DE69021729T2

DE69021729T2 - Verfahren zur gewinnung von natürlich hergestelltem chymosin.

Info

Publication number: DE69021729T2
Application number: DE69021729T
Authority: DE
Inventors: Raymond Arnold; Kirk Hayenga; Henry Heinsohn; Jeffrey Lorch
Original assignee: Genencor International Inc
Current assignee: Chr Hansen AS
Priority date: 1989-06-13
Filing date: 1990-06-13
Publication date: 1996-03-21
Anticipated expiration: 2010-06-14
Also published as: FI98643C; NO914885L; ES2099097T3; ATE146525T1; NO914887D0; DE69021729D1; JP2578384B2; FI98642C; FI98642B; JP2534587B2; NO914885D0; DE69029471D1; EP0477284A1; AU624968B2; NZ234060A; FI915811A0; EP0477285A1; NO914887L; WO1990015864A1; FI98643B

Description

Hintergrund der Erfindung

1. Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung betrifft die Gewinnung und Reinigung von natürlich erzeugtem Chymosin. Im speziellen ist diese Erfindung auf Verfahren zur Gewinnung und Reinigung von Chymosin aus wäßrigen, Chymosin enthaltenden Lösungen gerichtet, die durch Extraktion von natürlichen Chymosin-Quellen erhalten wurden.

2. Stand der Technik

Chymosin ist ein bekanntes Enzym, das besonders zur Herstellung von Käse dient. Obwohl Kälbermägen, Rindermägen, Ziegenmägen, Schweinemägen etc. zu den natürlichen Chymosin-Quellen zählen, wurde kommerzielles Chymosin bisher vorwiegend aus dem vierten Magen von mit Milch gefütterten Kälbern gewonnen. Das ergibt sich aus der Tatsache, daß solche Kälber im Vergleich zu Pepsin große Mengen an Chymosin produzieren, während andere Chymosin-Quellen im allgemeinen im Vergleich zu Chymosin größere Mengen an Pepsin enthalten, was die Gewinnung von Chymosin aus derartigen anderen Quellen erschwert und vom ökonomischen Standpunkt aus weniger effizient macht, d.h., es ist weniger Chymosin zur Gewinnung vorhanden.
Aufgrund der in letzter Zeit zurückgehenden Kälberproduktion nahm jedoch auch die bislang bevorzugte natürliche Chymosin-Quelle ab, was wiederum ein Anstoß für die Entwicklung wirksamerer Verfahren zur Gewinnung und Reinigung von natürlich erzeugtem Chymosin darstellt. Im speziellen würden effizientere Verfahren zu einer verbesserten Gewinnung und Reinigung von Chymosin aus Kälbermägen führen, sowie die ökonomische Gewinnung und Reinigung von Chymosin aus anderen natürlichen Chymosin-Quellen ermöglichen.
Ein hauptsächlicher Hemmschuh für die Entwicklung einer derartigen Verfahrensweise waren die sehr hohen Mengen an Verunreinigungen, die in der aus natürlichen Chymosin-Quellen erhaltenen Chymosin-Lösung zu finden sind. Außer Pepsin enthalten die aus diesen natürlichen Quellen gewonnenen, wäßrigen Extrakte andere Verunreinigungen, einschließlich von z.B. anderen Magen-Enzymen und -Proteinen. Derartige Verunreinigungen komplizierten die Entwicklung einer effizienten Verfahrensweise zur Gewinnung und Reinigung.
Obwohl zahleiche Verfahren zur Isolierung von Enzymen aus wäßrigen Lösungen geoffenbart wurden, wie z.B. aus Gärungsbier, beschreibt keine der den Anmeldern der vorliegenden Erfindung bekannten Literaturstellen Verfahren zur Gewinnung und Reinigung von natürlich erzeugtem Chymosin, besonders von natürlich erzeugtem, mit Pepsin und anderen Verunreinigungen vermischtem Chymosin, die ein Flüssig-Flüssig-Zweiphasensystem anwenden.
In diesem Zusammenhang beschreibt US-A4.144.130 die Verwendung (1) eines Gemischs aus hochmolekularem, unsubstituiertem oder substituiertem Polyalkohol, Polyether, Polyvinylpyrrolidon oder Polysaccharid und einem anorganischen Salz, (2) eines Gemischs aus zumindest zwei der obigen hochmolekularen Polymeren zur Gewinnung intrazellulärer Enzyme aus einer wäßrigen Lösung, in die sie aus den Zellen freigesetzt wurden. Unter Verwendung eines Gemischs aus Polyethylenglykol und einem anorganischen Salz geht das gewünschte intrazelluläre Enzym in die obere Polyethylenglykol-Schicht, während die Zellbruchstücke und andere Fermentationsprodukte in die untere salzhältige Schicht gehen. Diese Literaturstelle offenbart, daß die Verteilungskoeffizienten für verschiedene in der Glykolschicht gewonnene Enzyme bei Verwendung normaler Zellmasse etwa 0,3 betrugen und auf etwa 3 erhöht werden konnten, wenn gefrorene Zellen mit Wasser vermischt und aufgebrochen wurden, um deren Enzyme freizusetzen.
In ähnlicher Weise offenbart US-A-4.728.613 ein Verfahren zur Gewinnung von extrazellulär erzeugten Enzymen, wie z.B. Protease, Amylase und mikrobiellem Lab, aus Gärungsvollbier unter Verwendung eines anorganischen Salzes in Verbindung mit einem Polymer, ausgewählt aus der aus Polyethylenglykol, einem Amin-Derivat von Polyethylenglykol, einem Carboxylat-Derivat von Polyethylenglykol, Polypropylenglykol, einem Amin-Derivat von Polypropylenglykol, einem Carboxylat- Derivat von Polypropylenglykol, Poly(ethyienglykol)ester, Polyethylenimin, Trimethylaminopolyethylenglykol, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon und Gemischen davon bestehenden Gruppe. In den Beispiele dieser Literaturstelle werden für derartige extrazelluläre Enzyme Verteilungskoeffizienten von bis zu 80 geoffenbart.
Ebenso beschreiben Kula et al., "Purification of Enzymes by Liquid-Liquid- Extraction", zahlreiche Verfahren zur Reinigung von Enzymen durch Flüssig-Flüssig- Extraktion. Unter zahlreichen geoffenbarten Verfahren beschreiben Kula et al., daß die Zugabe eines Gemischs aus Polyethylenglykol und einem anorganischen Salz zu einer das Enzym enthaltenden, wäßrigen Lösung ein Zweiphasensystem erzeugt, worin die Polyethylenglykol-Phase das Enzym enthält. Kula et al. beschreiben auf Seite 111 weiters, daß das phasenbildende Polymer (Polyethylenglykol) durch Adsorption des Enzyms an Ionenaustauscher, Wegwaschen des phasenbildenden Polymers; und anschließende Gewinnung des Enzyms vom Enzym abgetrennt werden kann.
Andererseits offenbart US-A-4.508.825, daß extrazelluläre Protease und Amylase, die während der Fermentation eines zu deren Herstellung befähigten Mikroorganismus gemeinsam erzeugt wurden, durch Zugabe von Polyethylenglykol und einem kationischen Epihalogenhydrin-Polyamin-Copolymer oder einem Dextran-Polymer zum Fermentationsmedium und Stehenlassen der Polymeren zur Phasentrennung, um eine protease-reiche und eine amylase-reiche Phase zu bilden, voneinander getrennt werden können.
Auch US-A-4.591-563 offenbart ein Verfahren zur gleichzeitigen Reinigung und Konzentration des Dextransaccharase-Enzyms aus dem Kulturmedium auf Saccharose. Im speziellen umfaßt das beschriebene Verfahren die Zugabe eines Polyethers, wie z.B. Polyethylenglykol, um zwei Phasen zu bilden; die erste, eine schwere dextran-reiche Phase, die das konzentrierte und gereinigte Dextransaccharase-Enzym enthält, und die zweite, eine leichtere polyether-reiche Phase, die verunreinigende Enzymaktivitäten enthält und verworfen wird.
In Anbetracht dessen ist es offensichtlich, daß der angeführte Stand der Technik nicht die Gewinnung und Reinigung von natürlich erzeugtem Chymosin aus wäßrigen, Pepsin und andere Verunreinigungen enthaltenden Lösungen unter Verwendung eines wäßrigen Zweiphasensystems, das von der Zugabe von Polyethylenglykol und einem anorganischen Salz herrührt, zusammen mit einem lonenaustausch-Harz offenbart. Andererseits wird die Gewinnung und Reinigung von natürlich erzeugtem Chymosin in industriellem oder kommerziellem Maßstab durch den Einsatz eines derartigen Flüssig- Flüssig-Zweiphasensystems zur Gewinnung von Chymosin und durch die Verwendung eines Ionenaustausch-Harzes zur Reingung von Chymosin stark vereinfacht.
Daher betrifft die vorliegende Erfindung effiziente Verfahren zur Gewinnung und Reinigung von natürlich erzeugtem Chymosin aus wäßrigen Gemischen, die Chymosin, Pepsin und andere Verunreinigungen enthalten und durch wäßrige Extraktion von natürlichen Chymosin-Quellen erhalten wurden.
Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung Gewinnungs- und Reinigungsverfahren für natürlich erzeugtes Chymosin bereit, worin die Gewinnung durch den Einsatz eines Flüssig-Flüssig-Zweiphasensystems und die Reinigung durch den Einsatz eines lonenaustausch-Harzes erzielt wird.
Die vorliegende Erfindung liefert auch ein Gewinnungs- und Reinigungsverfahren für natürlich erzeugtes Chymosin, worin die Gewinnung durch den Einsatz eines Flüssig-Flüssig-Zweiphasensystems erzielt wird, das für die selektive Gewinnung von Chymosin und Pepsin aus anderen in der wäßrigen Lösung befindlichen Verunreinigungen sorgt.
Demzufolge stellt die vorliegende Erfindung auch ein Reinigungsverfahren für natürlich vorkommendes Chymosin aus einer Chymosin und Pepsin enthaltenden Wasser/Polyethylenglykol-Lösung bereit.
In einem Aspekt liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Gewinnung und Reinigung von Chymosin aus einer wäßrigen Lösung, die aus natürlicher Quelle erhaltenes Chymosin und außerdem Pepsin und andere Verunreinigungen enthält, wobei das Verfahren umfaßt:
(a) Einstellen des pH der wäßrigen Lösung auf unter etwa 6,5 und Zugeben einer wirksamen Menge Polyethylenglykol (PEG) und eines anorganischen Salzes zur wäßrigen Lösung, um ein Zweiphasensystem zu bilden;
(b) Absetzen-Lassen des Gemisches aus wäßriger Lösung, Polyethylenglykol und anorganischem Salz zur Trennung in eine chymosin- und pepsin-reiche Polyethylenglykol-Phase und eine chymosin- und pepsin-arme Salz-Phase;
(c) Gewinnen der chymosin- und pepsin-reichen Polyethylenglykol-Phase;
(d) In-Kontakt-Bringen der chymosin- und pepsin-reichen Polyethylenglykol- Phase mit einem Ionenaustausch-Harz unter Bedingungen, wo sich das Chymosin an das Harz bindet und das Polyethylenglykol und das Pepsin durch das Harz hindurchgehen;
(e) Gewinnen des Chymosins aus dem Harz.
Überraschenderweise ging im Extraktionsschritt der größte Teil des Chymosins und des Pepsins in die Polyethylenglykol-Phase, während die anderen Verunreinigungen als Pepsin in der Salzphase zurückblieben. Beim In-Kontakt-Bringen der Polyethylenglykol-Phase mit einem geeigneten Ionenaustausch-Harz bindet sich Chymosin außerdem an das Harz, während das Pepsin hindurchgeht. Danach wird das von Pepsin und anderen Verunreinigungen im wesentlichen freie Chymosin (d.h., die Menge an Verunreinigungen beträgt weniger als 10 Gew.-%, bezogen auf das Gewicht des Chymosins) aus dem Harz gewonnen. Daher stellt das Verfahren der vorliegenden Erfindung ein äußerst effizientes Gewinnungs- und Reinigungsverfahren für natürlich erzeugtes Chymosin dar.
Im allgemeinen kann der pH der wäßrigen Lösung ein beliebiger pH sein, bei dem das Chymosin stabil ist, d.h. etwa 6,5 oder weniger. In einer bevorzugten Ausführungsform wurde jedoch entdeckt, daß der Einsatz von niedrigeren ph-Werten, d.h. pH = 3 oder weniger, vorzugsweise von etwa pH = 2 bis etwa 2,5, in der wäßrigen Lösung im Vergleich zur Verwendung von pH-Werten von über 3 bis zu etwa 6,5 zu höheren Verteilungskoeffizienten (höherer Selektivität) bei der Abtrennung von Chymosin in die Polyethylenglykol-Phase führt.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Die Abtrennung verschiedener Enzyme aus wäßrigen Lösungen unter Verwendung von Polymeren, wie z.B. Polyethylenglykol mit unterschiedlichem Molekulargewicht, in Verbindung mit anderen Polymeren, wie z.B. Dextran, oder anorganischen Salzen ist nach dem Stand der Technik bekannt. Diese Erfindung betrifft jedoch zum Teil die unerwartete Entdeckung, daß Chymosin wirksam aus wäßrigen Lösungen gewonnen und gereinigt werden kann, die natürlich erzeugtes Chymosin, Pepsin und andere Verunreinigungen enthalten, indem eine ausreichende Menge sowohl an Polyethylenglykol als auch an anorganischem Salz der wäßrigen Lösung zugegeben wird, um ein Zweiphasensystem zu bilden. Unter diesen Umständen geht nahezu das gesamte Chymosin und Pepsin in die Polyethylenglykol-Phase. Dies wird durch Verteilungskoeffizienten für Chymosin und Pepsin in der Polyethylenglykol-Phase von über etwa 30, vorzugsweise über etwa 85, veranschaulicht. Andererseits verbleiben die meisten anderen Verunreinigungen in der Salzphase. Daher stellt dieser Extraktionsschritt ein Mittel zur Gewinnung von Chymosin und zu dessen Abtrennung von anderen Verunreinigungen als Pepsin dar.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiters zum Teil die unerwartete Entdeckung, daß, wenn die Polyethylenglykol-Phase anschließend mit einem Ionenaustausch-Harz unter Bedingungen, wo sich das Chymosin an dieses bindet, in Kontakt gebracht wird, das Polyethylenglykol und das Pepsin durch das Harz hindurchgehen. Bei Kombination der beiden Schritte ermöglicht das Verfahren der vorliegenden Erfindung daher die Gewinnung und Reinigung von Chymosin, das im wesentlichen frei von Pepsin und anderen Verunreinigungen ist.
Bevor die vorliegende Erfindung detailliert beschrieben wird, werden jedoch zuerst die folgenden Begriffe definiert:
"Natürlich erzeugtes Chymosin" betrifft Chymosin, das aus Säugetierquellen gewonnen wurde, wie z.B. den Mägen von Rindern (einschießlich des vierten Kälbermagens), Ziegen, Schweinen, Lämmern etc.
"Pepsin" betrifft Pepsin, das aus Säugetierquellen gewonnen wurde, wie z.B. den Mägen von Rindern (einschießlich des vierten Kälbermagens), Ziegen, Schweinen, Lämmern etc. Pepsin wird auch neben Chymosin bei der Extraktion von mazerierten Mägen gewonnen.
"Andere Verunreinigungen" betreffen andere Komponenten als Chymosin und Pepsin, die während der Extraktion von mazerierten Säugetiermägen erhalten werden. Derartige andere Verunreinigungen umfassen beispielsweise Proteine (z.B. Albumin); Enzyme und dergleichen.
"Wäßrige Lösungen, die natürlich erzeugtes Chymosin, Pepsin und andere Verunreinigungen enthalten" betrifft wäßrige Lösungen, die bei der Extraktion von mazeriertem Säugetiermagen-Gewebe erhalten werden, um so natürlich erzeugtes Chymosin zu erhalten. Verfahren zur Herstellung (Mazerisierung) und Extraktion von Chymosin aus derartigem Gewebe sind nach dem Stand der Technik bekannt und werden beispielsweise in "Fundamentals of Dairy Chemistry", 2. Auflage, Webb et al., Hrsg., AVI Publishing Company, S. 674-679 (1983), beschrieben. Mittels derartiger bekannter Extraktionsvorgänge wird auch Pepsin, ebenso wie andere Verunreinigungen aus dem Magengewebe extrahiert. Im allgemeinen hängt die Menge an in die wäßrige Lösung extrahiertem Pepsin von Faktoren, wie z.B. dem Alter des Tieres, von dem der Magen stammte, sowie davon, ob das Tier entwöhnt wurde, ab. Der Magen eines jungen Tieres, das noch gesäugt wird, enthält beträchtlich mehr Chymosin und weniger Pepsin als bei einem älteren, bereits entwöhnten Tier. Andererseits enthalten die Mägen derartiger älterer Tiere weiterhin gewinnbare Mengen an Chymosin.
"Polyethylenglykol" betrifft Polyethylenglykol jeglichen Molekulargewichts, das verwendet werden kann, um Chymosin gemäß vorliegender Erfindung zu extrahieren. Polyethylenglykol ist mit Molekulargewichten im Bereich von etwa 400 bis etwa 22.000 erhältlich. Für die Verwendung hierin bevorzugtes Polyethylenglykol sollte ein Molekulargewicht im Bereich von etwa 600 bis etwa 12.000 aufweisen. Besonders bevorzugtes Polyethylenglykol ist PEG-8000, d.h. Polyethylenglykol mit einem Molekulargewicht von etwa 8.000. Die Auswahl der verwendeten Polyethylenglykols hängt zum Teil von der Zusammensetzung des Gemischs, aus dem das Chymosin extrahiert werden soll, und zum Teil von der Ökonomie des Verfahrens, sowie von anderen Faktoren ab.
"Anorganisches Salz" betrifft jedes beliebige anorganische Salz, das zur Extraktion von Chymosin gemäß vorliegender Erfindung verwendet werden kann. Geeignete anorganische Salze umfassen beispielsweise Sulfatsalze, Phosphatsalze und dergleichen. Die Sulfatsalze, einschließlich von Natriumsulfat, Magnesiumsulfat, Ammoniumsulfat und dergleichen, werden bevorzugt. Außerdem können auch Gemische von geeigneten Salzen, sowie Gemische von derartigen Salzen mit einem oder mehreren Salzen, wie z.ß. Natriumchlorid, das/die selbst mit Polyethylenglykol zu keiner Trennung in ein Zweiphasensystem führt/führen, das/die jedoch in Kombination mit einem geeigneten anorganischen Salz bekannterweise die Verteilungskoeffizienten von Enzymen erhöhen.
Der "Verteilungskoeffizient (K)" ist durch die Formel
K = Ct/Cb
definiert, worin Ct die Gleichgewichtskonzentration der verteilten Verbindung in der oberen Phase ("top phase") und Cb Gleichgewichtskonzentration der verteilten Verbindung in der unteren Phase ("bottom phase") bezeichnet. Daraus geht hervor, daß die quantitative Menge der verteilten Verbindung in jeder Phase von deren Verteilungskoeffizienten, sowie vom Volumen der Phasen abhängt. D.h., daß, falls die verteilte Verbindung einen Verteilungskoeffizienten von 1 aufweist (d.h., die Verbindung in der oberen und unteren Phase gleichmäßig verteilt ist), enthalten die Phasen nur dann gleiche Mengen der verteilten Verbindung, falls die Phasen dasselbe Volumen besitzen. Falls die obere Phase 10% des Volumens der unteren besitzt, enthält die obere Phase bei einem Verteilungskoeffizienten von 1 nur 10% der verteilten Verbindung. Unter Berücksichtigung des oben erwähnten ist weiters klar, daß ein sehr hoher Verteilungskoeffizient für die verteilte Verbindung äußerst wertvoll ist, da er die Gewinnung großer Mengen dieser Verbindung in der oberen Phase ermöglicht, selbst wenn das Volumen der oberen Phase im Vergleich zur unteren relativ gering ist. Daher ermöglichen in der vorliegenden Erfindung sehr hohe Verteilungskoeffizienten den Einsatz geringerer Mengen Polyethylenglykol, obwohl weiterhin sehr hohe Ausbeuten an Chymosin erzielt werden.
"lsoelektrischer Punkt (IP)" betrifft den pH-Wert, bei dem ein Polypeptid elektrostatisch neutral ist, d.h., das Polypeptid trägt eine gleiche Anzahl an positiv und negativ geladenen Funktionalitäten. Der isoelektrische Punkt von Chymosin liegt bei etwa 4,6, jener von Pepsin ebenfalls bei etwa 4,6. Bei einem pH unterhalb des isoelektrischen Punkts besitzen Chymosin und Pepsin eine positive Nettoladung, bei einem pH oberhalb des isoelektrischen Punkts eine negative.
"Ionenaustausch-Harz" betrifft ein protein-verträgliches Harzmaterial, das in der Lage ist, geladene Verbindungen elektrostatisch zu binden. Ionenaustausch-Harze sind nach dem Stand der Technik wohlbekannt und umfassen sowohl Kationen- als auch Anionenaustausch-Harze.
Bei der praktischen Durchführung der vorliegenden Erfindung wird eine Chymosin und Pepsin enthaltende, wäßrige Polyethylenglykol-Lösung mit einem Ionenaustausch-Harz unter Bedingungen in Kontakt gebracht, unter denen Chymosin sich an das Harz bindet. Ob in der vorliegenden Erfindung ein Kationen- oder ein Anionenaustausch-Harz eingesetzt wird, hängt vom pH der Polyethylenglykol-Phase ab, d.h. davon, ob der pH der Lösung oberhalb oder unterhalb des isoelektrischen Punkts von Chymosin liegt.
Daher bedeutet "In-Kontakt-Bringen einer Chymosin enthaltenden Lösung mit einem Ionenaustausch-Harz unter Bedingungen, wo sich das Chymosin an das Harz bindet" nur, daß der pH der Lösung auf oberhalb oder unterhalb dessen isoelektrischen Punkts eingestellt wird, sodaß sich das Chymosin an das verwendete Harz bindet.
Andererseits wurde unerwarteterweise entdeckt, daß Pepsin sich unter diesen Bedingungen nicht an das Ionenaustausch-Harz bindet, obwohl Pepsin einen ähnlichen isoelektrischen Punkt besitzt wie Chymosin.
Der pH der wäßrigen Polyethylenglykol-Lösung liegt im allgemeinen bei etwa 6,5 oder darunter, obwohl ein pH in der Nähe des isoelektrischen Punkts von Chymosin, d.h. bei etwa 3,6 bis 5,0, aufgrund der niedrigen elektrostatischen Nettoladung von Chymosin nicht bevorzugt werden, da diese die Effizienz der Bindung an das Harz verringert. Zusätzlich unterläuft Chymosin eine wirksamere Autolyse, wenn die Polyethylenglykol-Lösung (Phase) bei einem pH von etwa 3 - 5 gehalten wird, wenn auch beträchtlich langsamer als in Wasser. In jedem Fall führt das Halten der wäßrigen Polyethylenglykol-Phase bei einem pH von etwa 3 - 5 aufgrund von Autolyse zu Verlusten bei der Chymosin-Ausbeute. Daher wird bei Verwendung eines Kationenaustausch-Harzes bevorzugt, den pH der Lösung unterhalb von etwa 3,0 zu halten; während bei Verwendung eines Anionenaustausch-Harzes bevorzugt wird, einen pH von über etwa 5,0 beizubehalten.
Bevorzugte Kationenaustausch-Harze zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung sind beispielsweise IBF SP-Spherodex, Pharmacia SP-Sephadex, Indion SP-2, IBF SP-Trisacryl und dergleichen. Bevorzugte Anionenaustausch-Harze zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung sind beispielsweise IBF Q-Spherodex, Pharmacia Q- Sephadex, Indion Q-2, IBF Q-Trisacryl und dergleichen.
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung dienen zur Gewinnung und Reinigung von natürlich erzeugtem Chymosin. Bei der Gewinnung und Reinigung von natürlich erzeugtem Chymosin kann die Chymosin, Pepsin und andere Verunreinigungen enthaltende, wäßrige Lösung in ihrer Rohform eingesetzt werden, d.h. die bei der Extraktion mazerierter Mägen erhaltene Lösung, oder die Lösung kann, falls gewünscht, zuerst filtriert werden, um die meisten oder alle Feststoffe zu entfernen, wonach das flüssige Filtrat in den Verfahren der vorliegenden Erfindung eingesetzt wird.
Im ersten Schritt der vorliegenden Erfindung wird natürlich erzeugtes Chymosin gewonnen, indem der Chymosin, Pepsin und andere Verunreinigungen enthaltenden, wäßrigen Lösung wirksame Mengen an Polyethylenglykol (PEG) und eines anorganischen Salzes zugegeben werden, um ein Zweiphasensystem zu bilden. Die erhaltene Lösung wird stehengelassen, um sich in eine chymosin- und pepsin-reiche Polyethylenglykol-Phase und eine chymosin- und pepsin-arme Salzphase zu trennen. Die chymosin- und pepsin-reiche Polyethylenglykol-Phase wird anschließend nach herkömmlichen Verfahren gewonnen.
Es wurde entdeckt, daß unter diesen Bedingungen für Chymosin und Pepsin Verteilungskoeffizienten in der Polyethylenglykol-Phase von über 30, vorzugsweise über 85, erreicht werden. Obwohl die Polyethylenglykol-Extraktion sich auch zur Gewinnung von Chymosin bei höheren pH-Werten eignet, d.h. bei pH = 6,5 oder darunter, ist sie wirkungsvoller, wenn das Verfahren bei einem pH von unter etwa 3 durchgeführt wird. Bei derartigen nidrigeren pH-Werten können für Chymosin und Pepsin Verteilungskoeffizienten von bis zu 100 oder darüber erzielt werden. Hohe Verteilungskoeffizienten sind deshalb besonders nützlich, da sie den Einsatz geringerer Mengen an Polyethylenglykol ermöglichen, um die gewünschte Abtrennung von Chymosin aus dem Gärungsbier zu erreichen, was wiederum die spätere Abtrennung des Chymosins vom Polyethylenglykol erleichtert, d.h., es ist weniger abzutrennendes Polyethylenglykol vorhanden.
Weiters wurde entdeckt, daß als Folge einer einzelnen Extraktion die Polyethylenglykol-Phase sogar bis zu 95% oder mehr des gesamten, anfänglich in der wäßrigen Lösung vorhandenen Chymosins enthalten kann und, wenn überhaupt, sehr wenig der anderen Verunreinigungen enthält. Zusätzlich zur Bereitstellung eines Mittels zur Gewinnung des im wesentlichen gesamten, natürlich erzeugten, in der wäßrigen Lösung enthaltenen Chymosins und Pepsins liefert dieser Aspekt der vorliegenden Erfindung daher auch ein Mittel zur Gewinnung des Chymosins und zu dessen Abtrennung von anderen Verunreinigungen als Pepsin.
Im nächsten Schritt der vorliegenden Erfindung wird die das extrahierte Chymosin und Pepsin enthaltende Polyethylenglykol-Phase von der oder den anderen Phase(n) abgetrennt und mit einem Ionenaustausch-Harz in Kontakt gebracht, während der pH so gehalten oder eingestellt wird, daß sich das Chymosin an das Harz bindet. Da das Polyethylenglykol unter diesen Bedingungen ungeladen ist, geht es durch das Harz hindurch. Überraschenderweise bindet sich unter diesen Bedingungen auch das Pepsin nicht an das Ionenaustausch-Harz und geht durch dieses hindurch. Dieser Schritt bewirkt daher die Reinigung des Chymosins, nicht nur von Polyethylenglykol sondern auch von Pepsin. Wenn daher die isolierte, das extrahierte Chymosin und Pepsin enthaltende Polyethylenglykol-Phase mit dem Ionenaustausch-Harz unter Bedingungen in Kontakt gebracht wird, wo sich das Chymosin an das Harz bindet, wird im wesentlichen das gesamte Chymosin dem Polyethylenglykol entzogen und an das Ionenaustausch-Harz gebunden; das Polyethylenglykol und das Pepsin gehen durch die Harzsäule hindurch. Nach dem anfänglichen Kontakt wird das Harz entweder mit Wasser oder mit Wasser und Salz, vorzugsweise unter Bedingungen, unter denen das Chymosin nicht vom Harz entfernt wird, gewaschen, um das übrige Polyethylenglykol und Pepsin zu entfernen. Anschließend wird das Chymosin unter Verwendung einer Salzlösung und eines Puffers bei einem pH, wo das Chymosin von der Säule abgelöst wird, aus der Säule eluiert. Durch die hohe Selektivität der Chymosin-Gewinnung ist es unnötig, eine Gradienten- oder eine schrittweise Elution des Harzes durchzuführen, da Chymosin im wesentlichen das einzige aus der Polyethylenglykol-Phase an das Harz gebundene und in der Folge freigesetzte Enzym oder Material ist. Deshalb kann das Chymosin unter Verwendung der Salzlösung und unter Erhöhung oder Senkung des pH (natürlich je nachdem, ob ein Kationen- oder ein Anionenaustausch-Harz eingesetzt wird), um die gesamte an das Harz gebundene Chymosinmenge in einem einzigen Schritt auf einmal zu eluieren. Vorzugsweise wird der Elutionslösung ein Salz zugegeben, um die Geschwindigkeit oder den Grad der Elution zu fördern oder, in manchen Fällen, d.h. bei Kationenaustausch-Harzen, um die Elution des Chymosins aus dem Harz zu bewirken, z.B. 50 mM Natriumphosphat/2 mM NaCl, pH = 5,8. In der Elutionslösung werden vorzugsweise Salze verwendet, da Chymosin in handelsüblicher Form üblicherweise in Salzlösung verkauft wird, weshalb das Salz geeigneterweise an diesem Punkt in das Chymosin eingebaut wird.
Folglich führt die Gewinnung und Reinigung von Chymosin auf diese Weise zu Chymosin, das im wesentlichen frei von Pepsin und anderen Verunreinigungen ist, d.h., die Menge an Verunreinigungen beträgt weniger als etwa 10 Gew.-%, vorzugsweise weniger als etwa 5 Gew.-%, bezogen auf das Gewicht von Chymosin. D.h., das erhaltene Chymosin-Produkt zumindest ist zu 90 Gew.-% rein und kann ohne wesentliche Weiterbehandlung zur Entfernung von Verunreinigungen für die kommerzielle Verwendung präpariert werden. Das kommerzielle Chymosin-Produkt wird üblicherweise auf etwa 5 g/gal oder etwa 1,5 g/l Chymosin verdünnt. Die Konzentration des Salzes (üblicherweise NACl) wird normalerweise auf etwa 18% erhöht und ein Konservierungsmittel, wie z.B. Natriumbenzoat, zugegeben. Das konzentrierte Endprodukt mit Nahrungsmittelqualität wird üblicherweise ebenso einer Endfiltration unterzogen, um gegebenenfalls vorhandene, unerwünschte Feststoffe oder Teilchen zu entfernen.
Obwohl im gesamten Verfahren auch höhere pH-Werte eingesetzt werden können (pH-Werte von bis zu etwa 6,5), ist die Effizienz des Gemischs aus Polyethylenglykol und anorganischem Salz bei der Extraktion des Chymosins aus der Chymosin, Pepsin und andere Verunreinigungen enthaltenden, wäßrigen Lösung und dadurch die Effizienz des Verfahrens nicht so hoch, als wenn während des Extraktionsschritts ein niedriger pH beibehalten wird. Daher wird bevorzugt, einen niedrigen pH und demgemäß ein Kationenaustausch-Harz zu verwenden, um die Effizienz des Gesamtverfahrens zu erhöhen.
Bei Kombination der bevorzugten Aspekte der oben beschriebenen Erfindung, indem die Polyethylenglykol-Extraktion bei einem pH von etwa 3 oder darunter durchgeführt und die abgetrennte Polyethylenglykol-Phase bei niedrigem pH mit einem Kationenaustausch-Harz in Kontakt gebracht wird, wurde entdeckt, daß eine einzige Polyethylenglykol-Extraktion und ein einmaliger Durchgangskontakt mit dem Ionenaustausch-Harz sogar bis zu 90 - 95% des in der wäßrigen Ausgangslösung enthaltenen Chymosins erfaßt.
Andererseits liefert auch der Einsatz höherer pH-Werte im Polyethylenglykol- Extraktionsschritt, sowie eines Anionenaustausch-Harzes unter Beibehaltung des pH oberhalb des isoelektrischen Punkts von Chymosin annehmbare Ergebnisse. Falls jedoch bei der Extraktion des Chymosins ein höherer pH und beim Kontakt der Lösung mit dem Harz ein niedrigerer pH gewünscht wird, kann dies leicht erreicht werden, indem einfach der ph des Polyethylenglykol-Extrakts auf unterhalb des isoelektrischen Punkts von Chymosin, vorzugsweise auf etwa 3,6 oder darunter, noch bevorzugter auf pH = 3 oder darunter, eingestellt und das Chymosin anschließend mit einem Kationenaustausch-Harz in Kontakt gebracht wird.
Neben der hohen Effizienz der Gewinnung von Chymosin und Pepsin, besonders von Chymosin, durch die hierin beschriebene Verwendung des Gemischs aus Polyethylenglykol und anorganischem Salz wurde weiters entdeckt, daß die Löslichkeit von Chymosin in Polyethylenglykol offenbar so hoch ist, daß das Chymosin aus der wäßrigen Phase sehr rasch in die Polyethylenglykol-Phase übergeht. Die für die Extraktion des Chymosins in die Polyethylenglykol-Phase benötigte Zeitspanne ist üblicherweise so kurz, daß sie keinen nennenswerten Faktor bei der Verfahrensplanung darstellt. Dieses Verfahren ist daher bei Betrieb sehr effizient und ökonomisch und kann leicht zur kommerziellen Produktion in größerem Maßstab durchgeführt werden.
Wie zu erkennen ist, und unabhängig vom pH-Wert umfaßt das hierin beschriebene Verfahren die Wanderung des Chymosins und Pepsins aus dem wäßrigen Gemisch in die hydrophobere Polyethylenglykol-Phase. Dies erfolgt zumindest teilweise aufgrund der Salzkonzentration in der oder den Nicht-Polyethylenglykol-Phase(n). Bei Verwendung eines niedermolekularen Polyethylenglykols ist die Polyethylenglykol- Phase weniger hydrophob, und es ist eine höhere Salzkonzentration in der/den Polyethylenglykol-Phase(n) erforderlich, was die Betriebskosten erhöht. Bei Verwendung eines höhermolekularen Polyethylenglykols ist im Verfahren weniger Salz vonnöten, die Trenngeschwindigkeit kann jedoch aufgrund der hohen Viskosität des höhermolekularen Polyethylenglykols niedriger sein. Daher kann das Verfahren der vorliegenden Erfindung für jeden speziellen Betrieb optimiert werden, indem das gewünschte Molekulargewicht des Polyethylenglykols, die Salzkonzentration und andere Parameter, die für die gewünschte Ökonomie sorgen, geeignet ausgewählt werden. Ein Ziel ist üblicherweise die Minimierung der für die Wanderung des Chymosins in die Polyethylenglykol-Phase benötigte Zeitspanne, ein weiteres üblicherweise die Minimierung der verwendeten Salzmenge, um den Übergang des im wesentlichen gesamten Chymosins in die Polyethylenglykol-Phase zu bewirken. Obwohl die Salzkonzentration in den Nicht-Polyethylenglykol-Phasen 20 Gew.-% oder mehr betragen kann, sind bei geeignetem Polyethylenglykol üblicherweise weniger als etwa 150% erforderlich. Beispielsweise eignen sich bei PEG-8000 etwa 10 - 13% Natriumsulfat. Andererseits wird die minimale Salzkonzentration durch die für die Bildung eines zweiphasigen Systems mit Polyethylenglykol erforderliche Salzkonzentration vorgegeben. In einer bevorzugten Ausführungsform liegt die Konzentration an anorganischem Salz jedoch bei etwa 8,5% bis etwa 20% w/v, bezogen auf das Volumen der Chymosin, Pepsin und andere Verunreinigungen enthaltenden, wäßrigen Lösung.
Ebenso beträgt die hierin verwendete Polyethylenglykol-Konzentration vorzugsweise weniger als etwa 20%, noch bevorzugter weniger als etwa 15%, w/v, bezogen auf das Volumen der Chymosin, Pepsin und andere Verunreinigungen enthaltenden, wäßrigen Lösung. Aus Gründen der Ökonomie und der leichteren Trennung wird vorzugsweise so wenig Polyethylenglykol wie möglich verwendet.
Die genauen Konzentrationen an hierin verwendetem Polyethylenglykol und anorganischem Salz sind von ausgebildeten Fachleuten leicht zu bestimmen.
Nach der Bindung des Chymosins an das Ionenaustausch-Harz ist die gewonnene Polyethylenglykol-Phase mit Pepsin verunreinigt. Das Pepsin kann aus dieser Lösung nach bekannten Verfahren gewonnen und das Polyethylenglykol rezykliert werden. Alternativ dazu kann das Polyethylenglykol verworfen werden.
Andererseits kann das Ionenaustausch-Harz zur Verwendung bei nachfolgenden Chargen von Chymosin enthaltendem Polyethylenglykol regeneriert werden, indem es mit einer wäßrigen Lösung mit geeignetem pH gewaschen wird. Wenn beispielsweise ein Kationenaustausch-Harz verwendet wird, kann es durch Waschen mit einer wäßrigen Lösung von für einen pH von etwa 2 ausreichender Schwefelsäure regeneriert werden.
Aufgrund der obigen Aspekte vorliegender Erfindung, die die Wiederverwendung der Ionenaustausch-Harze ermöglichen, eignen sich die Verfahren dieser Erfindung für den kommerziellen und industriellen Betrieb zur Reinigung von indutriellen Mengen von Chymosin, besonders von natürlich erzeugtem Chymosin.
Nach der allgemeinen Beschreibung der Erfindung ist diese leichter zu verstehen, wenn auf die folgenden Ausführungsformen der Erfindung Bezug genommen wird, die durch die folgenden Beispiele illutriert werden. Der Schutzumfang der vorliegenden Erfindung wird jedoch durch die beigefügten Ansprüche bestimmt, während die folgenden Beispiele nur illustrative Ausführungsformen spezieller Durchführungsarten der hierin beschriebenen Erfindung darstellen.

BEISPIELE

Beispiel 1

Dieses Beispiel beschreibt die Anwendung eines wäßrigen Zweiphasen- Polyethylenglykol-Extraktionsverfahrens, gefolgt vom Kontakt mit einem Ionenaustausch-Harz, um aus Rindermägen Chymosin mit Nahrungsmittelqualität zu produzieren. Das Chymosin wird aus Rindermägen gewonnen, die große Mengen an Rinderpepsin und eine geringere Menge an Chymosin enthalten. Die hierin verwendete wäßrige Lösung wird durch Zerfasern von Rindermägen in einem geeigneten flüssigen Medium und Abfiltrieren der Zellbruchstücke hergestellt. Die resultierende wäßrige Lösung enthält natürlich erzeugtes Chymosin, Pepsin und andere Verunreinigungen.
In diesem Beispiel wurden 500 ml Rinderextrakt mit Schwefelsäure auf pH = 2 eingestellt. 20 g PEG-8000 (4% w/v) und 55 g wasserfreies Natriumsulfat (11% w/v) wurden dem Extrakt zugefügt. Der Extrakt wurde auf 37ºC erwärmt, um die Löslichkeit des Sulfatsalzes zu erhöhen. Das Gemisch wurde durch Zentrifugation (Sorvall Zentrifuge) bei etwa 5000 x g über etwa 15 min in zwei Phasen getrennt und die Polyethylenglykol-Phase (obere Phase) von der Salzphase (untere Phase) durch Entfernen der unteren Phase mittels einer peristaltischen Pumpe abgetrennt. Die Polyethylenglykol-Phase wurde 1:3 mit entionisiertem Wasser verdünnt. Der pH dieser Phase wurde mit 2,7 bestimmt und mit Schwefelsäure auf 2,3 eingestellt. Die verdünnte Polyethylenglykol-Phase wurde anschließend über ein Ionenaustausch-Harz geleitet, das aus IBF Spherodex-SP (einem protein-verträglichen Kationenaustausch-Harz) bestand und zuvor in Wasser mit pH = 2 äquilibriert worden war, um das Chymosin zu binden. Die durchgeflossene Polyethylenglykol-Lösung wurde gesammelt und enthielt Pepsin. Das Harz wurde mit einer Lösung von 0,5 M NaCl mit pH = 2,0 eluiert, um übriges Polyethylenglykol und Pepsin zu entfernen; die Waschlösung wurde gesammelt. Das Harz wurde danach mit einer Lösung von 0,05 M Natriumphosphat mit pH = 5,8, die 2 M NaCl enthielt, eluiert, um das Chymosin auf einmal freizusetzen. Anschließend wurde die eluierte Flüssigkeit gewonnen, die Chymosin enthielt, das im wesentlichen frei von Pepsin und anderen Verunreinigungen war.
Zur Unterscheidung der relativen Mengen an Rinderpepsin und -chymosin im Produkt wurde der folgende Assay durchgeführt. Es wurde die Milchgerinnungs- Fähigkeit der verschiedenen Lösungen unter Verwendung einer Rollflaschen- Vorrichtung gemessen. Magermilch mit ph = 6 und 6,5 wurde hergestellt. Rinderpepsin zeigte stärkere Aktivität bei pH = 6, Chymosin bei pH = 6,5. Die Gerinnungsaktivitäten werden mit einem aus 90% Chymosin und 10% Pepsin bestehenden Standard verglichen. Das Aktivitätsverhältnis bei pH = 6 bis 6,5 ist dann ein Maß für die relativen Mengen der beiden Enzyme. Der Standard liefert definitionsgemäß ein Verhältnis von 1. Da Rinderpepsin bei pH = 6 aktiver ist als bei 6,5, ist das Aktivitätsverhältnis bei pH = 6 und 6,5 größer als 1 und ist bei reinem Pepsin nahezu 2. Andererseits liegt das Verhältnis bei großen Mengen an Chymosin unter 1, nahezu bei 0,5 oder darunter.
In diesem Assay wies die wäßrige Lösung von Chymosin, Pepsin und anderen Verunreinigungen (bei pH = 6,5) eine Gesamtkonzentration von Chymosin und Pepsin von 16,64 CHU/ml auf. Nach der Abtrennung der oberen Phase wurde diese auf das Harz aufgebracht. Die Ergebnisse der Harzreinigung werden mit Durchfluß (das, ohne gebunden zu werden, durch das Harz durchgehende Material); Waschflüssigkeit (das während des Waschvorgangs zur Entfernung von Pepsin und anderen Verunreinigungen aus dem Harz austretende Material); und Eluat (das beim Eluieren zur Gewinnung von Chymosin gewonnene Material) bezeichnet. Die Ergebnisse dieses Assays waren die folgenden: Getestete Probe Konzentration von Chymosin und Pepsin Verhältnis (6/6.5) Ausgangsmaterial Extraktion von 500ml obere Phase b untere Phase Durchfluß Waschflüssigkeit Eluat a = CHU, Chris. Hansen Einheit - 1 CHU/ml ergibt unter den folgenden Bedingungen:
Substrat: 110 g von bei geringer Hitze sprühgetrocknetem Magermilchpulver werden in 1000 ml 0,05%-igem Kalziumchlorid suspendiert. Die Milch wird 30 min lang bei Raumtemperatur gerührt und danach weitere 30 min lang stehengelassen. Die Milch sollte bei einer Temperatur von 4 - 25ºC und nicht länger als 3 h lang gelagert werden. Der pH der Milch beträgt etwa 6,5;
Temperatur: 32 ± 0,2ºC in einem temperaturgeregelten Wasserbad;
Enzymzugabe: Zu 25 ml der rekonstituierten Magermilch werden 0,5 ml Enzymlösung zugegeben, die so verdünnt ist, um eine Gerinnungszeit von 380 - 500 s zu ergeben;
eine Gerinnungszeit von 410 - 460 s.
b = Der Verteilungskoeffizient für Chymosin/Pepsin beträgt 114.
Aus den obigen Daten geht hervor, daß das im Eluat gewonnene Material von Pepsin und anderen Verunreinigungen im wesentlichen freies Chymosin ist. Daher ermöglicht das Verfahren der vorliegenden Erfindung die effiziente Gewinnung von Chymosin aus natürlichen Chymosin-Quellen.
In ähnlicher Weise kann Chymosin nach den folgenden Vorgangsweisen gewonnen und gereinigt werden, indem bei einem pH von etwa 5 - 6,5 unter Verwendung eines Anionenaustausch-Harzes extrahiert wird. Geeignete Anionenaustausch-Harze, die anstelle des Kationenaustausch-Harzes im obigen Beispiel verwendet werden können, sind beispielsweise IBF Q-Spherodex, Pharmacia Q- Sephadex, Indion Q-2, IBF Q-Trisacryl und dergleichen.

Beispiel 2

Auf ähnliche Weise wie bei dem in Beispiel 1 zuvor beschriebenen Extraktionsvorgang, jedoch unter Verwendung eines pH von etwa 5,8, wurden die nachstehend angeführten Enzyme einzeln aus einer wäßrigen Lösung in die Polyethylenglykol-Phase des Flüssig-Flüssig-Zweiphasensystems extrahiert, um die folgenden Ergebnisse zu liefern (wobei reine Enzyme eingesetzt wurden): Enzym Protein (mg/ml) Aktivität CHU/ml Verteilungskoeffizient Kälberchymosin Rinderpepsin Schweinepepsin E. parasitica-Asparagin-Protease M. miehei-Asparagin-Protease
Dieser Versuch wurde mit den folgenden Ergebnissen wiederholt, diesmal jedoch bei pH = 2 - 2,5: Enzym Protein (mg/ml) Aktivität CHU/ml Verteilungskoeffizient Kälberchymosin Rinderpepsin Schweinepepsin E. parasitica-Asparagin-Protease M. miehei-Asparagin-Protease
c = Verteilungskoeffizienten von etwa 200 oder darüber sind wegen assaybedingten Beschränkungen kaum genau zu messen. D.h., da der Verteilungskoeffizient ein Verhältnis der Chymosin-Konzentration in der oberen Phase zur Chymosin- Konzentration in der unteren Phase ist und da weiters die Menge an Chymosin in der unteren Phase im allgemeinen sehr gering ist, daß geringe Änderungen in dieser unteren Konzentration starke Schwankungen beim Verteilungskoeffizienten ergeben. Außerdem variiert die mittels Assays bestimmte Konzentration besonders bei sehr geringen Konzentrationen.
Die obigen Ergebnisse zeigen, daß Chymosin und Pepsin in diesem System hohe Verteilungskoeffizienten besitzen. Es ist jedoch ebenso klar, daß die Verteilungskoeffizienten für Rinderpepsin beim Übergang von pH = 5,8 zu pH = 2 -2,5 beträchtlich zunehmen. Daher kann es vorzuziehen sein, die Extraktion bei einem pH von über etwa 5 durchzuführen, um die Menge an Pepsin in der Polyethylenglykol- Phase zu verringern. Andererseits nehmen die Verteilungskoeffizienten für Chymosin beim Übergang von pH = 5,8 zu pH = 2 - 2,5 ebenfalls beträchtlich zu. Falls daher die Extraktion bei einem pH von über etwa 5 erfolgt, würde auch die Menge an gewonnenem Chymosin etwas verringert werden, wenn auch in geringerem Maße, da der Verteilungskoeffizient von Chymosin bei einem pH = 5,8 höher ist als jener von Rinderpepsin.

Claims

1. Verfahren zur Gewinnung und Reinigung von Chymosin aus einer wäßrigen Lösung, die aus natürlicher Quelle erhaltenes Chymosin und außerdem Pepsin und andere Verunreinigungen enthält, wobei das Verfahren umfaßt:

(a) Einstellen des pH der wäßrigen Lösung auf unter etwa 6,5 und Zugeben einer wirksamen Menge Polyethylenglykol (PEG) und eines anorganischen Salzes zur wäßrigen Lösung, um ein zweiphasiges System zu bilden;

(b) Absetzen-Lassen des Gemisches aus wäßriger Lösung, Polyethylenglykol und anorganischem Salz zur Trennung in eine chymosin- und pepsin-reiche Polyethylenglykol-Phase und eine chymosin- und pepsin-arme Salz-Phase;

(c) Gewinnen der chymosin- und pepsin-reichen Polyethylenglykol-Phase;

(d) In-Kontakt-Bringen der chymosin- und pepsin-reichen Polyethylenglykol- Phase mit einem Ionenaustausch-Harz unter Bedingungen, wo sich das Chymosin an das Harz bindet und das Polyethylenglykol und das Pepsin durch das Harz hindurchgehen;

(e) Gewinnen des Chymosins aus dem Harz.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin der pH der wäßrigen Lösung etwa 3 oder weniger beträgt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin der pH der wäßrigen Lösung weniger als etwa 2,8 beträgt.

4. Verfahren nach irgendeinem der vorangegangenen Ansprüche, worin das durchschnittliche Molekulargewicht des Polyethylenglykols etwa 600 bis etwa 12.000 beträgt.

5. Verfahren nach irgendeinem der vorangegangenen Ansprüche, worin das durchschnittliche Molekulargewicht des Polyethylenglykols etwa 5.000 bis etwa 10.000 beträgt.

6. Verfahren nach irgendeinem der vorangegangenen Ansprüche, worin das anorganische Salz aus der aus Sulfatsalzen und Phosphatsalzen bestehenden Gruppe ausgewählt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, worin das anorganische Salz ein Sulfatsalz ist.

8. Verfahren nach Anspruch 7, worin das Sulfatsalz aus der aus Natriumsulfat, Magnesiumsulfat und Ammoniumsulfat bestehenden Gruppe ausgewählt wird.

9. Verfahren nach irgendeinem der vorangegangenen Ansprüche, worin die wäßrige Lösung vor der Zugabe des Polyethylenglykols und des anorganischen Salzes zuerst filtriert wird.

10. Verfahren nach Anspruch 1, worin der pH der chymosin- und pepsin-reichen Polyethylenglykol-Phase entweder zwischen 5,0 und 6,5 oder etwa 3,0 oder weniger beträgt.

11. Verfahren nach Anspruch 10, worin der pH der chymosin- und pepsin-reichen Polyethylenglykol-Phase etwa 3,0 oder weniger beträgt und ein Kationen-Austauschharz verwendet wird.

12. Verfahren nach Anspruch 11, worin der pH der chymosin- und pepsin-reichen Polyethylenglykol-Phase etwa 2,0 - 2,5 beträgt.

13. Verfahren nach Anspruch 10, worin der pH der chymosin- und pepsin-reichen Polyethylenglykol-Phase etwa 5,0 bis etwa 6,5 beträgt und ein Anionen-Austauschharz verwendet wird.

14. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Extraktionsschritt a) bei einem pH von etwa 3,0 oder weniger durchgeführt wird und nach dem Isolieren der Polyethylenglykol-Phase der pH dieser Phase auf etwa 5,0 bis etwa 6,5 eingestellt und ein Anionen-Austauschharz verwendet wird.