SE500110C2 - Sätt att rena ett protein från därtill bundna flervärda metalljoner - Google Patents

Description

(TI 10 15 20 25 30 35.

C ._) CD Skadligheten hos andra metaller. såsom järn. krom. nickel och bly. är tidigare känd, antingen på grund av deras vanliga toxicitet; eller pà grund av deras förmåga att exem- pelvis framkalla allergier.

Genom föreliggande uppfinning undanröjes de ovan angivna olägenheterna. och tillhandahållas ett sätt att rena proteiner från därtill bundna flervärda metalljoner. sa att som produkt erhålles ett eller flera proteiner med en starkt minskad halt av bundna flervärda metalljoner.

Enligt uppfinningen renas ett protein fràn därtill bund- na flervärda metalljoner genom att de flervärda metalljonerna frigöres genom att de utbvtes mot envärda metalljoner. och därefter avlägsnas. I en speciell utföringsform av uppfinnin-A gen avlägsnas därefter även de envärda metalljonerna.

De envärda metalljoner som de flervärda metalljonerna utbytes mot utgöres främst av alkalimetallkatjoner. speciellt då av natrium eller kalium. eller av ammonium.

I ritningen visas ett flödesschema över diafiltrering. som är en utföringsform av uppfinningen. vilken även närmare beskrives i följande exempel.

De till proteinet bundna flervärda metalljonerna utbvtes mot de envärda metalljonerna genom att en lösning av proteinet metalljon i sa. att de frigjorda behandlas med en lösning av ett salt av en envärd Härigenom förskjutes jämvikten De hög koncentration. flervärda katjonerna förtränges av de envärda. flervärda metallkatjonerna kan sedan avlägsnas medelst nagot Härvid har speciellt av flera kända förfaranden. diafiltrering och gelfiltrering visat sig vara lämpliga i båda utbytesste- gen.

Vid en diafiltrering anordnas en strömning av den vätska som skall filtreras parallellt med filtrets yta. och en tryck- gradient pàlägges över filtret. Filtrets porstorlek väljas beroende av molekylstorleken hos det protein som skall renas, så att proteinmolekylerna kvarhàlles. medan metalljonerna pas- serar igenom. Porerna är vanligen av storleksordningen nanome- ter. Den proteinlösning som skall filtreras försättes med en lösning av salt av envärd metalljon i hög koncentration innan den inledas över filtervtan. Härvid förtränges de bundna flervärda metalljonerna fràn proteinet och utbytes mot envärda 10 15 20 25 30 35 N 01 Cü _ > ...S ...A _ CJ' metalljoner. och passerar sedan genom filtret som filtrat. Det erhållna koncentratet av proteinlösning försättes med ytterli- gare lösning av~envärt metallsalt i en mängd som svarar mot det avdragna filtratet. och àterföres till förnyad filtrering. och denna process fortsättes. tills halten av flervärda me- talljoner minskat till önskat värde.

Om sa önskas. kan diafiltreringen sedan fortsättas med tillsats av vatten istället för saltlösning. varvid de envärda metalljonerna förtränges fràn proteinmolekvlerna och avlägsnas genom filtret._ Vid gelfiltrering kan samma princip tillämpas med an- vändning av nagot känt gelfiltermaterial. t ex en tvärlänkad dextrangel. såsom $ephadeŧ)G 10 eller G 25. Gelfiltermateria- let väljes så. att det har en lämplig porstorlek som är anpas- sad-till molekylstorleken hos det protein som skall renas.

Gelfiltreringen genomföres med proteinet i en buffertlösning med hög halt av envärt metallsalt för att förtränga de bundna flervärda metalljonerna. I de flesta fall kan den önskade reningseffekten uppnås genom att en tillräcklig mängd envärt metallsalt sättes till det prov som skall gelfiltreras. Vid rätt anpassad porstorlek hos gelfiltermaterialet kommer pro- teinet att strömma genom filtermediet. medan de flervärda me- talljonerna fördröjes. och därigenom kan skiljas från protei- net.

Halten av envärt metallsalt i den lösning som användes för att förtränga de flervärda metalljonerna från proteinet vid diafiltreringen eller gelfiltreringen kan variera inom relativt vida gränser. Den lägre haltgräns som icke bör under- skridas utgöres av den fysiologiska salthalten. alltså 0.9 1 wlv eller 0.15 M. Den övre haltgränsen sättas i princip av lösningens mättnadshalt av ifrågavarande salt. men även andra faktorer kan här vara av betydelse. Exempelvis kan vissa pro- teiner denatureras av höga salthalter. För íackmannen före- ligger dock inga svårigheter att inställa en lämplig salthalt pa basis av enkla förförsök.

De proteiner som kan renas medelst sättet enligt före- liggande uppfinning kan vara av synnerligen olika typ. Spe- ciellt har sättet visat sig vara lämpligt för rening av albu- min. såsom humant serumalbumin. och gammaglobulin. Uppfinnin- ._4~~_ sJLvšJ io 15 20 25 30 fífïñ I :U gen är dock icke begränsad till rening av enbart dessa pro- teiner. ' 1 I Uppfinningen àskàdliggöres närmare av följande exempel.

Exempel 1: 5 l av en 10-procentig lösning av humant serumalbumin (BSA) diafiltreras mot 15 l IM natriumkloridlösning. I rit- ningsfiguren visas schematiskt en anordning för genomförande av sättet.

Anordningen innefattar en förràdstank 1 för vatten och en förràdstank 2 för 1M natriumkloridlösning. Förràdstankarna är över utloppsledningar 3 resp. 5 och ventiler 4. resp. 6 förbundna med en gemensam ledning 7 till en förràdsbehàllare 8 för albuminlösningen. Fràn behållaren 8 ledes albuminlösningen genom ledningen 9 in i ultrafiltreringsanordningen 10. vars filter har en porositet av 10 000 ("cut off" molekylvikt).

Från denna uttages ett filtrat genom ledningen 11 och återfö- res ett koncentrat genom ledningen 12 till förràdsbehàllaren 8. Det uttagna filtratet har volvmnen F1. och en lika stor volym P1 av vatten eller saltlösning tillföras genom ledningen 7 till förradsbehaliaran a för att hålla volymen konstant.

Vid filtreringen är först ventilen 4 stängd och ventilen 6 öppen. och saltlösning tillföres från förràdstanken 2 till förràdsbehàllaren 8 för att förtränga de flervärda metalljo- nerna fràn proteinet och därefter avlägsna dem i filtratet genom ledningen 11. När filtreringen fortskridit så langt. att halten av flervärda metalljoner i proteinet minskats till önskat värde. stänges ventilen 6 och öppnas ventilen 4. och filtreringen fortsättes med tillförsel av rent vatten för att i sin tur förtränga de envärda metalljonerna frán proteinet och avlägsna dem i filtratet genom ledningen 11. Filtreringen med tillsats av rent vatten fortsättes sedan tills halten av envärda metalljoner minskats till önskat värde.

I föreliggande exempel sättes 15 1 IM natriumkloridlös- ning kontinuerligt till albuminlösningen under dess filtre- ring. varvid dess halt av flervärda metalljoner. t ex alumi- nium. minskas till ett värde under 30 ug/l. Ingàngsvärdena pà metallhalten är vanligen inom omradet fràn 200 till 1500 ug/l.

Detta innebär alltsa en väsentlig minskning av halten av icke önskade flervärda metalljoner i proteinet. 10 25 20 25 30 35' (BG l ïfl UI (TI För Fe, Pb och Cr var i detta fall halterna i den in- gående albuminlösningen 3,2, respektive 0,36 och 0,6 mg/l.

Dessa halter minskades efter behandlingen till 0,3, respektive 0,08 och 0,02 mg/ml.

Exemgel 2: Raalbumin fran etanolfraktionering av plasma (Fr. V) löstes till en halt av ca 10 % i destillerat vatten. Lösningen filtrerades;'och pH justerades till 7,0.

Diafiltrering genomfördes därefter mot en natriumklorid- lösning, innehållande 2 mol/1 NaCl. Totalt användes 135 1 av denna lösning. Prov uttogs var 45:e liter för bestämning av aluminiumhalten. Ultrafilter med "cut off" 10 000 användes.

.Resultaten framgår av följande tabell 1: Tabell 1 Tillsatt diafilt- geringslösning Al-halt mg/l o _ 0,35 45 ' i 0,16 so . 0,11 135 0,04 Halten av aluminium efter reducering av natriumhalten var 0,01 mg/1 Exemgel 3: Raalbumin enligt exempel 2 löstes till en halt av ca 10 I i destillerat vatten. Lösningen filtrerades, och filtre- tets pH justerades till 7,0. Den totala volymen var 3 liter.

Till lösningen sattes fast natriumklorid till en halt av 2 mol/1, och lösningens halt av aluminium bestämdes till 0,86 mg/ml. Därefter diafiltrerades lösningen mot 9 liter NaCl-1ös- ning med halten 2 mol/1. Det använda diafiltret hade "cut off" vid molvikten 10 000. Albuminlösningens och permeatets halter av aluminium bestämdes efter tillsats av bestämda mängder NaCl-lösning. Resultaten framgår av följande tabell 2: 10 15 20 25 30 35.

Tabell 2 Albuminlösning Permeat Al-halt. mg/ml Volym diafiltre- ringslösninq, 1 Al-halt. mg/ml 1.5 0.41 0.56 3 0,32 0.31 4.5 0.23 0.24 6 0,16 0.16 9 0.09 0.10 Albuminlösningen diafiltrerades därefter mot 30 liter destillerat vatten för avsaltning, och lösningens Al-halt under avsaltningen bestämdes. Resultaten framgår av följande tabell 3: Tabell 3: Volym. 1 Albuminlösning Al-halt. mg/ml 0.02 (0.01 (0.01 <0.01 <0.01 OGOIJXN Efter avsaltningen koncentrerades lösningen till en albuminhalt av 20 %. 0.02 mg/ml.

Exemgel 4: 41.4 kg 10-procentig albuminlösning varefter aluminiumhalten uppmättes till pH-justerades till 7.0, och natrimklorid i fast form tillsattes till en halt av 2 mol/l. Ett prov av lösningen analyserades med avseende pà halterna av Al. Fe. Cr och Mg.

Lösningen diafiltrerades med 125 liter natriumkloridlös- ning md halten 2 mol/l. Därefter avsaltades lösningen med des- tillerat vatten. tills natriumhalten understeg 0.7 mg/ml.

Detta uppnàddes efter tillsats av 250 liter destillerat vatten. 10 15 20 25 30 35_ \| .V1 CJ C) ma -A LD Efter avsaltningen koncentrerades lösningen till en albuminhalt av 20 t. samt sterilfiltrerades och fvlldes på flaskor (100 ml) för värmebehandling under 10 timmar vid 60°C.

Halterna av de ovan nämnda metallerna bestämdes hos lösningen före avsaltningen och efter värmebehandlingen pa flaska. och de erhållna analysresultaten framgår av följande tabell 4: Tabell 4: mg/ml Al Fe Cr Mg Utgàngsmaterial. 0.47 4.34 0.08 2.51 omräknat till 20 % albumin Koncentrat fràn 0.02 0.7 0.03 0.1 diafiltrering I flaska efter 0.02 0.3 <0.01 0.1 värmebehandling Genom föreliggande uppfinning tillhandahalles sålunda ett enkelt och skonsamt sätt att avlägsna oönskade flervärda metalljoner som bundits till ett protein. Sättet är allmänt tillämpbart för rening av proteiner. och är icke begränsat till enbart det som angivits i föreliggande beskrivning och exempel. Det inses även. att ytterligare varianter och modifi- kationer av uppfinningen är möjliga inom ramen för de följande patentkraven. Exempelvis kan även en dltrafiltrering användas vid reningen. men är icke lika rationell. eftersom man då måste efterfylla med saltlösning eller vatten. Principen för uppfinningen kvarstår dock oförändrad.

Litteraturreferenser: 1. Crapper D R. Kishnan S S. Quittat S: Aluminium. neuro- fibrillary degeneration and A1zheimer's disease. Brain 197S.99.67-80 Uf r'\ ß) 10 15 20 -x C) Grappa: n R. Quinn os. Krishnan s s at al» Intra- nuclear aluminium content in Alzheimer's disease. dialysis encephalo-Acta Neuropath 19BO.50.19-24 Alfrey A C. Le Gendre G R. Kaehny W D: The dialysis encephalopathy syndrome. Possible aluminium intoxica- tion. N Eng. Med 1976.294.184-188 Alfrey A C. Hegg A. Craswell P: Metabolism and toxicity of aluminium in renal failure. Am J Clin Nutr 1980.33.1509-1516 Per D P. Gajdusek D C. Garruto R M et al.: Intraneuronal aluminium accumulation in amyothropic lateral sclerosis and Parkinson-dementia of Guam. Science 1982.217.1053-1055 May J C. Rains I C. Maienthal F J et al.: A survey of the concentrations of eleven metals in vaccins, allerqenic extracts. toxoids. blood. blood derivatives and other_bioloqica1 products. J Biol Stand 1986.14.363- 375

Claims (7)

l-'Il 10 15 20 25 30 35 I \ v f"'\ k-r \ ...ß- _.)- CÜ Patentkrav

1. l. Sätt att rena ett protein från därtill bundna flervär- da metalljoner, k ä n n e t e c k n a t därav, att de flervär- da metalljonerna frigöres från proteinet genom att utbytas mot envärda metalljoner, bestående av alkalimetall- eller ammonium- joner, genom att proteinet med därtill bundna flervärda metall- joner underkastas en diafiltrering mot en lösning som innehål- ler de envärda metalljonerna, så att de flervärda metalljonerna förtränges från proteinet och erhålles i ett filtrat, eller att proteinet med därtill bundna flervärda metalljoner ungerkastas en gelfiltrering i en lösning av de envärda metalljonerna, så att de flervärda metalljonerna förtränges från proteinet och fördröjes vid filtreringen, varefter de från proteinet frigjor- da, flervärda metalljonerna på i och för sig känt sätt avlägs- nas.

2. Sätt enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t därav, att efter utbytet av de flervärda metalljonerna mot de envärda, de envärda metalljonerna avlägsnas från proteinet genom att detta underkastas en förnyad diafiltrering mot en lösning som väsentligen icke innehåller några metalljoner, eller under- kastas en förnyad gelfiltrering i en lösning som väsentligen icke innehåller några metalljoner.

3. Sätt enligt krav 1 eller 2, därav, att de flervärda metalljonerna utgöres av en eller flera k ä n n e t e c k n a t av metallerna

4. Sätt n a t därav, kalium- eller

5. Sätt n a t därav, aluminium, järn och bly. enligt något av krav 1-3, k ä n n e t e c k - att de envärda metalljonerna utgöres av natrium-, ammoniumjoner. enligt något av krav 1-4, k ä n n e t e c k - att de envärda metalljonerna användes i form av en vattenlösning med en halt från ca 0,15 M upp till mättnads- halten.

6. Sätt enligt krav l, k ä n n e t e c k n a t därav, att proteinet utgöres av albumin eller gamma-globulin.

7. Sätt enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t därav, att proteinet utgöres av albumin, och den flervärda metalljonen utgöres av aluminium.