CN101475626B - 一种从猪脾脏中提取转移因子的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种从动物脾脏中获取转移因子的方法，包括组织、高压均质机细胞破碎、絮凝剂沉淀、微孔滤膜过滤，超滤膜进行超滤等步骤。其中，破壁同时中加入了絮凝剂，使得溶液中的蛋白质沉淀，溶液变澄清，在超滤的过程中减少了堵塞中空纤维超滤柱的可能。本发明方法可大大缩短生产周期，节省了大量的人力物力，提高了转移因子的生产效率，为满足工业化大规模生产提供了可行途径。

Description

一种从猪脾脏中提取转移因子的方法

技术领域

本发明属于兽药领域，特别是涉及一种从动物脾脏中提取转移因子的方法。本发明的发明内容主要涉及的是从猪脾脏中提取转移因子的方法。

背景技术

转移因子(transfer factor，TF)是T淋巴细胞释放的一种能够转移致敏信息的物质，它能够特异地将供体的细胞免疫信息转移给受体，从而增强受体的免疫功能。TF自50年代发现至今，国内外学者都对此进行大量研究，并于1979年将其引入到兽医免疫和临床治疗中，目前其在国外已成为一种应用广泛的增强免疫制剂。

由于转移因子无种属特异性，因此临床上转移因子的来源较为广泛，人类临床上常见的有人转移因子、猪转移因子、牛转移因子、羊转移因子、鹅、猴转移因子等。目前畜禽上常见的有牛转移因子、猪转移因子，鸡转移因子。禽畜脾脏为加工过程中的废物，因此有着极广的应用开发前景，已成为转移因子研究的热点。

转移因子为分子量小于10000，具有生物活性的非均一性的小分子混合物，其内含物包括游离氨基酸(16-18种)，核酸、多肽及K、Na、Ca、Mg、Zn等金属元素。各种TF内的理化特性，组成成分差异不大，但含量有较大差异。

从免疫学上，TF可分为特异性转移因子和非特异性转移因子两大类。特异性转移因子系采用某种特定病原感染或免疫人群、动物后再提取含该抗原特异活性的转移因子，目前临床已经应用有乙型肝炎病毒特异转移因子、各种肿瘤特异转移因子、流行性出血热病毒转移因子、布氏菌转移因子、疱疹病毒转移因子、乙型脑炎转移因子、结核菌转移因子等。非特异性转移因子是指用自然人群或动物白细胞提取的具有多种免疫活性的转移因子，可非特异性调节机体的免疫机能，从而提高机体的抵抗力或疫苗的免疫效果。

细胞免疫主要通过T淋巴细胞实现，王建文等报道转移因子能增强罗曼雏公鸡T淋巴细胞的比值，马风龙等研究发现将鸡脾脏转移因子与新城疫I系苗同时给肉鸡注射可显著提高淋巴细胞的转化率，证明鸡脾脏TF对鸡的细胞免疫有促进作用，可促进T淋巴细胞的增殖与成熟，增强机体的细胞免疫应答能力。

早期经典的转移因子机理研究试验就发现转移因子具有传递特异细胞免疫信息的活性，而抗原信息的刺激与动物机体免疫功能的发挥有着直接的联系。已有众多资料证实，转移因子可激活淋巴细胞E受体，增加E玫瑰花结的形成数目。因此免疫信息通过TF转移给受体淋巴细胞，使细胞获得这种免疫信息而产生识别特异性抗原的受体，当有该种抗原存在时，这种特异性识别受体就会与特异性抗原结合而触发受体细胞活化，从增强淋巴细胞的活性而导致其高度分化增殖。

高迎春等研究报道鸡注射TF后，接种减蛋综合症灭活疫苗可以显著提高鸡体的抗体滴度。马风龙等发现鸡TF活疫苗和油乳剂灭活苗在首免和加强免疫时均具有协同作用，能显著提高免疫接种鸡的体液免疫应答能力，产生较高滴度的抗体，并延长抗体高峰期，使之维持较小时间。由于X淋巴细胞在实现体液免疫机能需要T淋巴细胞的辅助，目前普遍认为转移因子对体液免疫的影响主要是通过T淋巴细胞调节机体的免疫机能。

刘润珍等利用犬五联疫苗免疫猪后制备特异性脾脏转移因子，可以显著增强小鼠E玫瑰花环形成率和腹腔巨噬细胞吞噬活性。陈德坤等研究发现，给健康小鼠注射和口服猪脾脏转移因子可增强外周血液中性粒细胞对葡萄球菌的吞噬率和腹腔巨噬细胞对红细胞的吞噬率。因此，转移因子对机体的非特异性免疫机能也有增强作用。

范振青等研究发现，口服和注射TF可阻断由氢化可的松引起的小鼠的白细胞数、淋巴细胞百分率及脾重指数的下降。苗乃法采用环磷酰胺建立的免疫抑制家兔模型进行猪脾转移因子提升白细胞实验，注射后第3d即可见白细胞总数迅速上升，第5d可达最高峰，第8d后趋向正常。由此推测TF作为免疫激活剂进入机体后，可使造血系统在短时间内产生大量的白细胞，同时活化淋巴细胞，增加T辅助细胞产生和释放更多的淋巴因子，促进T淋巴细胞生长和分裂从而发挥抗放射、抗免疫抑制、增强免疫功能的作用。

王建文等报道雏鸡口服0.5-1.0ML转移因子粗制品，7d后与未服用转移因子组相比，增重明显，且口服转移因子组鸡精神活泼，羽毛有光泽。江青艳等在试验中发现，注射脾脏转移因子对粤黄鸡增重有明显的效果。动物机体的正常生长发育一般由T3、T4和GH协同调控而完成。GH主要促进组织生长，T3、T4主要促进器官、组织的分化，而且，GH的促生长作用，需要有适量的T3、T4的存在。本试验中，注射不同浓度的TF鸡组在8周龄时血液T4，GH水平均显著高于对照组，由此推断脾脏转移因子促进粤黄鸡生长发育的内在机制与血液T4、GH水平的升高有关。

随着现代化养殖规模化、集约化程度的不断提高，目前病毒性疾病已成为困扰养殖户的一大难题。现有的普遍的解决方法就是免疫，然而由于种种原因，有时难免会造成免疫失败，爆发非典型性传染病，给诊断和治疗带来一定困难。在免疫失败后往往依赖抗生素治疗，造成了耐药菌株的增加和交叉感染的产生。转移因子作为一种细胞免疫发应增强剂，在防治疾病方面可发挥重要的作用，提高免疫后的免疫效果，有效提高机体的抗病能力。

目前现有的转移因子技术，通常是将动物的脾脏中的脂肪和大血管剔出后，进行组织捣碎，反复冻融后，通过半透膜透析获得，操作费用高。另外，常规采用Laurence方法，即利用两次透析法回收转移因子此法操作简单，但生产周期长工序繁琐(生产周期约需要20天)，耗时长，浪费大量人力物力。因此这些方法都难以进行工业化大规模生产。

因此，需要一种快速、高效并且经济的从动物脾脏中获取转移因子的方法，以满足目前的工业化生产。

发明内容

本发明目的在于提供一种从动物脾脏中获取转移因子的方法，包括：

1)将冷冻的动物脾脏1000g，用蒸馏水洗净后切成小块，加入1000ml蒸馏水，用组织捣碎机绞碎；

2)高压均质机(60MPa)进行细胞破碎，同时加入絮凝剂加入1％絮凝剂240ml；

3)在4℃下，以7000转/分，离心15分钟，去沉淀，留上清液；

4)上清液用微孔滤膜进行过滤，然后用超滤膜进行超滤，即为含有转移因子的原液。

原液中含有预期的转移因子，然后按照国家药品管理办法去除病毒后配制。

在一个具体实施方案中，所述的蒸馏水是去热原的蒸馏水。

在另一个具体实施方案中，所述的絮凝剂是壳聚糖溶液。

在另一个具体实施方案中，所述的微孔滤膜径优选0.22μm。

在另一个具体实施方案中，所述的超滤膜优选截留分子量为5000道尔顿的超滤膜。

在另一个具体实施方案中，所述的动物是畜类，优选猪。

术语：

“热原”系指由微生物产生的能引起恒温动物体温异常升高的致热物质。它包括细菌性热原、内源性高分子热原、内源性低分子热原及化学热原等。这里所指的“热原”，主要是指细菌性热原，是某些细菌的代谢产物、细菌尸体及内毒素。致热能力最强的是革兰氏阴性杆菌的产物，其次是革兰阳性杆菌类，革兰阳性球菌则较弱，霉菌、酵母菌、甚至病毒也能产生热原。热原通常是磷脂多醇与蛋白质结合而成的复合物。磷脂多醇是复合物的活性中心，致热作用最强。其化学组成因菌种不同而有所差异。分子量为5×104～5×105，分子量越大致热作用也越强。

去热原的方法包括：

1.高温法：热原的耐热性能良好，60℃加热1h不被分解破坏，100℃不降解，但180℃3～4h、200℃60min或250℃30～45min可使热原彻底破坏。因此耐热物品如玻璃制品、金属制品、生产过程中所用的容器和其它用具以及注射时使用的注射器等，均可采用此法破坏热原。但在通常使用的注射剂热压灭菌条件下不足以破坏热原。

2.吸附法：热原在水溶液中可被活性炭、石棉、白陶土等吸附而除去。由于活性炭性质稳定、吸附性强兼具助滤和脱色作用，故广泛用于注射剂生产，但应注意吸附药液所造成的主药的损失。

3.超滤法：热原分子量为1×10⁶左右，体积较小，约1～5nm，可以通过一般滤器和微孔滤膜，但采用超滤法如用3.0～15nm超滤膜可将其除去。

4.蒸馏法：热原能溶于水但不挥发，但可随水蒸气的雾滴进入注射用水中，因此制备注射用水时，原水中的热原可经蒸馏除去，但需多次蒸馏，，并加有隔沫装置，单次蒸馏往往效果不理想。

5.酸碱法：热原能被强酸、强碱、强氧化剂破坏。玻璃容器及用具如配液用玻璃器皿、输液瓶等可用重铬酸钾硫酸清洁液或稀氢氧化钠处理，破坏热原。

6.其它：包括离子交换法、凝胶滤过法、反渗透法等。

有益效果

1.本发明在提取过程中，破碎后使用高压均质机再次进行破壁，使得组织或细胞内容物充分被释放；

2.在破壁同时中加入了絮凝剂，使得溶液中的蛋白质沉淀，溶液变澄清，在超滤的过程中减少了堵塞中空纤维超滤柱的可能；

3.采用本发明生产转移因子，生产周期大大缩短，使得按传统反复冻融的方法进行细胞破壁、半透膜进行透析的方法，生产周期缩短20天左右；而采用本发明方法制备的转移因子生产周期只需要7天左右，节省了大量的人力物力；

4.提高了转移因子的生产效率，传统反复冻融的方法进行细胞破壁、半透膜进行透析的方法，生产的转移因子原液，每1000g脾脏约生产含量为2.0mg/mL左右的原液2000ml，而采用本发明生产每1000g脾脏约生产含量为7.0mg/mL左右的原液1000ml，折合产量增加175％。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的描述。

实施例1：转移因子的制备

1、剪摘、清洗：将融化为半冻态的动物脾脏去除脂肪和血管，精确称量1kg，用无热源蒸馏水水清洗3遍。

2、绞碎：除脂后的脾脏称取绞肉机内初绞3遍，将绞碎的脾脏中加入500ml无热源蒸馏水，放入捣碎缸，精绞。

3、研磨：将捣碎的脾浆放入胶体磨中将其研磨，制成匀浆。

4、细胞破碎：将上述脾匀浆，于高压均质机内，压力60MPa进行均质，制成匀浆。

5、将高压均质好的匀浆加入1％壳聚糖溶液240ml，置冷冻离心机中，7000转/分，离心15分钟，离心环境温度4℃，弃去沉渣，收集上清液。

6、上清液用0.22μm的微孔滤膜进行过滤，然后用截留分子量为5000道尔顿超滤膜进行超滤，即为原液。

实施例2：对本发明所述工艺制备的转移因子的检测

对实施例1所述工艺制备的转移因子原液按照国家药品监督管理局、国家药品标准WS₁-XG-036-2000进行以下检测：

1、外观性状为微黄色澄明液体，符合转移因子溶液的外观性状。

2、氨基酸鉴别反应为正反应。

3、紫外分光光度测定：上述所得样品在251±2nm处有一吸收峰，且ABS₂₅₀/ABS₂₈₀＞2.0。

4、pH值在6.0~7.5之间。

5、20％磺基水杨酸检测：上述所得样品无浑浊及沉淀现象，说明蛋白反应均成阴性，其不含大分子蛋白质。

6、高分子量物质检测，在胰岛素出峰时间之前无吸收峰，说明本品中无高于分子量6000的大分子。

7、游离氨基酸检测：每1ml中本品氨基酸含量10mg。

7、转移因子活性测定：根据转移因子可使脱E受体后的胸腺T细胞恢复其受体功能，从而反应转移因子的生物活性。上述所得样品形成E玫瑰花结的百分率分别为31.2％、29.6％，比对照组分别增加17.8％、16.9％(P≤0.01)。

8、细菌学检验：上述所得样品中无需氧、厌氧、腐生菌和真菌存在。

9、过敏性、毒性试验：取健康小白鼠10只，雌雄各半，口服本品浓缩液，相当于正常口服剂量的100倍，观察小白鼠的生存能力的变化，结果：无任何过敏、毒性反应，也无任何死亡出现，说明本品是安全的，无任何毒性和副作用。

10、核酸含量测定：上述所得样品经地衣酚法测定核酸含量分别为621.05μg/mL、599.89μg/mL。

11、多肽含量测定：上述所得样品经Lowry法测定多肽含量分别为：7.12mg/mL、6.98mg/mL。

12、用猪伪狂犬病病毒抗原做皮试检测，有弱的阳性反应，说明本品具有良好的转移活性和特异性。

通过上述实施例，我们发现所提取的猪脾脏转移因子含量高，生产工序简单，生产效率高。同时所生产转移因子原液符合国家法典的标准规定。因此本发明所采用的生产方法可以进行大规模的生产推广。

Claims (5)

1.一种从动物脾脏中获取转移因子的方法，包括：

1)将冷冻的动物脾脏1000g，用蒸馏水洗净后切成小块，加入1000ml蒸馏水，用组织捣碎机绞碎；

2)高压均质机，60MPa，进行细胞破碎，同时加入1％壳聚糖溶液240ml；

3)在4℃下，以7000转/分，离心15分钟，去沉淀，留上清液；

4)上清液用微孔滤膜进行过滤，然后用超滤膜进行超滤，滤液即为含有转移因子的原液。

2.权利要求1的方法，其中所述的蒸馏水是去热原的蒸馏水。

3.权利要求1的方法，其中所述的微孔滤膜孔径为0.22μm。

4.权利要求1的方法，其中所述的超滤膜为截留分子量为5000道尔顿的超滤膜。

5.权利要求1的方法，其中所述的动物为猪。