-tidejä niukasti sisältäväksi polyetyleeniglykolifaasiksi ja kymosiinia niukasti, fermentaatiopolypeptidejä runsaasti sisältäväksi suolafaasiksi. Kymosiinia runsaasti, 20 fermentaatiopolypeptidejä niukasti sisältävä polyetylee- niglykolifaasi otetaan sitten talteen tavanomaisilla tekniikoilla.

On todettu, että näissä olosuhteissa päästään kymosiinin jakaumakertoimiin polyetyleeniglykolifaasiin, 25 jotka ovat korkeampia kuin 85 ja edullisesti korkeampia kuin 100. Vaikka polyetyleeniglykoliuutto on käyttökelpoinen kymosiinin talteenottamiseksi korkeahkoilla pH-ta-soilla, eli pH 6,5 tai alle, se on tehokkaampi suoritettaessa menetelmä pH:ssa alle noin 3. Tällaisissa alhai-30 semmissa pH-arvoissa voidaan päästä jakaumakertoimiin ai na 1 000 tai enemmän. Korkeat jakaumakertoimet ovat erityisen edullisia, koska ne mahdollistavat pienempien määrien polyetyleeniglykolia käytön haluttuun kymosiinin erotukseen fermentaatioliemestä pääsemiseksi, mikä puo-35 lestaan helpottaa kymosiinin myöhempää erotusta polyety- 98642 16 leeniglykolista, eli läsnä on vähemmän erotettavaa poly-etyleeniglykolia.

On edelleen todettu, että tuloksena yhdestä yksittäisestä uutosta polyetyleeniglykolifaasi voi sisältää 5 niinkin paljon kuin 95 % tai enemmän fermentaatioliemen alunperin sisältämästä kokonaiskymosiinista ja sisältää hyvin vähän jos lainkaan fermentaatiopolypeptidejä tai fermentaatiosivutuotteita liemestä. Täten sen lisäksi, että esillä olevan keksinnön tämä näkökohta antaa käyt-10 töön keinon oleellisesti kaiken mikrobisesti tuotetun ky-mosiinin, joka fermentaatioliemeen sisältyy, talteenotta-miseksi, se niinikään suo mahdollisuuden kymosiinin selektiiviseen talteenottoon liemestä. Tämä selektiivisyys kymosiinin talteenotolle mahdollistaa sekä kymosiinin 15 talteenoton fermentaatioliemestä että kymosiinin erotuksen valtaosasta fermentaatiopolypeptidejä ja fermentaatiosivutuotteita, jotka ovat tulleet tuotetuiksi ohessa fermentaatiossa. Täten ottamalla kymosiini talteen tämän keksinnön mukaan saadaan polyetyleeniglykolifaasi, jossa 20 kymosiinissa on epäpuhtautena tällaisia fermentaatiopoly-peptidejä ja fermentaatiosivutuotteita ainakin noin 75 % vähemmän, ja edullisesti ainakin noin 90 % vähemmän, verrattuna kymosiinin epäpuhtautena sisältämiin tällaisiin fermentaatiopolypeptideihin ja fermentaatiosivutuottei-25 siin ennen uuttoa, eli fermentaatioliemessä.

Tämän keksinnön toisena näkökohtana uutetun kymosiinin sisältävä polyetyleeniglykolifaasi erotetaan yhdestä tai useammasta muusta faasista ja polyetyleeniglykolifaasi saatetaan kosketuksiin ioninvaihtohartsin kans-30 sa, jolloin pH pidetään sellaisena tai säädetään sellaiseksi, että kymosiini sitoutuu hartsiin. Koska polyety-leeniglykolilla ei ole varausta näissä olosuhteissa, se kulkee hartsin läpi saaden siten aikaan kymosiinin puhdistuksen polyetyleeniglykolista. Täten kun eristetty po-35 lyetyleeniglykolifaasi, joka sisältää uutetun kymosiinin, 98642 17 saatetaan kosketuksiin ioninvaihtohartsin kanssa olosuhteissa, joissa kymosiini sitoutuu hartsiin, kymosiini oleellisesti kokonaisuudessaan poistuu polyetyleeniglyko-lista ja sitoutuu ioninvaihtohartsiin ja polyetyleenigly-5 köli kulkee hartsikolonnin läpi. Ensimmäisen kosketuksiin saattamisen jälkeen hartsi pestään joko vedellä tai vedellä ja suolalla, edullisesti siten, ettei kymosiini irtoa hartsista, jäljellä olevan polyetyleeniglykolin poistamiseksi. Sitten kymosiini eluoidaan kolonnista käyttäen 10 suolaliuosta ja puskuria, joka pidetään pH:ssa, jossa kymosiini poistuu hartsista. Koska selektiivisyys kymosii-nin talteenotolle on korkea, ei tarvitse käyttää gra-dienttia tai hartsin vaiheittaista eluointia, koska oleellisesti ainoa entsyymi tai materiaali, joka on si-15 toutunut hartsiin polyetyleeniglykolifaasista ja sitten irronnut hartsista, on kymosiini. Tämän vuoksi kymosiini voidaan eluoida yhdessä panosvaiheessa suolaliuosta käyttäen ja nostaen tai laskien pH:ta (riippuen luonnollisesti siitä, käytetäänkö kationin- vai anioninvaihtohart-20 siä), jotta hartsiin sitoutunut kymosiinisisältö kokonaisuudessaan saadaan eluoiduksi yhtenä eränä. Edullisesti eluointiliuokseen lisätään suolaa avustamaan eluoinnin nopeudessa tai asteessa, tai joissain tapauksissa, eli anioninvaihtohartsin kyseessä ollen, kymosiinin eluution 25 hartsista saamiseksi. Suoloja käytetään edullisesti eluointiliuoksen kanssa, sillä kymosiinia myydään tavallisesti kaupallisessa muodossa suolaliuoksena ja siten on kätevää sisällyttää suola kymosiiniin tässä vaiheessa.

Vaikka korkeampia pH-tasoja voidaan käyttää kautta 30 menetelmän (pH:t aina noin 6,5:een), polyetyleeniglyko-li/epäorgaaninen suola -seoksen teho kymosiinin uutossa fermentaatioliemestä ja siten menetelmäteho eivät ole niin korkeita kuin pidettäessä pH alhaisena kautta uuttovai-heen. Tämän vuoksi edullisesti käytetään alhaista pH:ta ja 98642 18 siten kationinvaihtohartsia menetelmän kokonaisuudessaan tehon nostamiseksi.

Kun edeltävän keksinnön edulliset näkökohdat yhdistetään suorittamalla polyetyleeniglykoliuutto pH:ssa 5 noin 3 tai alle ja saattamalla erotettu polyetyleenigly-kolifaasi kosketuksiin kationinvaihtohartsin kanssa samalla kun pH pidetään alhaisena, on todettu, että yhdellä polyetyleeniglykoliuutolla ja yhden läpäisyn kosketuksiin saattamisella ioninvaihtohartsin kanssa saadaan talteen 10 noin 90 - 95 % alkuperäisen fermentaatioliemen sisältämästä kokonaiskymosiinista.

Toisaalta käyttämällä korkeampaa pH:ta polyetylee-niglykoliuuttovaiheessa sekä anioninvaihtohartsia samalla kun pH pidetään kymosiinin isoelektrisen pisteen yläpuo-15 lella saadaan myös hyväksyttäviä tuloksia, vaikkakin tässä suoritusmuodossa hartsin käyttöikää lyhentää irrever-siibelisti sitoutuneiden fermentaatiosivutuotteiden kerääntyminen. Käytettäessä korkeampaa pH:ta kymosiinin uuttamiseksi tämä jälkimmäinen ongelma voidaan välttää 20 yksinkertaisesti säätämällä polyetyleeniglykoliuutteen pH kymosiinin isoelektrisen pisteen alapuolelle ja edullisesti noin pH:hon 3,6 tai alle ja edullisemmin noin pH:hon 3 tai alle, minkä jälkeen kymosiini saatetaan kosketuksiin kationinvaihtohartsin kanssa.

25 Sen korkean tehon lisäksi, joka saadaan kymosiinin talteenotolle käyttämällä tässä kuvattua polyetyleenigly-koli/epäorgaaninen suola -seosta, on edelleen todettu, että kymosiinin liukoisuus polyetyleeniglykoliin on ilmeisesti niin korkea, että kymosiini siirtyy vesifaasista 30 polyetyleeniglykolifaasiin hyvin nopeasti. Aika, joka tarvitaan kymosiinin uuttamiseksi polyetyleeniglykolifaa-siin, on tavallisesti niin lyhyt, ettei se ole merkittävä menetelmäsuunnittelutekijä. Tämä menetelmä on siten hyvin tehokas ja taloudellinen käyttää ja se on helposti muu- 98642 19 tettavissa suurempaan mittakaavaan kaupallista tuotantoa silmällä pitäen.

Kuten Ilmeistä on ja käytetystä pH:sta riippumatta tässä kuvatussa menetelmässä kymosiini siirretään vesi-5 seoksesta hydrofobisempaan polyetyleeniglykolifaasiin.

Tätä pitää käynnissä ainakin osittain suolapitoisuus ei-polyetyleeniglykolifaasissa tai -faaseissa. Jos käytetään polyetyleeniglykolia, jonka molekyylipaino on alhainen, polyetyleeniglykolifaasi on vähemmän hydrofobinen ja kor-10 keampi suolapitoisuus on tarpeen ei-polyetyleeniglykoli- faas(e)issa, mikä lisää käyttökustannuksia. Jos käytetään hydrofobisempaa polyetyleeniglykolia, jonka molekyylipaino on korkeampi, menetelmässä tarvitaan vähemmän suolaa, mutta erotusnopeus saattaa olla alhaisempi, koska mole-15 kyylipainoltaan korkeamman polyetyleeniglykolin viskosi teetti on korkea. Täten tämän keksinnön mukainen menetelmä voidaan optimoida mihin tahansa nimenomaiseen käyttöön valitsemalla halutut polyetyleeniglykolin molekyylipaino, suolapitoisuus ja muut parametrit, joilla saadaan toivo-20 muksia vastaavat kustannukset. Yksi päämäärä on tavallisesti sen ajan minimointi, joka tarvitaan kymosiinin siirtämiseksi polyetyleeniglykolifaasiin, mutta toinen päämäärä on tavallisesti minimoida suolamäärä, joka käytetään oleellisesti kaiken kymosiinin siirtämiseksi poly-25 etyleeniglykolifaasiin. Vaikka suolapitoisuus ei-polyety- leeniglykolifaaseissa voi olla 20 paino-% tai enemmän, tavallisesti tarvitaan vähemmän kuin noin 15 % tarkoituksenmukaista polyetyleeniglykolia käytettäessä. Esimerkiksi PEG-8000:aa käytettäessä noin 10 - 13 % natriumsul-30 faattia on riittävä. Toisaalta epäorgaanisen suolan mini mipitoisuuden määrää se suolapitoisuus, joka on välttämätön 2-faasisysteemin muodostamiseksi käyttäen polyetyleeniglykolia. Kuitenkin edullisessa suoritusmuodossa epäorgaanisen suolan pitoisuus on noin 8,5 - noin 20 % (w/v) 35 laskettuna fermentaatioliemen tilavuudesta.

98642 20

Samoin edullisesti tässä käytetty polyetyleenigly-kolipitoisuus on vähemmän kuin noin 20, ja edullisemmin vähemmän kuin noin 15, % (w/v) laskettuna fermentaatio-liemen tilavuudesta. Taloudellisuutta ja myöhemmän ero-5 tuksen helppoutta silmällä pitäen käytetään edullisimmin niin vähän polyetyleeniglykolia kuin mahdollista.

Alan ammattilainen kykenee vaikeuksitta määrittämään tässä käytetyn polyetyleeniglykolin ja epäorgaanisen suolan tarkan pitoisuuden.

10 Sitten kun kymosiini on sidottu ioninvaihtohart- siin, polyetyleeniglykolifaasi voidaan ottaa talteen ja käyttää uudestaan keräämällä hartsin läpi kulkenut polyetyleeniglykolifaasi, jota joko käsitellään edelleen kemikaaleilla kuten aktiivihiilellä epäpuhtauksien poista-15 miseksi edelleen tai joka lisätään suoraan takaisin toiseen erään lähtömateriaaleja.

Vastaavasti ioninvaihtohartsi voidaan regeneroida käytettäväksi seuraavien kymosiinia sisältävien polyety-leeniglykolierien kanssa pesemällä ioninvaihtohartsi ve-20 siliuoksella, jonka pH on säädetty tarkoituksenmukaisek si. Esimerkiksi käytettäessä kationinvaihtohartsia se voidaan regeneroida pesemällä se vesiliuoksella, joka sisältää riittävästi rikkihappoa pH:n laskemiseksi noin 2:een.

25 Tämän keksinnön edeltävät näkökohdat, jotka mah dollistavat polyetyleeniglykolin uudelleenkierrätyksen sekä ioninvaihtohartsien uudelleenkäytön, erityisesti tekevät tämän keksinnön mukaisista menetelmistä sopivia tehokkaaseen kaupalliseen ja teolliseen käyttöön teollisten 30 määrien kymosiinia, erityisesti mikrobisesti tuotettua kymosiinia, puhdistamiseksi.

Kun keksintöä nyt on kuvattu yleisessä mielessä, keksintö voidaan ymmärtää paremmin tutustumalla keksinnön seuraaviin suoritusmuotoihin, joita havainnollistetaan 35 seuraavissa esimerkeissä. Kuitenkin tämän keksinnön laa- 98642 21 juuden määräävät oheiset patenttivaatimukset, kun taas seuraavat esimerkit ovat pelkästään havainnollistavia suoritusmuotoja nimenomaisista tavoista, joilla tässä julkistettua keksintöä voidaan harjoittaa.

5 Esimerkkejä

Esimerkki 1 Tämä esimerkki kuvaa kymosiinin talteenottomene-telmää, jossa käytetään vesipohjaista 2-faasipolyetylee-niglykoliuuttoa, jota seuraa kosketuksiin saattaminen io-10 ninvaihtohartsin kanssa elintarvikelaatua edustavan kymosiinin tuottamiseksi. Kymosiini otetaan talteen Aspergillus niger var. awamorin fermentaatiosta. Kuvataan menetelmää, jossa käytetään 3 000 litran fermentoria ja jossa liemisaantotilavuus on noin 2 500 litraa. Kun fermentaa-15 tio on päättynyt, liemi inaktivoidaan säätämällä pH lukemaan 2,0 - 2,5 lisäämällä rikkihappoa sekä lisäämällä etikkahappoa. (Katso US-patenttihakemusjulkaisu 5 378 621, jonka jättivät 13. kesäkuuta 1989 Lawlis et ai. ja joka sisällytetään tähän viitteeksi.) Inaktivaatio-olosuhteita 20 ylläpidetään 1 tunnin ajan fermentaatiolämpötilassa ja ilmavirtauksessa. Tällä inaktivaatiolla päästään riittävään vähennykseen elinkelpoisten solujen lukumäärässä, jotta sitominen poistuu. Inaktivoinnin jälkeen pH pidetään lukemassa 2,0 - 2,5. Inaktivaatioon tarvitaan noin 125 kg 25 rikkihappoa ja 25 kg etikkahappoa.

Lientä uutetaan käyttäen PEG-8000/natriumsulfaat-tisysteemiä pH:ssa 2,0 - 2,5, jolloin laimennetaan 3x vedellä, minkä jälkeen lisätään 4 % (w/v) PEG-8000:aa (75 kg) ja 10,5 % (w/v) kidevedetöntä natriumsulfaattia. 30 Sekoitettaessa PEG/suola-systeemi liemeen kymosiini tulee uutetuksi PEG-faasiin lyhyessä ajassa. Kaksifaasiseos erotetaan käyttäen uuttosentrifugia. Kymosiinia runsaasti sisältävä kevyt PEG-faasi otetaan talteen jatkokäsiteltä-väksi. Tätä menetelmää käytettäessä 2 500 litraa lientä 98642 22 laimennetaan noin 7 500 litraksi PEG-uuttoa silmällä pitäen, ja saadaan noin 700 litraa PEG-faasiuutetta.

Uutetta laimennetaan 3x lisäämällä deionisoitua vettä ja se suodatetaan selluloosakakkujen läpi ennen io-5 ninvaihtovaihetta. Suodatettu uute käytetään läpi 10 litran kolonnin IBF Spherodex SP -kationinvaihtohartsia, jonka hiukkaskoko on 40 - 100 mikronia. Panostettu kolon-ni pestään 30 litralla 6-%:ista NaCl-liuosta, jonka pH on 2. Kolonnia eluoidaan 2 M NaCl-liuoksella ja 50 mM fos-10 faattipuskurilla, jonka pH on 6,0. Ioninvaihtohartsin kapasiteetti on aina noin 60 g kymosiinia litraa kohden hartsia. Kymosiinin sisältävä eluoitu fraktio otetaan talteen jatkokäsittelyä silmällä pitäen. Kolonni regeneroidaan uudelleenkäytettäväksi pesemällä vedellä, jonka pH 15 on säädetty 2:een rikkihapolla. Eluoidusta kymosiiniliuok-sesta tehdään 17-%:ista NaCl:n suhteen kaupalliseen elin-tarvikelaatukäyttöön, tai sitä voidaan prosessoida haluttaessa muihin tarkoituksiin.

Esimerkki 2 20 Tämä esimerkki havainnollisti kymosiinin korkeaa jakaumaa PEG-faasiin, joka saadaan tämän keksinnön mukaisella menetelmällä. Käyttäen samaa fermentaatiolientä kuin edellä esimerkissä 1, joka inaktivoitiin samalla tavalla, seuraavat uutot suoritettiin täysliemellä (näyte 1) sekä 25 suodoksella, joka saatiin siitä pyörötyhjörumpusuodatti-mella (näytteet 2 ja 3). Kaikkia 3 näytettä pidettiin pH:ssa 2 käsittelyä varten ja niitä uutettiin liuoksella, jossa oli 5 % PEG-8000:aa ja 10 % natriumsulfaattia (w/v). Näytteiden 1 ja 2 faasit erotettiin pullosentrifugissa 30 (RC3B) ja näyte 3 erotettiin käyttäen jatkuvatoimista SA-1-laboratoriosentrifugia.

Il 98642 23

Kokonais-

Til. (1) Akt. kymosiini Saalis (CHU/l) (CHU) (%) 5 Näyte 1: Täysliemen uuttaminen

Raakasyöttö 10 30 300 Käsitelty syöttö 15 13 195 PEG-faasi 1,7 206 350 117 10 Jäännös 13 1,5 19 5

Massatase = 122 K = 141 Näyte 2: 15 Suodoksen uuttaminen

Raakasyöttö 14 13,7 192 PEG-faasi 3,3 49 164 85 Jäännös 11,3 0,78 9 5

Massatase = 90 20 K = 62 Näyte 3:

Suodoksen uuttaminen

Raakasyöttö 430 7,16 3078 25 PEG-faasi 62 52,3 3127 104 Jäännös 385 0,24 96 3

Massatase = 107 K = 210 30 (CHU = Chris. Hansen -yksikkö, 1 CHU/ml, seuraa- vissa olosuhteissa:

Substraatti: 110 g alhaisessa lämpötilassa spray-kuivattua rasvatonta maitojauhetta lietetään 1 000 ml:aan 0,05-%:ista kalsiumkloridiliuosta. Maitoa sekoitetaan 30 35 minuutin ajan huoneenlämpötilassa, minkä jälkeen se jäte- 98642 24 tään seisomaan vielä 30 minuutiksi. Maitoa tulisi säilyttää lämpötilassa 4 - 25 °C eikä pitempään kuin 3 tunnin ajan. Maidon pH on noin 6,5.

Lämpötila: 32 °C +/- 0,2 °C termostaatilla varuste-5 tussa vesihauteessa.

Entsyymin lisäys: 25 ml:aan rekonstituoitua rasvatonta maitoa lisätään 0,5 ml entsyymiliuosta, joka on laimennettu siten, että hyytymisajaksi saadaan 380 - 500 sekuntia, 10 hyytymisajaksi saadaan 410 - 460 sekuntia).

Edeltävien massataseiden summa ei ole 100 %, koska menetelmät, joita käytetään tiettyjen arvojen mittaamiseksi, ovat epätarkkoja ja antavat likimääräisiä arvoja. 15 Kuitenkin edeltävät testit havainnollistavat kymosiinin suhteellista jakautumista, johon tällä keksinnöllä päästään ottaen huomioon testimenetelmien kokeellinen virhe.

Esimerkki 3 Tässä esimerkissä samankaltainen PEG-faasi kuin 20 esimerkissä 1 laimennettiin kuten on esitetty lisäämällä deionisoitua vettä ja suodatettiin käyttämällä se kolonneissa, joissa oli 1,0 ml kumpaakin hartsia ja jotka oli tasapainoitettu pH 2:een deionisoidulla vedellä. Virtausnopeus oli 1,0 ml/min, pesussa käytettiin deionisoitua 25 vettä, jonka pH oli 2,0. Eluoinnissa käytettiin 50 mM nat-riumfosfaattia, pH - 5,8, 2 M NaCl (pi).

Il 98642 25

Hartsi: IBF SP- Pharmacia Indion IBF SP-

Spherodex SP-Sepha. SP-2 Trisacryl

Laimennus Laimennus Laimennus Laimennus 5 1:2 1:4 1:2 1:4 1:2 1:4 1:2 1:4

Panostettu (mg) 34,3 34,3 34,3 34,3 34,3 34,3 34,3 17,6

Sitoutumatta jäi (mg) 9,8 3,82 26,5 0,312 34,8 17,6 27,3 0,338 10 Eluoitui (mg) 26,5 26 8,84 21,2 0,32 1,05 10,8 17,3

Massatase (%) 106 87 103 63 102 54 111 100

Esimerkki 4 15 Tämä esimerkki on sama kuin esimerkki 3 lukuunot tamatta, että seuraavia käytettiin moninkertaisessa eluoinnissa: 670 ml SP-Spherodex-hartsia; panostus ja

eluointi 450 ml/min; panostus 1:4-laimennus PEG-uutetta, pH * 2,0; pesu deionisoidulla vedellä, pH 2,0, 2 M NaCl, 20 pH 2,0; eluointi 2 M NaCl-liuoksella, 200 mM Pi, pH 5,8. Nro. Kuvaus Til. (1) CHU/litra CHU

1 aloitus 240 11,07 2656,8 2 tyhjä 1 170 0,69 117,3 3 tyhjä 2 60 7,21 432,6 25 4 DI*-pesu 2,5 0 0 5 NaCl-pesu 7,4 4,89 36,186 6 eluaatti 1 1 1347 1347 7 eluaatti 2 1 924 924 8 eluaatti 3 1 214 214 30 9 eluaatti 4 1 108 108 10 eluaatti 51 25,6 25,6 11 eluaatti 61 13,8 13,8 DI = deionisoitu vesi; Massatase: 121,14; Saanto (% si-35 toutuneesta): 127,13; Kapasiteetti (mg/ml): 51,08 98642 26

Esimerkki 5 Tämä esimerkki on sama kuin esimerkki 4 lukuunottamatta, että 860 ml PEG-uutetta käsiteltiin 1 %:lla "Nuchar SA" -hiiltä 30 minuutin ajan, suodatettiin ja 5 laimennettiin sitten 1:3 ja syötettiin kolonniin, jossa oli 2,5 ml hartsia, jonka petisyvyys oli 3,2 cm. Tulokset olivat seuraavat:

Nro. Kuvaus Til. (1) Mg/litra Mg 10 1 aloitus 2600 75 195 2 tyhjä 2600 22,5 58,5 3 DI 20 15,7 0,314 4 suola 30 137 4,11 5 komposiitti 36 3667 132,0 15 (280 CHU/ml)

Massatase: 194,9 g (100) « 99,9 % 195 g

Saanto sitoutunutta: 132 g (100) = 96,7 % 136,5 g 20 Kapasiteetti: 132 mg = 52,8 g/litra 2,5 ml

Esimerkki 6

Samalla tavalla kuin edellä esimerkissä 2 esite-25 tyssä uuttomenettelyssä mutta käyttäen pH:ta noin 5,8 alla luetellut entsyymit uutettiin vesiliuoksesta neste-neste-2-faasisysteemin polyetyleeniglykolifaasiin, jolloin saatiin seuraavat tulokset (käytettiin puhtaita ent-syymej ä): li 98642 27

Proteiinia Aktiivisuus Jakauma-

Entsyymi (mg/ml) CHU/ml kerroin vasikkakymosiini 1,7 28 87 5 nautapepsiini 1,9 31 31,5 sikapepsiini 2,3 29,7 1,45 E. parasitica asparagiini- happoproteaasi 3,6 27 0,33 M. miehel asparagiini- 10 happoproteaasi 2,4 20,5 0,24 Tämä koe toistettiin, mutta tällä kertaa pH:ssa 2 - 2,5, jolloin tulokset olivat seuraavat: 15 Proteiinia Aktiivisuus Jakauma-

Entsyymi (mg/ml) CHU/ml kerroin vasikkakymosiini 1,2 89 >943 nautapepsiini 1,3 50 >462 20 sikapepsiini 1,6 23,7 >206 E. parasitica asparagiini- happoproteaasi 2,5 15,2 1,18 M, miehei asparagiini- happoproteaasi 1,7 48 0,94 25

Edeltävät tulokset osoittavat, että kun kymosii-nilla saadaan erinomaisia jakaumakertoimia, eli yli noin 85 kummassa tahansa pH:ssa 5,8 tai 2 - 2,5, nautapepsii-nillä ja sikapepsiinillä saadaan erinomaisia jakaumaker-30 toimia vain alhaisemmassa pH:ssa. Kuitenkaan sen paremmin nautapepsiini kuin sikapepsiinikään eivät ole fermentaa-tioliemessä esiintyviä polypeptidejä. Toisaalta edeltävät tulostiedot osoittavat edelleen, että mikrobirenniinillä, eli E^ parasitica -asparagiiniproteaasilla ja miehei 35 -asparagiiniproteaasilla ei ole merkittäviä jakaumaker- 98642 28 toimia testatussa sen paremmin alhaisemmassa kuin korkeammassakaan pH:ssa.

Esimerkki 7

Seuraava esimerkki koskee jakaumakertoimien pH:ssa 5 2,5 ja 5,5 suoraa vertailua kymosiinille sekä alfa-amy- laasille, happamalle fosfataasille, leu-aminopeptidaasi-amylaasille ja glukoamylaasille (GAM), joita esiintyy Aspergillus niger var. awamori -fermentaatioliemessä. Uutto suoritettiin kuten edellä esimerkissä 2 seuraavin alla 10 mainituin poikkeuksin:

Kymosiini Lähtö- Jakauma- Näyte pit. CHU/ml kerroin 15 pH 2,5 ei soluja* 7 98 pH 5,5 ei soluja 5,9 92 pH 2,5 soluja15 6,3 96 pH 5,5 soluja0 5,9 88 20

Alfa-amylaasi Lähtö- Jakauma- Näyte pit. IU/ml kerroin 25 pH 2,5 ei soluja* 19 400 lähestyy 0 pH 5,5 ei soluja* 19 400 lähestyy 0 pH 2,5 solujab 19 400 lähestyy 0 pH 5,5 soluja0 19 400 lähestyy 0

II

98642 29

GAM

Lähtö- Jakauma- Näyte pit.d kerroin 5 pH 2,5 ei soluja* 3 777,5 lähestyy 0 pH 5,5 ei soluja* 3 777,5 0,001451 pH 2,5 solujab 3 777,5 0,001988 pH 5,5 soluja0 3 777,5 0,000980 10 Hapan fosfataasi Lähtö- Jakauma- Näyte pit. IU/ml kerroin pH 2,5 ei soluja* 594 lähestyy 0 15 pH 5,5 ei soluja* 594 lähestyy 0 pH 2,5 solujab 594 lähestyy 0 pH 5,5 soluja0 594 lähestyy 0

Leu-aminopeptidaasi Lähtö- Jakauma- 20 Näyte pit. U/ml kerroin pH 2,5 ei soluja* 1 639 lähestyy 0 pH 5,5 ei soluja* 1 639 0,000182 pH 2,5 solujab 1 639 lähestyy 0 pH 5,5 soluja0 1 639 lähestyy 0 25 a = fermentaatioliemi on sentrifugoitu solujen poistamiseksi ilman, että solut on ensin tapettu.

b = fermentaatiolientä ei ole sentrifugoitu ja solut ovat yhä eläviä.

30 c = fermentaatiolientä ei ole sentrifugoitu ja so lut ovat yhä eläviä.

d = lähtöpitoisuus on ilmoitettu mikrogrammoissa glukoosia/ml/min. Lähtöpitoisuus (kaikki entsyymit) määritettiin pH:ssa 5,5.

35 98642 30

Edeltävät tulostiedot osoittavat, että vaikka ky-mosiini jakautuu polyetyleeniglykolifaasiin, muut entsyymit fermentaatioliemessä eivät. Täten nämä tulostiedot vahvistavat, että kymosiini jakautuu selektiivisesti po-5 lyetyleeniglykolifaasiin fermentaatiopolypeptidien läsnä ollessa.

Esimerkki 8

Yhden litran erä Aspergillus niger var. awamori -viljelmää pH:ssa 5,8 sentrifugoitiin solujen (ei tapet-10 tu) poistamiseksi RC-3B-sentrifugilla (Sorvali) noin 5 000 x g:ssä noin 15 minuutin ajan. Saatu fermentaatio-liemi lämmitettiin noin 37 °C:seen. Tähän liuokseen lisättiin natriumsulfaattia (10,5 %, w/v) ja PEG-8000:aa (4 %, w/v). Liuosta sekoitettiin, kunnes ainesosat liuke-15 nivat. Sitten liuosta sentrifugoitiin 5 000 x g:ssä (sent-rifugissa) noin 15 minuutin ajan muodostuneiden faasien erottumisen tehostamiseksi. Kymosiinia runsaasti sisältävä polyetyleeniglykolifaasi (päälifaasi) erotettiin suolaa runsaasti sisältävästä faasista (pöhjafaasi) poista-20 maila pöhjafaasi keskipakoisvoimapumppua käyttäen. Puolet päälifaasista (45 ml) laimennettiin 1:3 tislattua vettä lisäämällä ja panostettiin 2,5 ml:n Pharmacia Q-Sephar-ose-kolonniin, jota oli tasapainoitettu 50 mM natriumfos-faattiliuoksella, pH 5,8. Kolonni pestiin 14 kolonnitila-25 vuudella samaa puskuria. Kymosiini eluoitiin 50 mM nat-riumfosfaattiliuoksella, pH 5,8, 2 M NaCl. Eluaatin tilavuus oli 45 ml. Tulokset ovat seuraavat: 98642 31

Til. Akt. Kokonais- Saanto- (litraa) (CHU/ml) kymosiini \

Raakaliemi 1 11,6 11 600 100 5 Uute 0,0925 102,9 9 775* 84

Raffinaatti 0,925 0,53 490 4 Q-Seph. tyhjät. 0,101 - 154 3 Q-Seph. eluaatti 0,045 75 3 375 69f

Kokonaissaanto 58 10 Massatase 69

Jakaumakerroin (K) noin 1909 e = kuten edellä mainittiin, vain puolet uutteesta käytettiin, mikä merkitsee, että vain puolet kymosiinista 15 (9775/2 tai 4887 CHU) panostettiin anioninvaihtohartsiin.

f = 69 %:n saalis on saanto, johon päästään verrattuna uutteessa esiintyvään kymosiinimäärään.

g = noin 200:n tai korkeampia jakaumakertoimia on vaikeata mitata tarkasti määritysrajoitusten johdosta. 20 Tämä merkitsee, että koska jakaumakerroin on suhde kymo-siinin pitoisuus päälifaasissa jaettuna kymosiinin pitoisuudella pohjafaasissa ja edelleen koska kymosiinin määrä pöhjafaasissa on yleensä hyvin pieni, pienet muutokset tässä pohjapitoisuudessa aiheuttavat suuria heilahduksia 25 jakaumakertoimessa. Lisäksi määritysmetodiikalla määritetty pitoisuus on erityisen altis vaihteluille hyvin alhaisissa pitoisuuksissa.

Seuraamalla edellä esitettyjä menettelyjä saadaan talteen oleellisesti puhdasta kymosiinia. Toisin sanoen 30 kymosiinin puhtausaste on ainakin noin 90 paino-% ja edullisesti ainakin noin 95 paino-%, ja sitä voidaan valmistaa kaupalliseen käyttöön ilman merkittävää jatkokäsittelyä epäpuhtauksien poistamiseksi. Kaupallinen kymo-siinituote laimennetaan tavallisesti pitoisuuteen noin 1,5 35 g/litra kymosiinia. Suola- (tavallisesti NaCl-) pitoisuus 32 98642 nostetaan normaalisti aina noin 18 %:iin ja lisätään säi-lytysainetta kuten natriumbentsoaattia. Lopullinen konsentroitu tuote, joka on tarkoitettu elintarvikelaatukäyt-töön, samoin tavallisesti suodatetaan lopuksi mahdollises-5 ti läsnä olevien epätoivottavien kiinteiden aineiden tai hiukkasten poistamiseksi.

Il

Claims (13)

98642

1. Menetelmä mikrobiologisesti tuotetun kymosiinin talteenottamiseksi ja puhdistamiseksi vesipitoisesta fer- 5 mentaatioliemestä, joka sisältää lisäksi fermentaatiopo-lypeptidejä, tunnettu siitä, että a) fermentaatioliemen pH säädetään arvoon noin 6,5 tai alle, b) fermentaatioliemeen lisätään tehokas määrä po- 10 lyetyleeniglykolia ja epäorgaanista suolaa kaksifaasisys- teemin muodostamiseksi, c) fermentaatioliemi-polyetyleeniglykoli-epäorgaa-ninen suola -seoksen annetaan erottua kymosiinia runsaasti, fermentaatiopolypeptidejä niukasti sisältäväksi poly- 15 etyleeniglykolifaasiksi ja kymosiinia niukasti, fermen taatiopolypeptide jä runsaasti sisältäväksi suolafaasiksi, d) kymosiinia runsaasti, fermentaatiopolypeptidejä niukasti sisältävä polyetyleeniglykolifaasi otetaan talteen olosuhteissa, joissa pH on edullisesti noin 3 tai 20 alle, tai noin 5 tai yli, e) kymosiinia runsaasti, fermentaatiopolypeptidejä niukasti sisältävä polyetyleeniglykolifaasi saatetaan kosketuksiin ioninvaihtohartsin kanssa olosuhteissa, joissa kymosiini sitoutuu hartsiin ja polyetyleeniglykoli 25 kulkee hartsin läpi; ja f) kymosiini otetaan talteen hartsista.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että fermentaatioliemen pH on noin 3 tai alle.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että fermentaatioliemen pH on alle noin 2,8.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että polyetyleeniglykolin keskimääräinen 35 molekyylipaino on noin 600 - noin 12 000. 98642

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että polyetyleeniglykolin keskimääräinen molekyylipaino on noin 5 000 - noin 10 000.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n-5 n e t t u siitä, että epäorgaaninen suola valitaan ryhmästä, jonka muodostavat sulfaattisuolat ja fosfaattisuo-lat.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että epäorgaaninen suola on sulfaatti- 10 suola.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sulfaattisuola valitaan ryhmästä, jonka muodostavat natriumsulfaatti, magnesiumsulfaatti ja ammoniumsulfaatti.

9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että vesipitoinen fermentaatioliemi suodatetaan ensin ennen polyetyleeniglykolin ja epäorgaanisen suolan lisäämistä.

10. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 20 tunnettu siitä, että kymosiinia runsaasti, fer- mentaatiopolypeptidejä niukasti sisältävän polyetyleeni-glykolifaasin pH on joko 5,0 - 6,5 tai on noin 3,0 tai alle.

11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, 25 tunnettu siitä, että kymosiinia runsaasti, fer- mentaatiopolypeptidejä niukasti sisältävän polyetyleeni-glykolifaasin pH on noin 3,0 tai alle ja käytetään katio-ninvaihtohartsia.

12. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 30 tunnettu siitä, että kymosiinia runsaasti, fer- mentaatiopolypeptidejä niukasti sisältävän polyetyleeni-glykolifaasin pH on noin 5,0 - noin 6,5 ja käytetään anio-ninvaihtohartsia. 98642

13. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaihe a) suoritetaan pH:ssa noin 3 tai alle, ja kun polyetyleeniglykolifaasi on eristetty, tämän faasin pH säädetään lukemaan noin 5,0 - 6,5 5 ja käytetään anioninvaihtohartsia. 98642