DE3010801A1

DE3010801A1 - Verfahren zur herstellung von immunoglobulin zur intravenoesen verabreichung

Info

Publication number: DE3010801A1
Application number: DE3010801A
Authority: DE
Inventors: Toshihito Mori; Nobuo Yokoo
Original assignee: Kowa Co Ltd
Current assignee: Kowa Co Ltd
Priority date: 1979-03-22
Filing date: 1980-03-20
Publication date: 1980-10-02
Also published as: GB2044775B; US4256631A; SE8002192L; GB2044775A; DE3010801C2; FR2451745A1; JPS62885B2; JPS55124719A; FR2451745B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Immunoglobulin zur intravenösen Verabreichung.

Es ist bekannt, Immunoglobulin des Menschen allein oder in Kombination mit Antibiotika als Heilmittel oder als vorbeugendes Mittel zu verwenden, und zwar hauptsächlich bei einer Gammaglobulinämie, bei durch Viren ausgelösten Infektionskrankheiten (wie z.B. Masern, Röteln, Polio, Hepatitis und dergl.) und bei bakteriellen Infektionskrankheiten.

Bisher wurde Immunoglobulin für klinische Zwecke aus Humanplasma oder placentalem Blut als Ausgangsmaterial mittels der Alkoholfraktionierung nach Cohn oder mittels eines ähnlichen Verfahrens erhalten. Es ist jedoch bekannt, daß ein derartig hergestelltes, herkömmliches Immunoglobulin bei intravenöser Verabreichung einen anaphylaktischen Schock verursacht, und man war folglich gezwungen, das Mittel als intramuskuläre Injektion zu verabreichen.

Man nimmt an, daß die Anaphylaxie aufgrund der Dekomplementierungsreaktion eintritt, die durch aggregiertes oder teilweise denaturiertes Globulin verursacht wird. Dieses Globulin entsteht während der Verfahrensschritte zur Herstellung von Immunoglobulin oder während dessen Lagerung.

In jedem Fall ist die Applikation von Immunoglobulin bei intramuskulärer Verabreichung mit Schmerzen verbunden. Das Immunoglobulin kann daher nicht in großen Mengen verabreicht werden. Ein weiterer Nachteil besteht darin, daß Globulinmoleküle mit einem Molekulargewicht von etwa 160 000 die Neigung haben, während einer langen Zeit nach der Verabreichung am Ort der Verabreichung zu verbleiben, da ihr Übertritt ins Blut langsam und gering ist.

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Aus den obengenannten Gründen ergab sich die Forderung, ein Immunoglobulin zu entwickeln, das zur intravenösen Verabreichung geeignet ist. Es sind folglich auch Untersuchungen zur Herstellung eines Immunoglobulins gemacht worden, das dadurch, daß man aggregiertes oder denaturiertes Globulin zersetzt oder entfernt, eine geringere Neigung zur Dekoraplementierungsreaktion aufweist. Als Ergebnis dieser Untersuchungen sind folgende Verfahren zur Behandlung des Immunoglobulins, welches beispielsweise mittels der Fraktionierung nach Cohn erhalten wurde, gemacht worden: (1) Das Immunoglobulin wird einer enzymatischen Hydrolyse unter Verwendung von Pepsin, Plasmin, Papain, bakteriellen Proteasen oder dergl. unterworfen; (2) das Immunoglobulin wird chemisch mit einer Säure, Propiolacton oder dergl. behandelt; (3) das Immunoglobulin wird durch Amidierung, Alkylierung, S-SuIfonierung oder dergl. in ein chemisches Derivat überführt; und (4) das Immunoglobulin wird einer fraktionierten Fällung unterworfen, wobei ein Polyäthylenglykol oder dergl. verwendet wird. Einige der resultierenden Produkte werden jetzt klinisch verwendet.

Die oben erwähnten Verfahren weisen jedoch verschiedene Nachteile auf. Das Verfahren (1) hat den Nachteil, daß die Antikörperaktivität erniedrigt wird und die Halbwertszeit des Immunoglobulins im Blut verkürzt wird. Verfahren (2) und (3) haben den Nachteil, daß die Antikörperaktivität erniedrigt wird. Um derartige Nachteile zu überwinden, ist ein Verfahren untersucht worden, mit dem lediglich die denaturierten Verunreinigungen entfernt werden und wobei gleichzeitig die inhärenten Eigenschaften des Globulins erhaltenbleiben. Aufgrund dieser Untersuchungen ist das Verfahren (4) vorgeschlagen worden. Um jedoch dieses Verfahren durchzuführen, ist eine große Menge Polyäthylen-

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glykol oder dergl. erforderlich, was ein Problem hinsichtlich der Wirtschaftlichkeit des Verfahrens darstellt.

Im Hinblick auf den oben beschriebenen Stand der Technik wurden erfindungsgemäß intensive Untersuchungen durchgeführt, um Immunoglobulin ohne die oben erwähnten Nachteile herzustellen. Dabei wurde gefunden, daß die unter Dekomplementierung reagierenden Substanzen effektiv eliminiert werden können, indem man Immunoglobulin durch eine Kombination von fraktionierter Fällung und Affinitätschromatographie reinigt. Dabei wird das Verfahren zur fraktionierten Fällung unter Verwendung von einem oder mehreren zweiwertigen oder dreiwertigen Metallsalzen durchgeführt. Die Affinitätschromatographie wird unter Verwendung eines Komplexes von Human-IgG und einer polymeren Polyhydroxyverbindung durchgeführt. Die vorliegende Erfindung beruht auf diesen Beobachtungen.

Es ist also Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung von Immunoglobulin zur intravenösen Verabreichung zu schaffen, bei dem ein Immunoglobulin erhalten wird, dessen Antikörperaktivität nicht verringert ist, dessen Halbwertszeit im Blut nicht verkürzt ist und das auf wirtschaftlich vorteilhafte Weise erhalten werden kann. Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Verfahren zur Herstellung eines für intravenöse Verabreichung geeigneten Immunoglobulins gelöst. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man ein Immunoglobulin durch eine Kombination zweier Verfahren, und zwar in beliebiger Reihenfolge, reinigt, wobei das eine Verfahren eine fraktionierte Fällung ist, bei der ein oder mehrere zweiwertige oder dreiwertige Metallsalze zu einer wäßrigen Lösung des Immunoglobulins gegeben werden, um das Überstehende aufzufangen, und wobei das andere Verfahren eine Affinitätschromatographie ist, bei der als Adsorbens

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ein Komplex von Human-IgG und eine polymere Polyhydroxyverbindung verwendet werden.

Unter den Immunoglobulinen, die erfindungsgemäß als Ausgangsmaterial verwendet werden können, sind diejenigen, die mittels irgendeines bekannten Verfahrens, wie z.B. einer Alkoholfraktionierung, einer Rivanol-Fraktionierung, einer Ammoniumsulfatfraktionierung und dergl., aus menschlichem Plasma oder menschlicher Placenta erhalten werden können, sowie Immunoglobulin, das zur intramuskulären Injektion im Handel erhältlich ist.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird beispielsweise folgendermaßen durchgeführt. Das Ausgangs-Immunoglobulin wird in Wasser oder einer wäßrigen Lösung eines Salzes zu einer Konzentration von 1 bis 20% (Gew./Vol.) aufgelöst. Zu der Lösung werden ein oder mehrere zweiwertige oder dreiwertige Metallsalze in einer Konzentration von 10~⁵ bis 10 M gegeben und anschließend wird der pH-Wert auf 5 bis 9 eingestellt, um das aggregierte oder denaturierte Globulin auszufällen, welches die Dekomplementierungsreaktion verursacht. Anschließend wird das Präzipitat auf herkömmliche Weise, wie Zentrifugation, Filtration oder dergl., unter Auffangen der überstehenden Lösung abgetrennt.

Die bei dem oben beschriebenen Verfahren verwendeten Salze von zweiwertigen oder dreiwertigen Metallen umfassen beispielsweise Chloride, Sulfate, Phosphate, Acetate, Formiate, Carbonate, Bicarbonate und ähnliche Salze von Erdalkalimetallen, wie z.B. Magnesium, Calcium, Barium usw., und Metallen, wie z.B. Aluminium, Zinn, Blei, Eisen, Kupfer, Zink usw..

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Anschließend wird die auf diese Weise erhaltene überstehende Lösung durch eine Säule laufen lassen, die mit einem Komplex von Human-IgG und einer polymeren Polyhydroxyverbindung gefüllt ist. Bei einer anschließenden Eluierung der Säule mit einer Salzlösung oder Glycinlösung geringer Konzentration wird das die Dekomplementierungsreaktion verursachende, aggregierte und/oder denaturierte Globulin auf dem IgG des Trägers adsorbiert, während von jeglichen^eine Dekomplementierungsreaktion verursachenden Substanzen freies Immunoglobulin eluiert wird.

Als polymere Polyhydroxyverbindung, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden kann, kommen beispielsweise folgende in Frage: Agarosen, wie Sepharose (Warenzeichen, ein Produkt der Pharmacia Fine Chemicals), Cellulose; Dextrane, wie Sephadex (Warenzeichen, ein Produkt der Pharmacia Fine Chemicals); und Glaskügelchen, wie CPG (Warenzeichen, ein Produkt der Corning Glass Works). Der Komplex der polymeren Verbindung und Human-IgG kann leicht mittels eines herkömmlichen Verfahrens hergestellt werden, d.h. dadurch, daß man das Human-IgG auf die polymere Verbindung wirken läßt, die mit Cyanbromid aktiviert wurde.

Für das Eluierungsmittel brauchbare Salze umfassen die Chloride, Sulfate, Phosphate, Acetate, Formiate, Carbonate, Bicarbonate und ähnliche Salze von Alkalimetallen, wie Natrium, Kalium, usw.; Erdalkalimetallen, wie Calcium, Magnesium, usw.; und Ammonium. Das Eluierungsmittel wird gewöhnlich in einer Konzentration von 0,001 bis 0,5 M, insbesondere 0,03 bis 0,06 M, verwendet.

Die erfindungsgemäß durch die fraktionierte Fällung erhaltene überstehende Lösung enthält die eingesetzten Metallionen. Diese Ionen müssen entfernt werden, z.B. durch eine

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Dialyse oder durch Ionenaustauschchromatographie. Diese Verfahrensstufe des Entfernens der Ionen kann entweder vor oder nach der Affinitätschromatographie durchgeführt werden. In der Praxis hat es sich als zweckmäßig erwiesen, die überstehende Lösung gegen das bei der Affinitätschromatographie verwendete Eluierungsmittel zu dialysieren und anschließend die resultierende Lösung der Affinitätschromatographie zu unterwerfen.

Um das erfindungsgemäß angestrebte Immunoglobulin zu erhalten, ist es wesentlich, die Verfahren der fraktionierten Fällung und der Affinitätschromatographie als Kombination anzuwenden. Der erfindungsgemäße Zweck wird nicht befriedigend erreicht, wenn nur eines dieser Verfahren angewendet wird, die Reihenfolge bei der Kombination kann jedoch wahlweise bestimmt werden. Die zur Affinitätschromatographie verwendete Säule wird mit dem Eluierungsmittel gewaschen, und zwar mit erhöhter Salzkonzentration, um die die Dekomplementierungsreaktion verursachenden Substanzen, die an der Säule adsorbiert sind, zu eluieren. Anschließend kann die Säule für einen folgenden Zyklus der Affinitätschromatographie wiederverwendet werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren, wie es oben beschrieben wurde, ist industriell vorteilhaft anwendbar; denn es kann auf wirtschaftliche Weise unter Verwendung von wohlfeilen Reagentien und Adsorptionsmitteln ein extrem reines Immunoglobulin hergestellt werden.

Die vorliegende Erfindung wird anhand des folgenden Bezugsbeispiels und anhand von Beispielen näher erläutert.

Bezugsbeispiel

Herstellung des Adsorptionsmittel für die Affinitätschromatographie

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Zu 10 ml Sepharose 4B, dem 2 g Cyanbromid bei 20⁰C unter Rühren zugegeben wurden, gibt man 10 ml Wasser und hält anschließend den pH-Wert unter Verwendung einer 5N Natriumhydroxidlösung bei 11. Nach 5 min wird die Reaktionslösung durch Filtration abgetrennt und der Rückstand mit einem 0,1 M Boratpuffer von pH 8,0 ausreichend gewaschen. Anschließend wird der Rückstand in der Pufferlösung suspendiert. Zu der Suspension gibt man eine wäßrige Lösung, enthaltend 200 mg Human-IgG. Nachdem die Mischung über Nacht unter Rühren bei 5°C stehengelassen wurde, gibt man 200 mg Glycin zu der Mischung und rührt eine weitere Stunde. Nach Beendigung der Reaktion wird der Feststoffanteil auf einem Glasfilter gesammelt und gründlich mit einer physiologischen Kochsalzlösung gewaschen, um auf diese Weise einen Komplex von Human-IgG und Sepharose zu erhalten.

Beispiel 1

(a) Die Cohn-Fraktionen II + III, die gemäß dem Verfahren von Taylor et al [vgl.J.Am.Chem.Soc.68, 459(1972)] von einer Humanplacenta durch Alkoholfraktionierung erhalten wurden, werden zu einer etwa 5#igen wäßrigen Lösung verarbeitet. Zu 10 ml der so hergestellten Lösung (enthaltend 540 mg Globulin) gibt man 10/ul einer 2%igen wäßrigen Zinksulfatlösung und 3 Tropfen einer wäßrigen 0,5N Natriumhydroxidlösung. Der resultierende Niederschlag wird durch Zentrifugieren entfernt und die überstehende Lösung wird gegen eine 0,04 M wäßrige Natriumchloridlö sung dialysiert, um eine Lösung zu erhalten, die 456 mg (bei einer Wiedergewinnungsrate von 8596) Globulin enthält. (Das Globulin weist einen Dekomplementärwert von 25 C¹H₅₀ auf.)

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(b) Die obige Lösung (enthaltend 456 mg Globulin) wird mit einer 0,04 M Kochsalzlösung auf 20 ml verdünnt. Die IgG-Sepharose-Affinitätssäule (5 ml Sepharose 4B, enthaltend 90 mg IgG, 1,5 x 3 cm), die gemäß dem Verfahren des Bezugsbeispiels erhalten wurde, wird mit einer 0,04 M Kochsalzlösung, zu der die obige Globulinlösung zur Adsorption zugegeben wurde, äquilibriert. Anschließend wird die Säule mit einer 0,04 M Kochsalzlösung eluiert, und das Eluat wird jeweils in Fraktionen von 2 ml aufgefangen. Die Fraktionen Nr. 3 bis 11 werden vereinigt, und man erhält 350 mg Immunoglobulin (mit einer Wiedergewinnungsrate von 77%), das einen Dekomplementärwert von 5 C¹H₅₀ aufweist.

Beispiel 2

Die Cohn-Fraktionen II + III vom gleichen Typ wie in Beispiel 1 werden in einer physiologischen Kochsalzlösung aufgelöst, um eine Konzentration von etwa 5% zu erhalten. Zu 10 ml der obigen Lösung (enthaltend 520 mg Globulin) gibt man 0,2 ml einer 2#igen wäßrigen Aluminiumchloridlösung und stellt anschließend den pH-Wert mit einer wäßrigen Natriumphosphatlösung auf 7»0 ein. Der resultierende Niederschlag wird durch Zentrifugieren entfernt, und die Überstehende Lösung wird gegen eine 0,04 M Natriumchloridlösung dialysiert, um eine Lösung zu erhalten, die 416 mg (Wiedergewinnungsrate 80#) Globulin (mit einem Dekomplementärwert von 30 C¹He₀) enthält.

Anschließend wird das Verfahren von Beispiel i(b) wiederholt. Es resultiert eine Lösung von Immunoglobulin, die keine Dekomplementierungsreaktion verursacht.

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Beispiel 3

(a) In einer 0,04 M Kochsalzlösung löst man 500 mg der Cohn-Fraktionen II + III. Die so hergestellte Lösung wird einer Affinitätschromatographie unterworfen, und zwar gemäß dem gleichen Verfahren, wie es in Beispiel 1(b) beschrieben wurde. Man erhält eine Fraktion, die 400 mg Globulin enthält (mit einer Wiedergewinnungsrate von 80%), wobei das Globulin einen Dekomplementärwert von 23 C¹Hc₀ aufweist.

(b) Zu 30 ml der obigen Fraktion (die 400 mg Globulin enthält) gibt man 20 /ul einer 2#igen wäßrigen Zinksulfatlösung und 20/Ul einer 0,5N wäßrigen Natriumhydroxidlösung. Der resultierende Niederschlag wird durch Zentrifugieren entfernt. Die überstehende Lösung enthält 340 mg Globulin (Wiedergewinnungsrate 8596) mit einem Dekomplementärwert von 18 C¹H₅₀.

Es ist anzumerken, daß die in den Beispielen angegebenen Dekomplementärwerte dadurch bestimmt wurden, daß man gemäß dem Verfahren von Kobat und Mayer [vgl.Experimental Immonochemistry (2nd Edition), C.C.Thomas Publishers (1961)Ä einen Hämolysegrad bestimmt. Dabei werden rote Blutzellen vom Schaf verwendet und der C'H₅₀-Wert aus dem Wert für den Hämolysegrad berechnet.

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Claims

1A-3193 FP-KW-7 KOWA CO., LTD. Nagoya, Aichi/Japan Verfahren zur Herstellung von Immunoglobulin zur intravenösen Verabreichung Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung von Immunoglo.bulin zur intravenösen Verabreichung, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Immunoglobulin durch eine Kombination, und zwar in beliebiger Reihenfolge, von fraktionierter Fällung, bei der eines oder mehrere zweiwertige oder dreiwertige Metallsalze zu einer wäßrigen Lösung des Immunoglobulins gegeben werden und das Überstehende aufgefangen wird, und von einer Affinitätschromatographie unter Verwendung eines Komplexes von Human-IgG und einer polymeren PoIyhydroxyverbindung als Adsorptionsmittel reinigt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die fraktionierte Fällung die Zugabe von einem oder mehreren zweiwertigen oder dreiwertigen Metallsalzen

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zu der wäßrigen Immunoglobulinlösung in einer Konzentration von 10 ^J bis 10 M, Einstellen des pH-¥erts der Lösung auf 5 bis 9 und anschließendes Auffangen des Überstehenden umfaßt.

3♦ Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als polymere Polyhydroxyverbindung Agarose, Cellulose, Dextran oder Glaskügelchen verwendet.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Eluierungsmittel bei der Affinitätschromatographie eine Lösung eines Alkalimetall-, Erdalkalimetall- oder Ammoniumsalzes oder eine Glycinlösung verwendet.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration des Eluierungsmittels im Bereich von 0,001 bis 0,5 M liegt.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man im wesentlichen wie in den Beispielen 1 bis 3 beschrieben vorgeht.

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