DE3783693T2

DE3783693T2 - Verfahren zur reinigung des gewebeplasminogenaktivators.

Info

Publication number: DE3783693T2
Application number: DE8787308391T
Authority: DE
Inventors: Nobuhiro Kawashima; Kunizou Mitsui Toatsu Iij Mori; Mitsuyoshi Morii; Noriko Mitsui Toatsu Apa Morii; Masaharu Ohoka; Katsuyuki Suzuki; Toshihiko Suzuki
Original assignee: Mitsui Toatsu Chemicals Inc
Current assignee: Mitsui Toatsu Chemicals Inc
Priority date: 1986-09-22
Filing date: 1987-09-22
Publication date: 1993-05-13
Anticipated expiration: 2007-09-23
Also published as: EP0261941B1; NO873943L; NO873943D0; DK497487D0; EP0261941A2; AU586355B2; JPS6379591A; FI874116A0; CA1302929C; EP0261941A3; US4985362A; AU7865287A; DE3783693D1; ZA877088B; FI874116A; DK497487A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung von Gewebe-Plasminogen-Aktivator (tPA).
Insbesondere betrifft sie ein Verfahren zur Reinigung von tPA, das die Schritte umfaßt, eine rohe tPA-Präparation, enthaltend verschiedene tPA-Spezies unterschiedlichen Molekulargewichts, im Voraus mit einem Kationenaustauscher in Berührung zu bringen und das tPA mit einem Molekulargewicht von etwa 70 000 Dalton mittels des Salzgradienten-Elutionsverfahrens selektiv von dem Kationenaustauscher abzutrennen.
Bisher waren keine praktischen Verfahren zur Reinigung von tPA eines gewünschten Molekulargewichts aus einem Kulturmedium mit kultivierten tPA-produzierenden Zellen bekannt. Deshalb enthielt das Kulturmedium eine rohe tPA-Präparation mit verschiedenen tPA-Spezies unterschiedlichen Molekulargewichts.
Zum Trennen von Proteinen unterschiedlicher Molekulargewichte war es bekannt, daß Gelfiltrations-Verfahren allgemein anwendbar sind und daß Kationenaustauscher für die Reinigung von tPA verwendet werden (Japanische Offenlegungsschrift 174 727/1985). Jedoch waren überhaupt keine Reinigungsverfahren bekannt, die eine tPA-Spezies eines gewünschten Molekulargewichts durch Entfernen anderer tPA-Spezies als der mit dem speziellen Molekulargewicht, z.B. von etwa 70 000 Dalton wie in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung, zu reinigen und aufzubereiten.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, tPA mit einem Molekulargewicht von etwa 70 000 Dalton selektiv aus Proteinen, die mit einem Anti-menschliches tPA-Antikörper reagieren und ein anderes Molekulargewicht haben, herzustellen.
Wenn tPA-produzierende Zellen kultiviert werden, um tPA zu erhalten, enthält die resultierende Kulturlösung verschiedene tPA-Spezies als Proteine, die mit einem Anti-menschliches tPA-Antikörper reagieren, nämlich tPA-Spezies mit einem Molekulargewicht von 30 000 bis 45 000 Dalton, tPA-Spezies mit einem Molekulargewicht von 50 000 bis 80 000 Dalton und solche mit einem Molekulargewicht von 100 000 Dalton und mehr. Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Isolierung und Reinigung von tPA mit einem Molekulargewicht von etwa 70 000 Dalton aus einer solchen Lösung bereit, die verschiedene tPA-Spezies unterschiedlichen Molekulargewichts und andere proteinöse Verunreinigungen enthält.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben die Reaktion zwischen tPA-Spezies unterschiedlichen Molekulargewichts und einem Kationenaustauscher in dem Bemühen, das oben geschilderte Problem zu lösen, untersucht. Als Ergebnis wurde gefunden, daß die tPA-Spezies unterschiedlichen Molekulargewichts im einzelnen unterschiedliche Bindungsstärken an den Kationenaustauscher aufweisen. Das Ausnutzen dieser Eigenschaften führte zur Fertigstellung eines Verfahrens zur Herstellung von tPA mit einem Molekulargewicht von etwa 70 000 Dalton aus verschiedenen tPA-Spezies unterschiedlichen Molekulargewichts.
Insbesondere ist die Aufgabe der Erfindung durch ein Reinigungsverfahren für tPA gelöst worden, das die Schritte umfaßt, (a) eine rohe tPA-Präparation, enthaltend Proteine, die mit einem Anti-menschliches tPA-Antikörper reagieren und ein anderes Molekulargewicht als etwa 70 000 Dalton haben, als Verunreinigungen, im Voraus in engsten Kontakt mit einem Kationenaustauscher zu bringen und (b) tPA mit einem Molekulargewicht von etwa 70 000 Dalton mittels eines Salzgradienten-Elutionsverfahrens selektiv von dem Kationenaustauscher abzutrennen.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Reinigung von tPA bereitgestellt, das die Schritte umfaßt:
(a) ein Carboxymethyl-Agarose-Austauscherharz mit einer rohen tPA-Präparation, enthaltend tPA mit einem Molekulargewicht von etwa 70 000 Dalton sowie unreine tPA-Spezies einschließlich aktiver abgebauter tPA-Produkte, tPA-Polymere und Komplexe von tPA mit anderen Proteinen, in Kontakt zu bringen, wobei die unreinen tPA-Spezies andere Molekulargewichte als etwa 70 000 Dalton haben und mit einem Anti-menschliches tPA-Antikörper reagieren können;
(b) das Austauscherharz mit einem Elutionsmittel mit einer Salzkonzentration von weniger als 0,15 M und einem pH im Bereich von 6,0 - 6,4 zur Elution der unreinen tPA-Spezies mit Molekulargewichten von weniger als etwa 70 000 Dalton zu behandeln; und dann
(c) das Austauscherharz mit einem Elutionsmittel mit einer Salzkonzentration im Bereich von 0,175 - 0,375 M und einem pH im Bereich von 6,0 - 6,4 zur Elution des tPA mit einem Molekulargewicht von etwa 70 000 Dalton zu behandeln und das resultierende Eluat aufzubereiten.
Gemäß einem anderen Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Reinigung von tPA bereitgestellt, das die Schritte umfaßt:
(a) ein Carboxymethyl-Acrylamid-Copolymer-Austauscherharz mit einer rohen tPA-Präparation, enthaltend tPA mit einem Molekulargewicht von etwa 70 000 Dalton sowie unreinen tPA-Spezies einschließlich aktiver abgebauter tPA-Produkte, tPA-Polymere und Komplexe von tPA mit anderen Proteinen, in Kontakt zu bringen, wobei die unreinen tPA-Spezies andere Molekulargewichte als etwa 70 000 Dalton haben und mit einem Anti-menschliches tPA-Antikörper reagieren können;
(b) das Austauscherharz mit einem Elutionsmittel mit einer Salzkonzentration von mindestens 0,075 M und einem pH im Bereich von 6,0 - 6,4 zur Elution der unreinen tPA-Spezies mit Molekulargewichten von weniger als 70 000 Dalton zu behandeln; und dann
(c) das Austauscherharz mit einem Elutionsmittel mit einer Salzkonzentration von 150 mM - 200 mM und einem pH im Bereich von 6,0 - 6,4 zur Elution der tPA-Spezies mit einem Molekulargewicht von etwa 70 000 Dalton zu behandeln und das resultierende Eluat aufzubereiten.
Die folgende nur als Beispiel gegebene Beschreibung erklärt die bevorzugte Art, die vorliegende Erfindung auszuführen, genauer.
In dem Verfahre der vorliegenden Erfindung ist der Gewebe-Plasminogen-Aktivator ein Produkt in dem Gewebe eines höheren Tieres, und er ist ein Protein, das Plasminogen, einen Vorläufer des Plasmin, eines für Fibrin spezifischen proteolytischen Enzyms, aktiviert.
Wenn tPA-produzierende Zellen zur Gewinnung von tPA kultiviert werden, enthält das Kulturmedium als Proteine, die mit einem Anti-menschliches tPA-Antikörper reagieren, verschiedene tPA-Spezies unterschiedlichen Molekulargewichts, wie solche mit einem Molekulargewicht von 30 000 bis 45 000 Dalton, solche mit einem Molekulargewicht von 50 000 bis 80 000 Dalton und solche mit einem Molekulargewicht von 100 000 Dalton und mehr. Diese tPA-Spezies umfassen tPA, aktive degradierte tPA-Produkte, tPA-Polymere, Komplexe von tPA mit anderen Proteinen und dergleichen.
Das das gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung zu reinigende tPA enthaltende Kulturmedium kann ein Kulturmedium menschlicher Melanomzellen, ein Kulturmedium normaler menschlicher Zellen und das Kulturmedium von Zellen umfassen, die das menschliche tPA-Gen gemäß der rekombinanten DNA-Technik integriert enthalten. Kulturmedien, die durch partielles Reinigen der vorgenannten Medien erhalten werden, können ebenfalls verwendet werden.
Der für die Praxis des Verfahrens der vorliegenden Erfindung zu verwendende Kationenaustauscher enthält Carboxymethyl-Gruppen, während der Träger Agarose, Polyacrylamid-Körnchen oder eine Kombination beider umfassen kann.
Bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung wird zunächst eine Lösung, die verschiedene tPA-Spezies unterschiedlichen Molekulargewichts und andere proteinöse Verunreinigungen enthält, auf einen schwach sauren pH eingestellt, um diesen in der Lösung enthaltenen Substanzen die Adsorption an den Kationenaustauscher zu ermöglichen.
Der mit der Lösung in Berührung gebrachte Kationenaustauscher adsorbiert praktisch alle tPA-Spezies unterschiedlichen Molekulargewichts.
Nach dem erforderlichen Waschen des Kationenaustauschers läßt man tPA mit dem Molekulargewicht von etwa 70 000 Dalton selektiv bei einem pH in einem spezifischen pH-Bereich mittels des sogenannten Salzgradienten-Elutions-Verfahren eluieren. Dabei wird die Elution durch Veränderung der Salzkonzentration des Elutionsmittels mit einem pH im Bereich von 6,0 - 6,4 bewirkt, so daß das gewünschte tPA abgetrennt und gereinigt werden kann.
Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Natriumphosphat und Kaliumphosphat werden allgemein in den meisten Fällen verwendet. Das zu verwendende Salz ist jedoch nicht speziell auf diese Substanzen beschränkt. Was darüber hinaus die Salzkonzentration betrifft, sollte ein Konzentrationsbereich, bei dem tPA eluiert werden kann, verwendet werden, und zwar in Übereinstimmung mit der Art der funktionellen Gruppe des zu verwendenden Kationenaustauschers und der Art des Harzes.
Außerdem kann das anwendbare Salzgradienten-Elutions-Verfahren beispielsweise den linearen Gradienten oder das schrittweise Verfahren umfassen.
Die Erfindung wird nun in den folgenden, nicht einschränkenden Beispielen genauer beschrieben.

Beispiel 1:

Nach dem Kultivieren von Bowes Melanomzellen (ATCC CRL 1424 G361) in RPMI- 1640 Kulturmedium, ergänzt mit 10% hitzeinaktiviertem (56ºC, 30 Minuten) fötalem Kälberserum, wurden die kultivierten Zellen einmal gewaschen. Die gewaschenen Zellen wurden dann 24 Stunden in serum-freiem Medium kultiviert, und der resultierende Überstand wurde gesammelt.
Zu 2 1 des Kulturüberstands wurde Phosphorsäure gegeben. Der gesammelte Überstand wurde auf einen pH von 5,0 eingestellt, indem Phosphorsäure zu 2 1 des Überstands gegeben wurde. Dann ließ man den so behandelten Überstand über eine Säule laufen, die 10 ml CM-Sepharose (Pharmacia AB), äquilibriert mit einer 0,05 M Natrium-dihydrogenphosphat-Lösung (pH 5,0), die 0,15 M an Natriumchlorid war, enthielt.
Der Säulen-Ausfluß wurde gesammelt, und seine plasminogen-abhängige fibrinolytische Aktivität wurde gemessen. Es wurde jedoch keine Aktivität gefunden.
Nachdem der gesamte Kulturüberstand über die Säule gegeben worden war, wurde die Säule mit einem 25 mM Phosphat-Puffer (pH 6,4), der 0,1 M an Natriumchlorid war, gewaschen.
Etwa 5% der auf die Säule aufgetragenen Aktivität wurde in der resultierenden Lösung detektiert. Diese Lösung wurde einer Elektrophorese in einem SDS-Polyacrylamidgel unterworfen und dann mittels Zymographie analysiert. Eine einem Molekulargewicht von etwa 30 000 Dalton entsprechende Bande wurde auf dem Zymographen beobachtet.
Die adsorbierten Proteine wurden mit einem 25 mM Phosphat-Puffer (pH 6,0) eluiert, indem seine Natriumchlorid-Konzentration mittels linearem Gradienten-Verfahren von 0,1 M bis 0,6 M verändert wurde.
Das so erhaltene Eluat zeigte auf dem Zymographen im Bereich von 0,2 - 0,35 M in Natriumchlorid-Konzentration eine einzelne Bande entsprechend einem Molekulargewicht von etwa 70 000 Dalton. Etwa 70% der auf die Säule aufgetragenen Aktivität wurde als Aktivität dieser Fraktion wiedergewonnen.

Beispiel 2:

2 1 eines Kulturüberstands, hergestellt aus einer Kultur von Chinese hamster ovary (Eierstock-) (CHO)-Zellen mit einem integrierten Gen für menschliches tPA (Dr. Chasin, Department of Biological Science, Columbia University) in einem Medium, das 10% hitzeinaktiviertes (56ºC, 30 Minuten) fötales Kälberserum und 40 KIU/ml Aprotinin enthielt, wurden über eine Säule gegeben, die 50 ml eines Anti-menschliches tPA-Antikörpers enthielt. Die Säule wurde mit einem 0,05 M Phosphat-Puffer (pH 7,5), der 1,0 M an Natriumchlorid war, gewaschen, und dann wurden die adsorbierten Proteine mit einem 0,1 M Glycin-HCl- Puffer (pH 3,5), der 2,0 M an Ammoniumthiocyanat war, eluiert.
Das Eluat wurde gesammelt und seine plasminogen-abhängige fibrinolytische Aktivität gemessen. Man fand, daß sie etwa 95% der auf die Säule aufgetragenen Aktivität war.
Diese eluierte Fraktion wurde mittels Zymograph analysiert, nachdem sie einer SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese unterworfen worden war. Banden im Bereich entsprechend einem Molekulagewicht von 30 000 bis 150 000 wurden auf dem Zymographen beobachtet.
Zu dieser Lösung wurden 300 g/l Ammoniumsulfat gegeben. Der pH wurde auf 7,0 eingestellt, die Lösung ließ man über Nacht bei 4ºC stehen.
Das resultierende Präzipitat wurde mittels Zentrifugation gesammelt und gegen einen 0,05 M Phosphat-Puffer (pH 6,0) dialysiert. Diese dialysierte Lösung wurde über eine Säule gegeben, die CM-Trisacryl M (LKB Co) enthielt, das äquilibriert worden war mit einem 0,05 M Phosphat-Puffer (pH 6,0). Die Säule wurde mit dem Puffer, der auch zum Äquilibrieren verwendet wurde, gewaschen, und die plasminogen-abhängige fibrinolytische Aktivität des Ausflusses wurde gemessen.
Etwa 5% der auf die Säule aufgetragenen Aktivität wurde wiedergefunden. Banden entsprechend einem Molekulargewicht im Bereich von 30 000 - 60 000 Dalton wurden auf dem Zymographen beobachtet.
Die adsorbierten Proteine wurden mit einem 0,05 M Phosphat-Puffer (pH 6,0), der 0,15 M an Natriumchlorid war, eluiert. Das Eluat zeigte eine Aktivität, die etwa 85% der auf die Säule aufgetragenen Aktivität entsprach. Auf dem Zymographen wurde eine Bande entsprechend einem Molekulargewicht von etwa 70 000 Dalton erkannt.

Beispiel 3:

2 1 eines Kulturüberstands, hergestellt aus einer Kultur von Maus-Fibroblasten-Zellen (Maus C1271 ATCC CRL 1616), transformiert mit dem Gen für menschliches tPA, in einem Kultur-Medium, das 2% hitzeinaktiviertes (56ºC, 30 Minuten) fötales Kälberserum und 40 KIU/ml Aprotinin enthielt, wurden mit Phosphorsäure auf einen pH von 4,5 eingestellt und dann über eine Säule gegeben, die 10 ml Carboxymethyl (CM) Sepharose (Pharmacia AB), äquilibriert mit einer 0,05 M Natriumdihydrogenphosphat-Lösung (pH 4,5), die 0,15 M an Natriumchlorid war, enthielt.
Das Harz, das die adsorbierten Proteine enthielt, wurde mit einem 25 mM Phosphat-Puffer (pH 6,4), der 50 mM an Natriumchlorid war, gewaschen, und dann wurden die Proteine mit einem 50 mM Phosphat-Puffer (pH 6,4), der 0,5 M an Natriumchlorid war, eluiert.
Die plasminogen-abhängige fibrinolytische Aktivität des Eluats wurde gemessen. Man fand, daß sie etwa 90% der auf die Säule aufgetragenen Aktivität war. Diese eluierte Fraktion wurde einer SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese unterworfen und dann mittels Zymographen analysiert. Banden im Bereich entsprechend einem Molekulagewicht von 30 000 bis 150 000 wurden als tPA-Banden auf dem Zymographen beobachtet.
Diese Fraktion wurde mit einem 25 mM Phosphat-Puffer (pH 6,0) zehnfach verdünnt und auf einen pH von 6,0 eingestellt. Die resultierende Lösung ließ man über eine Säule laufen, die CM Trisacryl M, äquilibriert mit einem 25 mM Phosphat-Puffer (pH 6,0), der 0,05 M an Natriumchlorid war, enthielt. Die Säule wurde mit dem Puffer, der auch zum Äquilibrieren verwendet wurde, gewaschen, und die Plasminogen-abhängige fibrinolytische Aktivität des Ausflusses wurde gemessen. Etwa 5% der auf die Säule aufgetragenen Aktivität wurde wiedergefunden. Banden entsprechend einem Molekulargewicht im Bereich von 30 000 - 60 000 Dalton wurden auf dem Zymographen beobachtet.
Die adsorbierten Proteine wurden mit einem 0,05 M Phosphat-Puffer (pH 6,4), der 0,1 M an Natriumchlorid war, eluiert. Die Aktivität des Eluats war etwa 85% der auf die Säule aufgetragenen Aktivität. In dieser Fraktion enthaltenes tPA wurde auf dem Zymographen als eine Bande entsprechend einem Molekulargewicht von etwa 70 000 Dalton bestätigt.

Beispiel 4:

Zu 2 1 eines Kulturüberstands, hergestellt aus einer Kultur von menschlichen fötalen Amnionzellen (FL ATCC CCL-62), die das menschliche tPA-Gen zusammen mit menschlichem Cytomegalo-Virus (HCMV) als Promotor zur Expression des menschlichen tPA tragen, in einem Kultur-Medium, das 2% hitzeinaktiviertes (56ºC, 30 Minuten) fötales Kälberserum und 20 KIU/ml Aprotinin enthielt, wurden 300 g/l Ammoniumsulfat gegeben. Die resultierende Lösung wurde auf einen pH von 7,0 eingestellt, und dann ließ man sie über Nacht bei 4ºC stehen.
Das so gebildete Präzipitat wurde mittels Zentrifugation gesammelt und in einem 0,04 M Phosphat-Puffer (pH 7,5) gelöst. Dann folgte zur Entsalzung eine Dialyse gegen diesen Puffer. Diese Lösung wurde über eine Säule gegeben, die 10 ml Hydroxyapatit, äquilibriert mit einem 0,04 M Phosphat-Puffer (pH 7,5), enthielt. Nachdem die gesamte Lösung durch die Säule gelaufen war, wurde sie mit dem Puffer gewaschen, der zum Äquilibrieren verwendet worden war.
Die Messung der plasminogen-abhängigen fibrinolytischen Aktivität des Ausflusses ergab, daß sie etwa 5% der auf die Säule aufgetragenen Aktivität war. Diese Fraktion wurde einer SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese unterworfen und mittels Zymographen analysiert. Dieser Ausfluß zeigte Banden im Bereich entsprechend einem Molekulagewicht von etwa 30 000 bis 60 000 Dalton auf dem Zymographen.
Die adsorbierten Proteine wurden mit einem 0,3 M Phosphat-Puffer (pH 6,0) eluiert. Das Eluat zeigte eine Aktivität von etwa 85% der auf die Säule aufgetragenen Aktivität. Banden entsprechend einem Molekulargewicht von etwa 70 000 Dalton und 100 000 Dalton oder mehr wurden auf dem Zymographen beobachtet.
Diese Fraktion wurde mit Wasser sechsfach verdünnt und mit Phosphorsäure auf einen pH von 5,5 eingestellt. Die resultierende Lösung wurde auf eine CM-Sepharose-Säule aufgetragen, die mit einem 0,05 M Phosphat-Puffer (pH 5,5) äquilibriert worden war.
Nachdem die gesamte Lösung über die Säule gelaufen war, wurden die adsorbierten Proteine mit einem 25 mM Phosphat-Puffer (pH 6,4), der 0,15 M an Natriumchlorid war, eluiert.
Die wiedergewonnene Aktivität des Eluats war etwa 80% der auf die Säule aufgetragenen Aktivität. Eine Bande entsprechend einem Molekulargewicht von etwa 70 000 Dalton wurde auf dem Zymographen erkannt.
Die verbliebenen adsorbierten Proteine wurden mit einem 25 mM Phosphat-Puffer (pH 6,4), der 0,5 M an Natriumchlorid war, eluiert. Das Eluat zeigte eine tPA-Aktivität von etwa 15% der gesamten auf die Säule aufgetragenen Aktivität. Es ergab auf dem Zymographen Banden entsprechend einem Molekulargewicht von 70 000 Dalton und 100 000 Dalton oder mehr.

Beispiel 5:

Zu 2 1 eines Kulturüberstands, hergestellt aus einer Kultur von Maus-Myelomzellen (P3 x 63 Ag8 ATCC TIB-9), die das menschliche tPA-Gen zusammen mit Immunglobulin G als Promotor zur Expression des menschlichen tPA tragen, in einem Kultur-Medium, das 2% hitzeinaktiviertes (56ºC, 30 Minuten) fötales Kälberserum und 20 KIU/ml Aprotinin enthielt, wurden 300 g/l Ammoniumsulfat gegeben. Die resultierende Lösung wurde auf einen pH von 7,0 eingestellt, und dann ließ man sie über Nacht bei 4ºC stehen.
Das resultierende Präzipitat wurde mittels Zentrifugation gesammelt und in 25 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) gelöst. Dann folgte zur Entsalzung eine Dialyse gegen diesen Puffer.
Die Lösung wurde über eine DEAE-Sepharose (Pharmacia AB)-Säule, äquilibriert mit einem 25 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0), gegeben. Nachdem die gesamte Lösung durch die Säule gelaufen war, wurde die Säule mit dem Puffer gewaschen, der zum Äquilibrieren verwendet worden war. Die plasminogen-abhängige fibrinolytische Aktivität des Ausflusses und Eluats war etwa 5% der auf die Säule aufgetragenen Aktivität. Die adsorbierten Proteine wurden mit einem 25 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0), der 0,3 M an Natriumchlorid war, eluiert.
Die Aktivität des Eluats war etwa 90% der auf die Säule aufgetragenen Aktivität. Das Eluat wurde einer SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese unterworfen und mittels Zymographen analysiert. Banden entsprechend einem Molekulargewicht von etwa 30 000 Dalton - 150 000 Dalton wurden als tPA auf dem Zymographen beobachtet.
Diese Fraktion wurde auf einen pH von 6,0 eingestellt und mit einem 25 mM Phosphat-Puffer (pH 6,0) dreifach verdünnt. Die resultierende Lösung wurde durch eine CM-Sepharose (Pharmacia AB)-Säule gegeben, die mit einem 25 mM Phosphat-Puffer (pH 6,0), der 0,1 M an Natriumchlorid war, äquilibriert worden war.
Nachdem die gesamte Lösung über die Säule gelaufen war, wurde die Säule mit einem 25 mM Phosphat-Puffer (pH 6,0), der 0,1 M an Natriumchlorid war, gewaschen. Auf diese Weise wurde etwa 5% der auf die Säule aufgetragenen Aktivität detektiert. Der Ausfluß und das Eluat wurden einer SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese unterworfen und mittels Zymographen anlysiert. Banden in einem Bereich entsprechend einem Molekulargewicht von etwa 30 000 - 60 000 Dalton wurden auf dem Zymographen beobachtet.
Die adsorbierten Proteine wurden mit einem 25 mM Phosphat-Puffer (pH 6,0), der 0,3 M an Natriumchlorid war, eluiert. Die Aktivität des Eluats war etwa 80% der auf die Säule aufgetragenen Aktivität. Eine einzige Bande entsprechend einem Molekulargewicht von etwa 70 000 Dalton wurde auf dem Zymographen beobachtet.
Dann wurde die Säule einer Elution mit einem 25 mM Phosphat-Puffer (pH 6,0), der 0,6 M an Natriumchlorid war, unterzogen. Darauf wurde gefunden, daß etwa 15% der auf die Säule aufgetragenen Aktivität wiedergewonnen wurde. Banden entsprechend einem Molekulargewicht von 70 000 Dalton und 100 000 Dalton oder mehr wurden auf dem Zymographen beobachtet.

Beispiel 6:

Man ließ Hefe-Wirtszellen, transformiert mit dem menschlichen tPA-Gen darin, in einem Standard-Hefe-Kulturmedium wachsen, wobei im allgemeinen das Verfahren angewandt wurde, das in Principles and Practice of Recombinant DNA Research with Yeast in the Molecular Biology of Yeast Saccharomyces: Metabolism and Gene Expression, Seiten 603 - 636, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982) beschrieben ist.
Die resultierenden Zellen wurden mit Glaskügelchen zerrieben. tPA wurde mit einem 0,04 M Phosphat-Puffer (pH 7,5), der 0,02% Tween 80 und 20 KIU/ml Aprotinin enthielt, extrahiert. Der Extrakt wurde zentrifugiert und ein Überstand erhalten. Von diesem Überstand wurde tPA auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 wiedergewonnen. Die Ausbeute der Wiedergewinnung von tPA betrug etwa 60%, sein Molekulargewicht betrug etwa 70 000 Dalton.

Claims

1. Verfahren zur Reinigung von tPA, das die Schritte umfaßt:

(a) ein Carboxymethyl-Agarose-Austauscherharz mit einer rohen tPA-Präparation, enthaltend tPA mit einem Molekulargewicht von etwa 70 000 Dalton sowie unreine tPA-Spezies einschließlich aktiver abgebauter tPA-Produkte, tPA-Polymere und Komplexe von tPA mit anderen Proteinen, in Kontakt zu bringen, wobei die unreinen tPA-Spezies andere Molekulargewichte als etwa 70 000 Dalton haben und mit einem Anti-menschliches tPA-Antikörper reagieren können;

(b) das Austauscherharz mit einem Elutionsmittel mit einer Salzkonzentration von weniger als 0,15 M und einem pH im Bereich von 6,0 - 6,4 zur Elution der unreinen tPA-Spezies mit Molekulargewichten von weniger als etwa 70 000 Dalton zu behandeln; und dann

(c) das Austauscherharz mit einem Elutionsmittel mit einer Salzkonzentration im Bereich von 0,175 - 0,375 M und einem pH im Bereich von 6,0 - 6,4 zur Elution des tPA mit einem Molekulargewicht von etwa 70 000 Dalton zu behandeln und das resultierende Eluat aufzubereiten.

2. Verfahren zur Reinigung von tPA, das die Schritte umfaßt:

(a) ein Carboxymethyl-Acrylamid-Copolymer-Austauscherharz mit einer rohen tPA-Präparation, enthaltend tPA mit einem Molekulargewicht von etwa 70 000 Dalton sowie unreinen tPA-Spezies einschließlich aktiver abgebauter tPA-Produkte, tPA-Polymere und Komplexe von tPA mit anderen Proteinen, in Kontakt zu bringen, wobei die unreinen tPA-Spezies andere Molekulargewichte als etwa 70 000 Dalton haben und mit einem Anti-menschliches tPA-Antikörper reagieren können;

(b) das Austauscherharz mit einem Elutionsmittel mit einer Salzkonzentration von mindestens 0,075 M und einem pH im Bereich von 6,0 - 6,4 zur Elution der unreinen tPA-Spezies mit Molekulargewichten von weniger als 70 000 Dalton zu behandeln; und dann

(c) das Austauscherharz mit einem Elutionsmittel mit einer Salzkonzentration von 150 mM - 200 mM und einem pH im Bereich von 6,0 - 6,4 zur Elution der tPA-Spezies mit einem Molekulargewicht von etwa 70 000 Dalton zu behandeln und das resultierende Eluat aufzubereiten.