CN107417765B - 大肠杆菌自溶表达体系中分离纯化重组蛋白的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种从一种从自溶表达体系中纯化重组蛋白方法，本方法首次使用了一种工艺组合，通过对料液均质处理、固液分离以及过滤清液的进一步处理和后续的层析浓缩过程，最终获得高度浓缩的重组蛋白。该方法具有控制简单，成本低的特点，针对大肠杆菌自溶表达时碎片较多，料液粘度较高的情况尤其适用，解决了此类发酵液中产物难以分离纯化的困难。

Description

大肠杆菌自溶表达体系中分离纯化重组蛋白的方法
技术领域
本发明涉及一种从自溶表达体系中纯化重组蛋白方法，更具体的，本发明涉及一种在大肠杆菌自溶表达体系中重组蛋白的高效工业化分离纯化方法。
背景技术
在重组蛋白酶所用的微生物表达系统中，大肠杆菌是一种最常用的经典的原核表达宿主菌，具有不同的重组蛋白表达方式，比如包涵体表达系统、分泌表达系统、周质空间表达系统等。
大肠杆菌表达系统存在元件组成复杂、调控精细以及双层膜结构等特性，使得重组大肠杆菌表达系统的分泌性差，很难得到大量的胞外蛋白产物，因此包涵体表达方式是大肠杆菌表达系统中最常用到的方式，但是这种方式需要将细胞破碎并收集包涵体，后续还需经过溶解和复性过程才可以取得可溶性蛋白，工艺复杂。大肠杆菌表达系统使用周质空间表达方式时虽然不需要后续的包涵体溶解以及复性过程，但是后续的蛋白抽提效率严重影响到目的产物的产率。大肠杆菌表达系统使用自溶表达方式时，细胞需要溶解破裂将胞内物质释放，发酵液的料液中会出现大量的细胞碎片、蛋白、核酸等成分，成分复杂，性状粘稠，单独采用常规的离心过滤方式无法实现固液分离。本发明的大肠杆菌表达系统选择使用自溶表达方式，构建大肠杆菌自溶表达体系。
专利CN102174495A描述了一种在新鲜牛胰脏或猪胰脏制备的料液中直接加入氯化钙激活糜蛋白酶原，并且进一步与加入的硫酸铵反应生成硫酸钙来絮凝沉淀糜蛋白酶的而分离的方式。该加入氯化钙和硫酸铵的方法称为絮凝法。CN102174495A公布的技术方案是从天然的动物胰脏从采取絮凝法提取蛋白酶原的方法，本发明涉及从基因重组的大肠杆菌自溶表达体系中分离纯化重组蛋白的方法，CN102174495A与本发明在分离过程中，面临的杂质种类、料液特性等因素存在巨大的差异，并且目前也并没有将絮凝法运用于基因重组的大肠杆菌自溶表达体系中分离纯化重组蛋白的报道。
目前随着生物工程技术的进步，越来越多的蛋白酶可以通过微生物表达，如胰蛋白酶，糜蛋白酶、青霉素酰化酶、赖氨酰内切酶以及精氨酰内切酶等，这些酶的表达以及后续的生产为生物技术产业的进步提供了有力的支撑。
其中重组赖氨酰内切酶(lysyl endopeptidases，EC 3.4.21.50)，最早是从Achromobacter lyticus M497-1中发现的，该酶由268个氨基酸组成，理论分子量为27KD，当pH在9.0～9.5时，具有专一酶切蛋白或多肽中赖氨酸酯键的作用，相比胰蛋白酶专一性更强，因此在生物工程领域尤其是胰岛素研发生产行业具有显著的应用空间，但是目前重组赖氨酰内切酶的工业化分离纯化方法还有没有公开文献报道。
发明内容
本发明涉及一种从自溶表达体系中纯化重组蛋白方法。
研究人员在研究从自溶表达体系中纯化重组蛋白方法过程中，意外发现通过高压破碎处理大肠杆菌自溶表达体系发酵料液后，搭配使用高效絮凝沉淀，可以有效提高沉淀效果，提高料液的澄清度。并且通过该高效的组合技术将料液中的菌体碎片和杂质去除后，进一步使用高压均质或超声处理澄清料液，会打破澄清料液的稳态环境，进一步使料液中残留的细小杂质如核酸、杂蛋白、细小碎片等快速析出，并且将该澄清料液做层析纯化时，发现原层析柱床塌陷的情况得到明显好转，进而大大提高了工艺的稳定性，同时样品收率也得到提高。
因此，本发明克服现有技术的缺点与不足，首次提出了高压均质与絮凝沉淀技术应用于大肠杆菌自溶表达体系分离目标蛋白产品的组合方案，提供了一种在大肠杆菌自溶表达体系中，解决因料液粘稠，浑浊而难以纯化的方案，使自溶表达的重组蛋白的工业化生产成为可能，更进一步的是使自溶表达的重组赖氨酰内切酶的工业化生产成为可能。
本发明相对于现有技术，具有较高的工艺稳定性优势，成本低廉，收率高于70％，非常适合工业化生产。
一种从大肠杆菌自溶表达体系中分离纯化重组蛋白的方法，首先将包含重组蛋白的大肠杆菌自溶发酵液进行高压均质破碎；预处理过后向其中加入一种或多种可溶性无机盐，使料液中的杂质大量絮凝析出沉淀；并处理已经析出沉淀的料液得到澄清料液，以及后续的层析纯化过程。
一种从大肠杆菌自溶表达体系中分离纯化重组蛋白的方法，其特征在于所述方法将包含重组蛋白的大肠杆菌自溶发酵液使用高压均质机进行预处理。
所述的高压均质机高压处理条件为在压力20～100MPa时，处理1～4次，更优选高压均质机高压处理压力为40～60MPa，均质1次。
所述从大肠杆菌自溶表达体系中分离纯化重组蛋白的方法，其特征在于向使用高压均质机进行预处理的发酵液中加水溶性无机盐。
所述可溶性无机盐优选包括氯化盐、钠盐、硫酸盐、磷酸盐、钙盐中的一种或几种。
所述的硫酸盐终浓度为0～2.0mol/L，磷酸盐终浓度优选为0.05～0.5mol/L；钙盐终浓度优选为0.5～2.0mol/L，更优选硫酸盐终浓度为0.8～1.6mol/L，磷酸盐终浓度为0.1～0.3mol/L；钙盐浓度为1.0～1.5mol/L；
所述硫酸盐终浓度为1.0mol/L，所述磷酸盐终浓度为0.2mol/L；所述钙盐终浓度优选为1.2mol/L时就可以获得最佳的效果。
所述的添加水溶性无机盐后，搅拌静置，静置时间优选2～15小时，优选2～3小时，静置温度为室温。一种从大肠杆菌自溶表达体系中分离纯化重组蛋白的方法，步骤具体包括：
a收集大肠杆菌自溶发酵液，并使用高压均质机破碎所述发酵液；
b向上述步骤(a)所述的预处理后的料液中加入水溶性无机盐；
c将步骤(b)所描述的料液中的上清与固相分离；
d将步骤(c)分离所得到的澄清液的进行破稳态处理；
e将步骤(d)处理的样品过滤后使用层析柱层析纯化，得到高度浓缩的重组蛋白粗提液。
本发明步骤(a)所述的发酵液为通过采用基因重组技术自溶表达的重组蛋白发酵液，所述重组蛋白选自重组赖氨酰内切酶、青霉素酰化酶、精氨酰内切酶、胰蛋白酶等。
所述的预处理方法为高压均质机破碎处理；
所述的高压均质机高压处理条件为在压力20～100MPa时，处理1～4次，更优选处理压力为40～60MPa，均质1次；
本发明步骤(b)所述的料液处理方法是发酵液经过预处理后，向其中加入大量可溶性无机盐，使料液中的细胞碎片、杂蛋白、核酸等物质絮凝沉淀下来。可溶性盐选自氯化盐、钠盐、硫酸盐、磷酸盐、钙盐中的一种或几种，优选使用硫酸盐或磷酸盐中的一种或两种与钙盐的组合；
所述的硫酸盐终浓度为0～2.0mol/L，磷酸盐终浓度优选为0.05～0.5mol/L；钙盐终浓度优选为0.5～2.0mol/L，更优选硫酸盐终浓度为0.8～1.6mol/L，磷酸盐终浓度为0.1～0.3mol/L；钙盐浓度为1.0～1.5mol/L；
所述硫酸盐终浓度为1.0mol/L，所述磷酸盐终浓度为0.2mol/L；所述钙盐终浓度优选为1.2mol/L。所述的絮凝沉淀过程需在搅拌均匀后静置，静置时间优选2～15小时，优选2～3小时，静置温度为室温；
本发明步骤(c)所采用的固液分离方法包括离心、板框过滤以及中空陶瓷膜过滤，优选板框压滤机过滤方式。
本发明步骤(d)所述料液过滤后的澄清液可以经滤膜过滤后直接上柱过层析、或经过超声处理、高压均质处理等后再过滤上柱，优选高压均质或超声处理，更优选使用高压均质处理后使小颗粒物质尽快析出沉淀；
所述的高压均质机高压处理条件为压力20～100MPa，处理1～3次，更优选采用压力为40～60MPa，均质1次；
本发明步骤(e)所采用的方法是层析捕获并纯化重组赖氨酰内切酶，具体层析方法的选择根据蛋白酶与料液的性质确定，优选离子层析、疏水层析和反相层析，更优选使用疏水层析；
所述的疏水层析介质根据疏水性强弱，优选配基为丁基或苯基，填料介质优选为琼脂糖凝胶以及聚合物基质，更优选聚合物作为疏水层析填料的基质，并且为苏州纳微生物科技有限公司的苯基疏水填料；
采用所选的聚合物材质的苯基疏水层析介质，根据该种填料的性质选择对应的缓冲液，可以容易的将重组蛋白浓缩，并且收率不低于85％。
本发明的优点是：提取分离纯化方法简易，安全可行，可稳定实施，适用于放大生产。本工艺无需使用有机相抽提及复杂的层析过程，只需要价格低廉的盐使料液絮凝沉淀处理以及简单的层析过程，便可以得到重组蛋白的粗品，满足工业化生产的要求。
本发明所涉及的术语定义
除非另有定义，否则本发明所用的技术与科学术语都为本发明所述另有的普通技术人员所熟识的含义。
本发明所用术语“大肠杆菌自溶表达料液”是指在大肠杆菌发酵过程中，通过菌体自溶的方式将表达产物释放到胞外所产生的一种料液。本领域技术人员可以理解，自溶使的菌体破碎，细胞内容物释放，使得料液粘度增大，导致不利于后续的各种处理。
本发明所用术语“絮凝沉淀”是指在胶体溶液中，加入絮凝剂，使溶液中的颗粒物质在絮凝的过程中不断碰撞，进而使沉淀体积逐步增大的一种方式。该操作过程可与盐析过程共同进行。
本发明所用术语“疏水层析”是指层析纯化的一种，该层析是以疏水层析填料为吸附载体，并通过洗涤和洗脱的方式将目的蛋白和杂质分离的一种过程，本文所用的疏水层析填料是以亲水性琼脂糖或球形有机聚合物为基质，并在其表面和孔径内部键合了疏水基团作为吸附官能团，成为能够吸附疏水性蛋白的层析填料。
本发明所用术语“终浓度”是指硫酸盐、磷酸盐和钙盐加入后，料液中所述三种盐的浓度。
具体实施实例
以下结合具体实例详细讲解本发明，这些实例均为说明性的，不以任何方式限制本发明的保护范围。本领域的技术人员应该明确，在不偏离本发明的范围下，可以对本发明的细节和工艺步骤组合的调整以及替换，但是这些调整以及替换均应为本文所保护。
实施例一：大肠杆菌自溶发酵液盐析絮凝沉淀
制备重组赖氨酰内切酶的重组大肠杆菌发酵结束后，分别收集自溶发酵液各1L，使用不同的可溶性盐做沉淀絮凝，搅拌均匀后于2～8℃静置2小时后6000转/分钟离心，将离心清液静置过夜后观察清液状态，并计算酶活收率，见表1
表1自溶发酵液絮凝结果
Figure BDA0001418487150000051
Figure BDA0001418487150000061
上述自溶发酵液经过不同的盐以及盐组合做絮凝沉淀处理，效果均不佳，难以满足后续处理的要求。
实施例二、大肠杆菌自溶发酵液的高压均质及盐析絮凝条件的选择
制备重组赖氨酰内切酶的重组大肠杆菌发酵结束后，收集胶黏状态的发酵液6L，经高压均质机20MPa压力下均质破碎四次。
上述破碎后的料液菌体均质处理后，经过6000转/分离心分离，所得上清液放置2小时后变浑浊，无法满足后续纯化要求，需要对破碎液做其他处理。
将上述破碎液分为六组，分别加入不同种类的可溶性盐，搅拌均匀后于2～8℃静置2小时使沉淀继续生成，6000转/分钟离心后将澄清液过夜静置后检测澄清度OD600，并计算酶活收率，结果见表2
表2自溶发酵液均质处理后的絮凝沉淀结果
Figure BDA0001418487150000062
Figure BDA0001418487150000071
结论：(1)由表1和表2可以看出，经过均质后的料液再加入可溶性盐做絮凝沉淀，收集的澄清液过夜保存后仍然保持比较高的澄清度，并且酶活收率高于78％；而仅加入可溶性盐做絮凝沉淀，不高压均质预处理时，收集的料液粘稠和沉淀多，并且酶活收率低，无法满足后续生产的需要。因此先均质再絮凝沉淀的组合优于仅絮凝沉淀的处理方法。
(2)在先均质再絮凝沉淀的组合条件下，单盐条件下无法充分沉淀杂质，无法达到生存需求；双盐组合条件下，沉降后离心上清液过夜放置还是有少量沉淀析出；而三种盐组合时，沉淀上清液过夜放置后，无沉淀沉降，表明澄清处理效果较好。
(3)先均质再絮凝沉淀的组合条件和三种盐组合条件下，当硫酸铵+磷酸氢二钾+氯化钙的浓度添加终浓度分别为1mol/L、0.2mol/L和1.2mol/L时，沉淀效果和酶活收率最优。之后发明人考察了三种盐的种类组合，将三种盐替换成其他盐类，发现的硫酸盐终浓度为1.0mol/L，磷酸盐终浓度为0.2mol/L；钙盐终浓度优选为1.2mol/L时就可以获得最佳的效果。
实施例三、大量大肠杆菌自溶发酵液的高压均质及澄清处理
制备重组赖氨酰内切酶的重组大肠杆菌发酵结束后，收集胶黏状态的发酵液100L，经高压均质机100MPa压力下均质破碎一次。
向上述均质破碎后料液中加入终浓度为1mol/L的硫酸铵、0.2mol/L的磷酸氢二钾以及1.2mol/L的氯化钙，缓慢搅拌使混合均匀，料液中出现颗粒状的固形物，并静置15小时使沉淀继续生成。将沉淀后的料液经板框压滤机过滤，可以获得澄清的液体，为原发酵料体积的90％。将澄清液过夜静置后检测澄清度OD600为2.4，无沉淀沉降，并且、酶活收率为86％。
实施例四、重组赖氨酰内切酶料液的固液分离
在工业生产过程中，固液分离常选用的方式有碟式离心和板块过滤两种，两种分离方式各有优缺点，其中板框过滤适合固体颗粒较大的料液，属于工业生产最常用的固液分离设备，过滤效率比较高，缺点是需要较多的人力参与，操作环境比较差；而碟式离心机对板块过滤无法实现的料液也具有分离效果，另外碟式离心可以实现全封闭式生产，环境清洁并且劳动力成本低。
本实例分别对这两种方式进行中试级别的考察。将发酵结束后的发酵液，进行高压均质以及盐析絮凝预处理，具体实施过程同实例三，预处理过后，分别取料液100L使用碟式离心机和板块过滤机进行固液分离，结果见表3
表3两种工业固液分离方式处理结果
分离方式 体积 清液状态 清液OD<sub>600</sub> 过夜后OD<sub>600</sub> 收率
板框过滤 85L 澄清均一 0.18 2.6 81％
碟式离心 80L 絮状物漂浮 0.52 5.8 63％
由表3的结果可以看出，使用板块过滤和碟式离心均可以将沉淀处理后的发酵液中的固体有效分离，但是澄清度及总收率来讲，板框过滤均较优；碟式离心分离虽然处理时间短，但是料液澄清度和样品收率略低。本发明从产品收率为主要考察点，优选板框过滤。
实施例五、澄清料液的后处理
从实施例四中板框过滤获得的澄清料液中，分别取500ml，再次使用高压均质机均质以及超声处理，进一步破坏残留的大分子及粘稠物质，以打破料液稳态环境促使小颗粒加速聚集。均质压力分别为40MPa、55MPa、70MPa，40K赫兹的超声时间分别为30min、60min。处理过后将料液过滤，分别留样过夜测样品的澄清度OD600，其余样品则过苯基层析柱，检验预处理效果。结果见表4
表4不同后处理料液的过柱状态
Figure BDA0001418487150000081
Figure BDA0001418487150000091
由表4可以看出，通过均质处理的澄清料液再次过滤后，过夜静置后澄清度OD600仍然很低，并且在苯基层析柱中上样达20柱体积而不裂柱，均表明后处理比较彻底，满足大量料液做后续层析浓缩的要求。
实施例六蛋白层析浓缩
上述经过预处理得到的澄清料液，需经层析进一步纯化，以得到更高纯度和浓度的粗酶液，由于样品本身以及预处理过程中加入较多的盐，因此优先选用聚合物基质的苯基疏水层析纯化，柱床体积均为200ml，料液体积为4000ml，活性为5U/mL。
层析过程在常压柱中进行，经过上样、洗涤以及收集，得到重组赖氨酰内切酶的粗酶液，结果见表5
表5层析浓缩结果
层析柱 收集体积ml 收率％ 纯度％ 活性U/ml
聚合物苯基层析柱 352 91 65 51
从表5结果中可以看出，经过一步层析后，样品体积浓缩了10倍，并且活性收率高达91％，满足收率和浓缩要求。
工业实用性
本专利提出了一种从大肠杆菌自溶表达体系中纯化重组蛋白方法，并针对大肠杆菌自溶性分泌表达重组赖氨酰内切酶做了详细的论述，本方法对于大肠杆菌自溶分泌表达的其他蛋白类型仍有很强适用性。使用本方法，从小规模体积到大规模体积，均可以高效、稳定的将重组蛋白从粘稠的料液中获取，并得到高度浓缩的具有生理活性的粗酶液，具有较强的工业实用性。

Claims (8)

1.一种从大肠杆菌自溶表达体系中分离纯化重组蛋白的方法，其特征在于所述方法包括：
步骤（a） 收集大肠杆菌自溶发酵液，并使用高压均质机进行预处理；
步骤（b） 向上述步骤（a）所述的预处理后的料液中加入水溶性无机盐，所述水溶性无机盐选自硫酸盐、磷酸盐中的一种或两种与钙盐的组合；
步骤（c） 将步骤（b）所述的料液中的上清与固相分离，得到包含重组蛋白的澄清液。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（d） 将步骤（c）分离所得到的样品过滤后使用层析柱层析纯化，得到高度浓缩的重组蛋白粗提液。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（c）还包括将分离得到的所述澄清液进行超声或高压均质处理。
4.如权利要求1~3所述的方法，其特征在于，步骤（a）中所述的高压均质机高压处理条件为在压力20~100MPa时，高压均质机高压处理1~4次。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（a）中所述的高压均质机高压处理条件为在压力40~60MPa时，高压均质机高压处理1次。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（c）所述高压均质处理条件为压力20~100MPa，均质1~3次。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述硫酸盐终浓度为0~2.0mol/L，磷酸盐终浓度为0.05~0.5mol/L；钙盐终浓度为0.5~2.0mol/L。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述硫酸盐终浓度为1.0mol/L，磷酸盐终浓度为0.2mol/L；钙盐终浓度为1.2mol/L。
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Title
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