DE68911503T2

DE68911503T2 - Wiedergewinnung von urokinaseverbindungen.

Info

Publication number: DE68911503T2
Application number: DE68911503T
Authority: DE
Inventors: Timothy Edmunds; Susan Foley
Original assignee: Abbott Biotech Inc
Current assignee: Abbott Biotech Inc
Priority date: 1988-06-10
Filing date: 1989-05-25
Publication date: 1994-06-16
Anticipated expiration: 2009-05-26
Also published as: DE68911503D1; WO1989012099A1; EP0379545A4; CA1309961C; AU3839189A; US4920051A; JP2833811B2; AU618381B2; EP0379545B1; JPH02504588A; EP0379545A1

Description

Hintergrund der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Rückgewinnung von enzymatisch aktiver Urokinase und Prourokinase aus einer Lösung wie etwa einem Kulturmedium oder Zellextrakt unter Verwendung eines Chromatographieharzes. Die Erfindung beruht auf der Entdeckung, daß ein Harztyp, der ursprünglich entwickelt wurde, um Immunglobuline selektiv zu binden, Prourokinase und Urokinase bindet und selektiv eluiert werden kann und somit für die großtechnische Reinigung von Prourokinas und Urokinase aus diese Proteine enthaltenden Lösungen brauchbar ist.
Urokinase ist ein nützliches Fibrinolytikum zur Auslösung des Kaskadenmechanismus, der potentiell tödliche Thrombosen auflöst. Urokinase ist ein zweikettiges Glykoprotein mit einem MOLEKULARGEWICHT von ca. 32 000-34 000 Dalton und einer spezifischen Aktivität von ca. 250 000 CTA-Einheiten pro Molekulargewicht Protein. Es ist ein enzymatisch aktives Spaltprodukt von enzymatisch inaktiver Prourokinase. Prourokinase ist ein einkettiges Glykoprotein mit einem Molekulargewicht von ca. 45 000-55 000 Dalton. Anders als Urokinase ist Prourokinase nicht aktiv, ist jedoch spezifisch für den Ort des Thrombus. Plasmin spaltet Prourokinase an diesem Ort in enzymatisch aktive Urokinase.
Beide Formen sind aus dem Harn auf verschiedene Weisen isoliert worden. Eine Methode umfaßt die Behandlung des Harns mit einem Reagens (z. B. Bentonit oder anderen Aluminiumsilikaten), das die Bildung von Urokinase enthaltenden Präzipitaten bewirkt, und anschließendes Eluieren der Urokinase aus den Präzipitaten. Bei anderen Verfahren wird der Harn mit einem absorbierenden Reagans in Kontakt gebracht und das Absorbens anschließend eluiert. Bekannte Absorptionsmaterialien, die zu diesem Zweck eingesetzt werden, umfassen beispielsweise Calciumcarbonat, Bariumsulfat, Aluminiumoxid, Calciumphosphat, Zinkhydroxid, Aktivkohle und hydratisierte Aluminiumsilikate. Verschiedene Kationenaustauschharze sind für diesen Zweck ebenfalls brauchbar (z. B. US 2 983 647; US 2 989 440).
Chromatographische Ausschlußverfahren werden angewandt, die die Verwendung beispielsweise von DEAE-Celluloseharz oder vernetzten Dextran-Gelen vom Methacrylsäure-Carbonsäure-Typ umfassen (z. B. US 3 256 158). Bei einem solchen Verfahren bindet das Harz unreine Proteine und Pyrogene, und die Urokinase verbleibt in Lösung.
Seit einiger Zeit werden Affinitäts-Chromatographieverfahren angewandt unter Einsatz verschiedener Reagenzien mit einer Affinität für Urokinase, die an einen wasserunlöslichen festen Träger gebunden ist oder daran haftet, etwa an Diatomit, Agarose, Cellulose, Kollagen und anderen Adsorptionsmitteln. Die Affinitätsreagenzien umfassen unter vielen anderen basische Aminosäuren, Agmatin, Aprotinin, Derivate von Guanidin und Adenin, Fibrin sowie Antikörper, die Urokinase erkennen.
Die Reinigung ist auch mit verschiedenen elektrophoretischen und HPLC-Einrichtungen versucht worden.
Bei dem Versuch, klinisch brauchbare Mengen von Urokinase- Verbindungen zu erhalten, sind Zellen in vitro gezüchtet worden, von denen bekannt ist, daß sie diese Proteine erzeugen (z. B. Niere und Lunge). Solche Zellen umfassen unentwickelte und reife Niere, reife und unentwickelte Lunge, reifes und unentwickeltes Herz, Plazenta, reife Schilddrüse, Milz und Harnleiter von Menschen und grünen oder Rhesusaffen. Die von den Kulturmedien dieser Zellen erhaltene Ausbeute ist aber immer noch nicht groß, und zwar trotz der Versuche, den Ertrag dadurch zu steigern, daß die Kulturmedien mit Induktoren (beispielsweise verschiedenen Aminosäuren, Sacchariden, Hormonen, Fumarsäure, Äpfelsäure, Bernsteinsäure und/oder Glykolsäure) angereichert oder die Proteolyse und Denaturierung verringert werden (beispielsweise mit Metallchelatbildnern, Pronase und Trypsininhibitoren). Weitere Versuche, die Urokinase-Produktion von Kulturzellen zu steigern, wurden unternommen durch Züchten von Urokinase- erzeugenden lymphoiden Hybridomzellen, die vorher in ein nichthumanes, warmblütiges Tier in Anwesenheit eines Urokinase-Induktors eingepflanzt und vermehrt wurden (US 4 537 852). Dieses Verfahren ist jedoch in seiner Durchführung teuer und zeitaufwendig.
Mit dem Aufkommen der DNA-Rekombinationstechnik wurden Zelllinien entwickelt und gezüchtet, die gentechnisch verändert waren, um große Mengen von Prourokinase zu produzieren. Diese Zellinien umfassen Mikroorganismen wie E. coli, Hefe, Bacillus und Neurospora sowie Säugetier-Zellinien einschließlich Nierenzellen und Fibroblasten von Affen und Menschen. Die exprimierte Prourokinase muß dann aus dem Zellextrakt oder flüssigem Wachstumsmedium, in das sie sekretiert wurde, in aktiver Form rückgewonnen werden. Die Rückgewinnung wird erreicht unter Anwendung von im wesentlichen den gleichen Methoden, wie sie oben für die Reinigung aus Harn beschrieben wurden.
Die Rückgewinnung aus Kulturmedien ist eine bedeutende Aufgabe insofern, als solche Medien charakteristisch viele andere, nichtverwandte Proteine enthalten, von denen einige proteolytische Aktivität haben. Beispielsweise ist von mit Serum angereicherten Medien bekannt, daß sie Plasmin und andere Serumproteasen enthalten, die Prourokinase rasch abbauen. Die meisten bekannten Reinigungsverfahren schützen Urokinase-Verbindungen nicht ausreichend gegen proteolytischen Abbau, und zwar ungeachtet von Versuchen, dies durch die Zugabe von Metallchelatbildnern und verschiedenen Protease-Inhibitoren zu erreichen. Wie oben beschrieben wurde, bieten diese Vorsichtsmaßnahmen höchstens einen teilweisen Schutz. Daher sind bekannte Rückgewinnungsverfahren am wirkungsvollsten, wenn sie angewandt werden, um Urokinase- Verbindungen aus serumfreien Lösungen zu isolieren, und zwar ungeachtet der Tatsache, daß sie ineffizient sind und möglicherweise potentiell toxische Elemente einführen. Außerdem können Reinigungsverfahren unter Anwendung der Immun-Affinitätschromatographie sehr teuer sein, wenn sie hochgefahren werden, um den gewerblichen Bedarf zu decken.
Um gewerbliche Mengen von Urokinase-Verbindungen in einer enzymatisch aktiven Form zu erzeugen, sind daher großtechnische Reinigungsverfahren erforderlich, die die Urokinase effektiv, effizient und sehr schnell aus den Medien rückgewinnen, bevor eine größere Menge abgebaut wird.
Es ist daher eine Aufgabe der Erfindung, ein schnelles, einfaches und großtechnisch sinnvolles Verfahren zur Isolierung einer Urokinase-Verbindung aus einer Urokinase-Verbindung enthaltenden Lösung anzugeben. Eine weitere Aufgabe ist die Bereitstellung eines Verfahrens zum Reinigen von Urokinase- Verbindungen aus Kulturmedien. Eine andere Aufgabe ist die Bereitstellung eines Verfahren zur Rückgewinnung von nichtabgebauten Urokinase-Verbindungen, die im wesentlichen frei von anderen, nichtverwandten Proteinen sind, aus einer Urokinase-Verbindung enthaltenden Lösung. Es ist ferner eine Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zum Trennen von Urokinase-Verbindungen von anderen Proteinen, die in mit Serum angereicherten Medien anwesend sind, anzugeben. Weiter ist es eine Aufgabe, ein Verfahren anzugeben zur Rückgewinnung von nichtabgebauten Urokinase-Verbindungen in Mengen, die für die großtechnische Produktion von sie enthaltenden pharmazeutischen Formulierungen brauchbar sind.

Zusammenfassung der Erfindung

Es wurde nunmehr gefunden, daß ein Chromatographieharz des Typs, wie es zum Reinigen von Immunglobulinen verwendet wird, brauchbar ist bei der Rückgewinnung von Prourokinase und Urokinase aus Prourokinase und Urokinase enthaltenden Lösungen. ("Prourokinase", "Urokinase" und Gemische davon werden nachstehend als "Urokinase-Verbindungen" bezeichnet.) Insbesondere wurde gefunden, daß silikatische Matrizen, die kovalent gebundene Polymere mit einer Vielzahl von anionischen Gruppen enthalten, überraschend Urokinase binden, und zwar bevorzugt gegenüber vielen anderen proteinhaltigen Komponenten in einer Lösung, und eine selektive Elution von Fraktionen, die reich an Urokinase-Verbindungen sind, zulassen. Der Einsatz solcher Matrizen in einfachen diskontinuierlichen oder chromatographischen Verfahren kann die Rückgewinnung von Urokinase-Verbindungen aus Urokinase-Verbindung enthaltenden Lösungen beschleunigen durch Minimierung der Dauer, während der eine Urokinase-Verbindung sich unter abbauenden Bedingungen in Kontakt in solchen Urokinase enthaltenden serumfreien und serumangereicherten flüssigen Kulturmedien, Extrakten von Zellen, die Urokinase synthetisieren und intrazellulär ablagern, und anderen Lösungen, die Albumin, Proteasen, Immunglobuline und diverse andere Proteine enthalten, befindet. Eine rasche Trennung von Urokinase-Verbindungen von diesen anderen Proteinen minimiert die Dauer, während der sich die Urokinase-Verbindungen in Kontakt mit darin befindlichen abbauenden Elementen befinden.
Im weitesten Sinn gibt die Erfindung ein Verfahren zur Rückgewinnung von Urokinase-Verbindungen aus einer Urokinase- Verbindung enthaltenden Proteinlösung an. Dieses Verfahren umfaßt das Kontaktieren der Urokinase-Verbindung enthaltenden Lösung mit einer teilchenförmigen silikatischen Matrix unter Bedingungen, die der Bindung von Urokinase-Verbindungen an die Matrix förderlich sind, wobei die Matrix das kovalent gebundene carboxylierte Reaktionsprodukt aus der teilchenförmigen silikatischen Matrix mit Polyethyleniminopropyltrimethoxysilan aufweist, das Trennen des ungebundenen Proteins von der Matrix, und das Freisetzen der gebundenen Urokinase-Verbindungen daraus. Die Matrix weist ein kovalent gebundenes Polymer mit einer Vielzahl von anionischen Gruppen auf.
Gemäß einem Aspekt gibt die Erfindung ein Verfahren an zur Rückgewinnung von Urokinase-Verbindungen aus Kulturmedien einschließlich solcher Medien, die mit Serum angereichert sind. Serum enthält Immunglobuline, von denen bekannt ist, daß sie sich an Matrizen des bei der Erfindung verwendeten Typs binden, und Serumproteasen, die die Fähigkeit haben, Urokinase-Verbindungen abzubauen. Das bei der Erfindung eingesetzte Matrixmaterial ermöglicht das leichte Trennen von Urokinase-Verbindungen von schädlichen Proteasen, Albumin und anderen Proteinen durch selektive Bindung und Elution, wie nachstehend angegeben ist.
Das Verfahren der Erfindung kann durchgeführt werden durch Leiten einer Urokinase-Verbindung enthaltenden Lösung über die Matrix unter Anwendung einer chromatographischen Technik, d. h. Anordnen der Matrix in einer Säule, die beladen, gewaschen und anschließend geerntet wird. Alternativ kann das Verfahren durchgeführt werden unter Anwendung einer diskontinuierlichen Festphasenextraktionstechnik, wobei das Matrixmaterial und die Urokinase-Verbindung enthaltende Lösung miteinander vermischt werden.
Das Polymer, das an die Festphase der Matrix der Erfindung kovalent gebunden ist, weist beispielsweise ein Polyethylengrundgerüst auf, das anhängende anionische Gruppen wie etwa Carboxylatgruppen enthält. Bei einer bevorzugten Ausführungsform weist das Polymer ein carboxyliertes Polyethyleniminoalkyltrialkoxysilan auf, am meisten bevorzugt carboxyliertes Polyethyleniminopropyltrimethoxysilan. Die Silangruppe ist reaktiv und bindet kovalent an freie Hydroxylgruppen an der Silikamatrix. Bei dieser Ausführungsform ist die Matrix das carboxylierte Reaktionsprodukt von teilchenförmigem porösem Glas oder Silika und dem Polyethyleniminopropyltrimethoxysilan-Polymer mit einem Molekulargewicht von ca. 400 bis ca. 1800 Dalton. Das Glas kann einen mittleren Teilchendurchmesser von ca. 35-180 um und eine mittlere Porengröße von ca. 40-1000 Å haben. Alternativ kann das Silika einen mittleren Teilchendurchmesser von ca. 3-70 um und eine mittlere Porengröße von ca. 50-1000 Å haben.
Bei einem bevorzugten Aspekt der Erfindung enthält das Matrixmaterial ca. 0,3-1,2 mval Carboxy pro Gramm Matrixmaterial.
Bei einer Ausführungsform wird der Kontaktierungsschritt der Erfindung bei einem pH von ca. 4,0-6,0, aber bevorzugt bei ca. 5,6 durchgeführt. Der Freisetzungsschritt kann bei einem pH, der größer als 6,0 ist, und einer Ionenstärke von ca. 250 mmol oder mehr, bevorzugt ca. 500 mmol, durchgeführt werden. Der Freisetzungsschritt kann auch bei einem pH von weniger als ca. 4,0 durchgeführt werden. Sowohl der Kontaktierungs- als auch der Freisetzungsschritt können gemäß einem bevorzugten Aspekt der Erfindung in Gegenwart von &epsi;- Aminocapronsäure (EACA) und einem Detergens durchgeführt werden.
Durch die praktische Anwendung des Verfahrens nach der Erfindung kann häufig 90 % oder mehr der Urokinase in einer Urokinase-Verbindung enthaltenden Lösung, die mit dem Matrixmaterial in Kontakt gebracht worden ist, rückgewonnen werden.

Kurze Beschreibung der Zeichnung

Die vorstehenden und weitere Aufgaben der Erfindung, ihre verschiedenen Merkmale sowie die Erfindung selbst ergeben sich im einzelnen aus der nachstehenden Beschreibung in Verbindung mit den beigefügten Zeichnungen.
Fig. 1 ist ein repräsentatives, mit Coomassie-Brillantblau gefärbtes SDS-Polyacrylamid-Gel der Fraktionen, die durch die Chromatographie von konditioniertem, serumangereichertem Wachstumsmedium auf einer ABx-Säule erhalten wurden. Bahn 1 enthält Standards mit niedrigem Molekulargewicht; Bahn 2 enthält das nichtfiltrierte Ausgangsmaterial; Bahn 3 enthält das filtrierte Ausgangsmaterial, das auf die Säule aufgegeben ist; Bahn 4 enthält Durchfluß; Bahn 5 enthält Waschflüssigkeit Puffer A; Bahn 6 enthält Eluat, das nach Waschen mit 20 % Puffer B in Puffer A erhalten wurde; Bahn 7 enthält Eluatmaterial der Fraktion 1, das nach Entwickeln mit 100 % Puffer B erhalten wurde; Bahn 8 enthält Eluatmaterial der Fraktion 2, das ebenfalls nach Entwickeln mit 100 % Puffer B erhalten wurde; Bahn 9 enthält Eluat der Fraktion 3, das ebenfalls nach Entwickeln mit 100 % Puffer B erhalten wurde; und Bahn 10 enthält Eluat aus dem Waschvorgang mit 100 % Puffer C.
Fig. 2 ist ein repräsentatives, mit Coomassie-Brillantblau gefärbtes SDS-Polyacrylamidgel der Fraktionen, die durch Chromatographie von konditioniertem, serumfreiem Wachstumsmedium auf einer ABx-Säule erhalten wurden. Bahn 1 enthält Standards mit niedrigem Molekulargewicht; Bahn 2 enthält das nichtfiltrierte Ausgangsmaterial; Bahn 3 enthält das filtrierte Ausgangsmaterial, das auf die Säule aufgegeben wird; Bahn 4 enthält Durchfluß; Bahn 5 enthält Waschflüssigkeit Puffer A; Bahn 6 enthält Eluat, das nach Waschen mit 20 % Puffer A in Puffer B erhalten wurde; Bahn 7 enthält Eluatmaterial der Fraktion 1, das nach Entwickeln mit 100 % Puffer B erhalten wurde; Bahn 8 enthält Eluatmaterial der Fraktion 2, das ebenfalls nach Entwickeln mit 100 % Puffer B erhalten wurde; und Bahn 9 enthält Eluat, das nach Entwickeln mit 100 % Puffer C erhalten wurde.

Beschreibung der Erfindung

Es wird ein hochwirksames Verfahren zur Rückgewinnung von nichtabgebauten Urokinase-Verbindungen aus Urokinase-Verbindungen enthaltenden Lösungen angegeben, das einfach, effektiv und kostengünstig ist.
Das Verfahren nutzt Affinitäts-Chromatographie- und Extraktionsverfahren, die sich die unerwartete Entdeckung zunutze machen, daß bekannte Harze des Typs, wie er bisher zum Reinigen und Trennen von Immunglobulinen eingesetzt wurde (siehe US-PS 4 606 825), eingesetzt werden können, um eine Urokinase-Verbindung bevorzugt zu binden und sie differentiell zu eluieren. Kurz gesagt weist das Verfahren folgendes auf: In-Kontakt-Bringen einer Urokinase-Verbindung enthaltenden Lösung mit dem Harz unter Bedingungen, die für die Proteinbindung förderlich sind, Trennen des nichtgebundenen Proteins von dem Harz und Freisetzen von gebundener Urokinase-Verbindung daraus. Das Verfahren kann angewandt werden, um Urokinase aus jeder Lösung rückzugewinnen, die eine Urokinase-Verbindung entweder als solche oder im Gemisch mit anderen Proteinen enthält. Solche Lösungen umfassen beispielsweise Extrakte von Zellen, die Prourokinase zwar exprimieren, jedoch nicht sekretieren, und Kulturmedien, die entweder serumangereichert oder serumfrei sind. Die in den Fig. 1 und 2 gezeigten SDS-Polyacrylamidgele demonstrieren die Fähigkeit des Verfahrens, Urokinase-Verbindung von anderen Proteinbestandteilen des Mediums einschließlich Serumalbumin klar zu trennen und zu reinigen.
Die Art von Trennmaterial, die zur Verwendung bei dem Reinigungsverfahren geeignet ist, weist eine teilchenförmige silikatische Matrix auf, die etwa aus Silikagel oder Glasperlen besteht. Diese Einzelteilchen können jede Größe haben, von der bekannt ist, daß sie bei der Durchführung von Rückgewinnungsverfahren brauchbar ist. Silikateilchen mit einem Durchmesser von ca. 3 bis ca. 70 um und Glasperlen mit einem Durchmesser von ca. 35 bis ca. 180 um werden jedoch bevorzugt. Ein mittlerer Teilchendurchmesser von ca. 40 um ist am brauchbarsten zur Durchführung des Verfahrens nach der Erfindung. Die Teilchen können außerdem porös sein, wobei das Silikagel einen bevorzugten Porendurchmesser von ca. 50-1000 Å hat und die Glasperlen einen bevorzugten Porendurchmesser von ca. 40-1000 Å haben.
An die silikatischen Teilchen sind ein oder mehr Polymere gebunden, die eine Vielzahl von anionischen Gruppen haben. Die bevorzugten Polymere sind mit Carboxylat derivatisierte Polyethylene. Das Polymer ist bevorzugt durch eine Silangruppe an die Matrix gebunden, und daher können carboxylierte Polyethylene mit endständigen reaktiven Silangruppen eingesetzt werden, um die Trennmatrix herzustellen. Das bevorzugte Polymer ist ein carboxyliertes Polyethyleniminoalkylsilan wie etwa ein Polyethyleniminopropyltrimethoxysilan. Das Molekulargewicht des Polymers liegt im allgemeinen zwischen ca. 300 und ca. 2000 Dalton oder höher. Es können zwar viele verschiedene chemische Seitengruppen mit einer negativen Nettoladung brauchbar sein, aber die am meisten bevorzugten anionischen Gruppen sind Carboxylatgruppen. Ein derivatisiertes Matrixmaterial, das ca. 0,3 bis ca. 1,2 Carboxyäquivalente enthält, ist das meistbevorzugte Harz, um das Verfahren der Erfindung wirkungsvoll durchzuführen.
Das derzeit bevorzugte Matrixmaterial, das bei der Erfindung brauchbar ist, wird unter dem Warenzeichen BAKERBOND ABx von J.R. Baker Chemical Co., Phillipsburg, N.J., verkauft. Dieses Material weist ein Silikagel mit einem mittleren Teilchendurchmesser von 40 um auf, das mit einem carboxylierten Polyethylenimin-Polymer derivatisiert ist. Das Herstellungsverfahren dieses bevorzugten Materials und weitere Einzelheiten über seine Struktur sind in der US-PS 4 540 486 angegeben, auf deren Inhalt hier Bezug genommen wird.
Der Kontaktierungsschritt des Verfahren nach der Erfindung kann auf jede Weise durchgeführt werden, die den geladenen Gruppen der derivatisierten Matrix erlaubt, mit der Lösung in Kontakt zu gelangen. Eine bevorzugte Art und Weise der Durchführung des Kontaktierungsschritts ist die Anwendung eines chromatographischen Trennverfahrens wie HPLC oder traditionelle Niederdruckflüssig-Chromatographie, wobei die Urokinase enthaltende Lösung über und durch die Matrix geleitet wird. Dies kann erreicht werden durch Voreinbringen der Matrix in eine chromatographische Säule, die vorher mit einem die Bindung fördernden Puffer (Äquilibrierungspuffer) ins Gleichgewicht gebracht wurde, und Gießen der Urokinase enthaltenden Lösung durch die Säule. Das Matrixmaterial in der Säule kann dann von Fremdstoffen durch Waschen mit zusätzlichem Äquilibrierungspuffer befreit werden.
Ein alternativer Kontaktierungsschritt arbeitet mit einem Festphasen-Extraktionsverfahren, wobei die Urokinase enthaltende Lösung mit der Matrix vermischt wird unter Bildung eines Zweiphasengemischs. Die Flüssig- und die Festphase werden dann getrennnt, und das Matrixmaterial wird in zusätzlichem Äquilibrierungspuffer erneut suspendiert, um von außen daran gebundene Proteine davon zu entfernen.
In beiden Fällen muß der Kontaktierungsschritt unter Bedingungen durchgeführt werden, die die Bindung von Urokinase- Verbindungen in der Lösung an die derivatisierte Matrix ermöglichen. Die Bindung scheint das Ergebnis der Anziehung und Wechselwirkung von entgegengesetzt geladenen Gruppen der Matrix und der Urokinase-Verbindung zu sein. Daher sind für den Erfolg Bedingungen wichtig, die die geladene Beschaffenheit der Urokinase-Verbindung und der Matrix beibehalten. Solche Bedingungen können erhalten werden, indem die Urokinase-Verbindung und die Matrix Lösungen mit geeignetem pH und geeigneter Ionenstärke ausgesetzt werden. Beispielsweise können Wachstumsmedien, die zur Züchtung von Prourokinase erzeugenden Zellen dienen und Urokinase-Verbindungen enthalten (konditioniertes Medium), mit Säure so eingestellt werden, daß der End-pH mit der Urokinase-Bindung kompatibel ist. Außerdem kann das konditionierte Medium filtriert werden, um Zellschutt zu entfernen, und mit einem Detergens, z. B. Tween-80 (Sigma Chemical Co.) angereichert werden, um die Aggregation von Protein zu inhibieren. Bevorzugte Bedingungen für die Bindung umfassen den Einsatz einer Lösung oder eines Äquilibrierungspuffers mit einem PH zwischen ca. 4,0 und ca. 6,0, wobei ein pH von ca. 5,6 am meisten bevorzugt wird.
Die gebundenes Protein enthaltende Matrix wird dann beispielsweise mit einem Äquilibrierungspuffer gewaschen, um Fremdproteine und andere Verunreinigungen zu entfernen.
Der Urokinase-Freisetzungsschritt muß unter spezifischen Bedingungen von Ionenstärke und pH durchgeführt werden, um das effizienteste Entfernen der gebundenen Urokinase von der Matrix zu fördern. Dieser Schritt kann durchgeführt werden, indem die an die Matrix gebundene Urokinase-Verbindung einer Lösung (d. h. einem Eluierungspuffer) ausgesetzt wird, der ihre Freisetzung bewirkt. Beispielsweise kann die Lösung durch eine Säule gegossen werden, die die gebundene Urokinase und Matrixmaterial enthält, oder kann verwendet werden, um Matrixmaterialmasse erneut zu suspendieren. Beispielhafte Lösungen sind ein Eluierungspuffer mit einem pH, der größer als ca. 6,0 ist, und einer Ionenstärke, die größer als ca. 250 mmol ist, wobei eine Ionenstärke von 500 mmol bevorzugt wird. Alternativ kann eine Urokinase- Verbindung unter Einsatz eines Puffers eluiert werden, der einen pH von weniger als ca. 4,0 hat. Es können auch mehr als ein Eluierungspuffer mit zunehmender Ionenstärke während des Freisetzungsschritts der Erfindung nacheinander eingesetzt werden.
Bedingungen, die den Erfolg des Kontaktierungs- und des Freisetzungsschritts verstärken, können vorgesehen werden, beispielsweise die Zugabe von &epsi;-Aminocapronsäure (EACA), die als ein Protease-Inhibitor wirkt, und eines Detergens wie Tween-80 (Sigma Chemical Co.) sowohl zu der Urokinase-Verbindung enthaltenden Lösung und als auch dem Eluierungsmittel.
Die Menge von Urokinase-Verbindungen, die aus einer Lösung gemäß dem Verfahren nach der Erfindung rückgewonnen wird, kann mit jeder von bekannten Assaymethoden bestimmt werden, beispielsweise durch Immunoassay oder Aktivitäts-Assays.
Zur Messung der Aktivität muß inaktive Prourokinase zuerst in enzymatisch aktive Urokinase umgewandelt werden. Das kann durch eine Protease wie beispielsweise Plasmin erreicht werden. Die Wirkung der Protease muß dann durch einen Inhibitor, beispielsweise Aprotinin, angehalten werden. Das verbleibende Protein ist Urokinase, dessen enzymatische Aktivität dann spektralphotometrisch unter Verwendung eines chromogenen Substrats wie beispielsweise S-2444 gemessen werden kann.
Im allgemeinen kann das Verfahren nach der Erfindung mehr als 90 % der Urokinase-Aktivität im Rohextrakt rückgewinnen und resultiert in Lösungen mit sehr hoher enzymatischer Aktivität.
Die folgenden Beispiele sollen den Gegenstand der Erfindung verdeutlichen, jedoch nicht einschränken.

BEISPIEL 1

Bei diesem Beispiel wird Prourokinase aus einem typischen Wachstumsmedium extrahiert, das 1 % fetales Rinderserum (FRS) und 10 KI-Einheiten/ml Aprotinin enthält.

A. Vorbehandlung:

Umkapselte, gentechnisch veränderte Zellen, die Human-Prourokinase erzeugen, werden in einem Wachstumsmedium gezüchtet, das nachstehend als "konditioniertes" (z. B. Urokinase-Verbindung enthaltendes) Medium bezeichnet wird. Das konditionierte isotonische Medium wird mit EDTA auf mmol und Tween 80 auf 0,01 % aufbereitet. Das Medium wird dann auf pH 5,6 mit 6 N HCl titriert und filtriert, um Zellschutt zu entfernen.

B. Chromatographie:

7 l des vorbehandelten konditionierten Mediums werden bei Raumtemperatur auf eine Pharmacia-K-Säule (Volumen = 41 ml) aufgegeben, die Abx (J.T. Baker Chemical Co., Phillipsburg, NH; Teilchendurchmesser 40 um) enthält und mit 105 cm/h durchgeleitet. Die Säule wird mit 10 Säulenvolumina Äquilibrierungspuffer A (10 mmol Morpholinoethansulfonat (MES), 5 mmol EDTA und 0,01 % Tween 80, pH 5,6) und dann 10 Säulenvolumina 20 % Eluierungspuffer B (500 mmol NaOAc, 5 mmol EDTA, 0,01 % Tween 80, pH 7,0) / 80 % Puffer A gewaschen. Das Protein auf der Säule wird mit 8 Säulenvolumina von 100 % Puffer B eluiert. Die Säule wird dann mit 10 Säulenvolumina von Puffer C (1 M NaOAc, 5 mmol EDTA, 0,01 % Tween 80, pH 7,0) gewaschen. Das Säuleneluat wird mittels UV-Absorption bei 280 nm überwacht.

C. Elektrophorese:

Das konditionierte Medium und das Säuleneluat werden in verschiedenen Schritten während des Reinigungsvorgangs analysiert mittels Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel- Elektrophorese (SDS-PAGE) entsprechend dem Vorgehen von Laemmli (Nature (1970) 227:680-685). Das Gel mit dem Gradienten von 7,5 %-20,0 % wird mit 0,25 % Coomassie-Brillantblau, 50 % Methanol, 10 % Essigsäure gefärbt, mit 50 % Methanol, 10 % Essigsäure entfärbt und photographiert.
Der größte Teil der aus der Säule eluierten Prourokinase findet sich in den Säulenfraktionen, die Peak-2-Material in 100 % Eluierungspuffer B enthalten, wie Fig. 1 zeigt. Fig. 1 demonstriert außerdem, daß die Prourokinase von anderen Proteinen in dem Kulturmedium sauber getrennt und gereinigt wurde.

D. Aktivitäts-Assay:

Das Medium und jede der mittels SDS-PAGE analysierten Säulenfraktionen werden auf Urokinase-Aktivität durch den direkten Urokinase-Assay (UK-Assay) wie folgt analysiert. Prourokinase hat keine enzymatische Aktivität und muß daher in Urokinase (aktive) durch die Wirkung von Plasmin umgewandelt werden.
10 ml Assaypuffer (50 mmol Tris-HCl, pH 7,5, 12 mmol NaCl, 0,1 % Triton X-100) werden in die erste Vertiefung einer Mikrotiterplatte (Costar #2797) als Blindreagens eingebracht. Eine Urokinase-Standardvorratslösung (3000 IE/ml Assaypuffer Calbiochem #672081) wird in Assaypuffer weiter auf 100, 50, 25, 12,5 und 6,25 IE/ml verdünnt.
Die verdünnten Urokinase-Standards oder unbekannten Proben werden in die Vertiefungen dreifach eingebracht. 2 ml Plasmin (12,5 Casein-Einheiten/ml H&sub2;O Helena #5303) wird dann geeigneten Vertiefungen zugegeben. Alle Proben werden in Gegenwart und in Abwesenheit von Plasmin analysiert. Die Proben werden für 1 h bei 37 ºC inkubiert. Der positiven Plasmin-Platte wird 10 ml/Vertiefung Aprotinin (2000 KIE/ml Assaypuffer, Sigma #All53) zugesetzt; der negativen Plasmin- Platte wird 10 ml Assaypuffer zugesetzt. Die Platten werden für 15 min bei 37 0C inkubiert.
90 ml eines 1 mmol S-2444 (Helena #5281) in Assaypufferlösung wird jeder Vertiefung zugefügt, und die Platte wird für 2-3 h bei 37 ºC inkubiert. Die optische Dichte bei 405 nm wird in einem Plattenleser gemessen.
Die Konzentration von Prourokinase in den unbekannten Proben wird aus einem Diagramm von Enzymeinheiten pro Vertiefung gegen OD&sub4;&sub0;&sub5; bestimmt. Die Aktivität der in Gegenwart von Plasmin analysierten Proben umf aßt die Summe der Aktivitäten der anwesenden Prourokinase und Urokinase. Die Menge von Prourokinase in einer gegebenen Probe ist die Differenz zwischen den Werten, die in Gegenwart und in Abwesenheit von Plasmin erhalten werden. Die Ergebnisse sind nachstehend in der Tabelle 1 gezeigt. TABELLE 1 Urokinase-Aktivitätsassay FRAKTION VOLUMEN % VON GESAMTMENGE unfiltriertes Ausgangsmaterial filtriertes Ausgangsmaterial Durchfluß Waschflüssigk. Fraktion 91,4 % Aktivitätsrückgewinnung aus der Säule

BEISPIEL 2

A. Vorbehandlung:

Bei diesem Beispiel wird Prourokinase aus einem typischen serumfreien Wachstumsmedium extrahiert, das 10 KI-Einheiten/ ml Aprotinin enthält, und wird wie in Beispiel 1 vorbehandelt und filtriert.

B. Chromatographie:

6 l des vorbehandelten konditionierten isotonischen Mediums werden bei Raumtemperatur auf eine Pharmacia-K-Säule (5 × 2,5 cm) aufgegeben, die ABx (J.T.Baker Chemical Co.; Teilchendurchmesser 40 um) enthält, und die Säule wird mit 107 cm/h betrieben Nach dem Beschicken wird die Säule mit 20 Säulenvolumina Puffer A sowie 10 Säulenvolumina 20 % Puffer B / 80 % Puffer A gewaschen. Das Protein an der Säule wird mit 6 Säulenvolumina 100 % Puffer B eluiert (siehe Beispiel 1). Die Säule wird dann mit 10 Säulenvolumina 100 % Puffer C gewaschen.
Das Säuleneluat wird mittels UV-Absorption wie in Beispiel 1 beschrieben überwacht. Zwei Peak-Fraktionen werden nach Entwicklung mit 100 % Puffer B erhalten.

C. Elektrophorese:

Das Medium und die Säuleneluate werden während des Verfahrens mittels SDS-PAGE allgemein wie in Beispiel 1 beschrieben analysiert. Der größte Teil der Urokinase wird aus der Säule mit 100 % Puffer B eluiert, wie Fig. 2 zeigt.

D. Aktivitäts-Assay:

Die enzymatische Aktivität der in dem Medium und dem Säuleneluat bei jedem Schritt während des Verfahrens gefundenen Urokinase wird mittels direktem UK-Assay wie oben in Beispiel 1 beschrieben analysiert.
Die Ergebnisse sind nachstehend in der Tabelle 2 aufgeführt. TABELLE 2 Urokinase-Aktivitätsassay FRAKTION VOLUMEN % VON GESAMTMENGE unfiltriertes Ausgangsmaterial filtriertes Ausgangsmaterial Durchfluß Waschflüssigk.0 Fraktion 91,1 % Aktivitätsrückgewinnung aus der Säule

BEISPIEL 3

A. Vorbehandlung:

Bei diesem Beispiel wird Prourokinase aus einem typischen serumfreien Wachstumsmedium extrahiert, das 10 KI-Einheiten/ ml Aprotinin enthält, und wird wie in Beispiel 1 beschrieben vorbehandelt und filtriert.

B. Chromatographie:

8 l des vorbehandelten konditionierten Mediums werden bei Raumtemperatur auf eine Pharmacia-K-Säule (5 × 2,0 cm) aufgegeben, die ABx (J.T. Baker Chemical Co.; Teilchendurchmesser 40 um) enthält, und die Säule wird mit 105 cm/h betrieben. Nach dem Beschicken wird die Säule mit 10 Säulenvolumina Puffer A und 10 Säulenvolumina von 20 % Puffer B / 80 % Puffer A gewaschen. Das Protein an der Säule wird mit 8 Säulenvolumina von 100 % Puffer B eluiert (siehe Beispiel 1). Die Säule wird dann mit 10 Säulenvolumina von 100 % Puffer C gewaschen. Das Säuleneluat wird mittels UV-Absorption wie in Beispiel 1 beschrieben überwacht. Zwei Peak-Fraktionen werden nach Entwicklung mit 100 % Puffer B erhalten.

C. Elektrophorese:

Das Medium und die Säuleneluate werden während des Verfahrens mittels SDS-PAGE allgemein wie in Beispiel 1 beschrieben analysiert. Der größte Teil der Prourokinase wird aus der Säule mit 100 % Puffer B eluiert (Fraktion 2).

D. Aktivitäts-Assay:

Die enzymatische Aktivität der Urokinase, die in dem Medium und dem Säuleneluat bei jedem Schritt während des Verfahrens gefunden wird, wird mittels direktem UK-Assay wie oben in Beispiel 1 beschrieben analysiert. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 3 aufgeführt. TABELLE 3 Urokinase-Aktivitätsassay FRAKTION VOLUMEN % VON GESAMTMENGE unfiltriertes Ausgangsmaterial filtriertes Durchfluß Waschflüssigk. Fraktion 99,5 % Aktivitätsrückgewinnung aus der Säule.
Wie aus den obigen Beispielen ersichtlich ist, kann der größte Teil bzw. nahezu die gesamte Urokinase-bezogene enzymatische Aktivität sowohl aus serumfreiem als auch Serumangereichertem Medium mit dem Verfahren nach der Erfindung rückgewonnen werden.

Claims

1. Verfahren zur Extraktion einer Urokinase-Verbindung aus einer Lösung bestehend aus Urokinase-Verbindungen und anderen Proteinen, das folgende Schritte beinhaltet:

(a) Kontaktieren einer Urokinase-Verbindung enthaltenden Proteinlösung mit einer teilchenförmigen, silikatischen Matrix unter Bedingungen, bei denen eine in der Lösung enthaltene Urokinase-Verbindung an die Matrix bindet, wobei die Matrix das kovalent gebundene, karboxylierte Reaktionsprodukt aus der teilchenförmigen, silikatischen Matrix mit Polyethyleniminopropyl-trimethoxy-silan aufweist;

(b) Trennen des ungebundenen Proteins von der Matrix; und

(c) Freisetzen einer Urokinase-Verbindung von der Matrix.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Lösung ein Kulturmedium enthält.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Lösung einen Zellextrakt enthält.

4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Kontaktierungsschritt das Überleiten der Urokinase-Verbindung enthaltenden Lösung über die Matrix beinhaltet, unter Anwendung einer chromatographischen Trenntechnik.

5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei im Kontaktierungsschritt die die Matrix und die Urokinase-Verbindung enthaltende Lösung unter Ausbildung eines Zweiphasengemischs vermischt werden, wobei eine Festphasenextraktionstechnik angewendet wird.

6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die silikatische Matrix Teilchen aufweist, die ausgewählt sind aus der Gruppe von Silika-Gel und porösen Glasperlen.

7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Matrix-Material etwa 0,3 bis etwa 1,2 Carboxyl-Milliequivalente pro Gramm Matrix-Material beinhaltet.

8. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Kontaktierungsschritt bei einem pH zwischen etwa 4,0 und etwa 6,0, z. B. bei einem pH von etwa 5,6, durchgeführt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Freisetzungsschritt bei einem pH, der größer ist als etwa 6,0, und einer Ionenstärke, die größer ist als etwa 250 millimolar, z.B. bei einer lonenstärke von etwa 500 millimolar, durchgeführt wird.

10. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Freisetzungsschritt bei einem pH von weniger als etwa 4,0 durchgeführt wird.

11. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Kontaktierungsund Freisetzungsschritt in Gegenwart von Epsilon-Aminocapronsäure und einem Detergens durchgeführt werden.

12. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Freisetzungsschritt eine Fraktion ergibt, in der eine Urokinase-Verbindung vorliegt, die mindestens 90% der Urokinase- Verbindungen in der Urokinase-Verbindung enthaltenden Lösung ausmacht, welche die Matrix kontaktiert hat.