JPH04506349A - タンパク質の浄化方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 タンパク質の浄化方法 本発明はタンパク質をそれに結合した多価金属イオンから浄化する方法に関する 。

多くの生物活性タンパク質は重要な薬剤として広く用いられている。主として様 々な精製方法の結果として、これらのタンパク質は比較的多量の様々な金属を含 みがちである。様々な生物学的生産物中の金属割合についての研究が１９８６年 （６）に公表されているが、この研究から例えばヒト血清アルブミン中の金属割 合が患者に有害な値に達し得ることは明らかである。

前記金属は通常、タンパク質を後処理および浄化する際に用いられる各種添加剤 に由来している。例えば、これらのプロセスは通常、フィルター助剤および比較 的高割合のフィルター助剤を有するフィルターを様々なプロセス段階で溶液を澄 明に濾過する目的で用いている。これらのフィルター助剤はしばしば、タンパク 質にイオンの形で結合できる金属を含んでいる。それらの問題は不活性材料に基 づくフィルターを用いたその他の濾過方法を用いることによって克服することが できる。しかしながら、かかるフィルターは慣用されているフィルター材料に比 べ現在特に高価である。

多くのタンパク質の場合に、多分キレート形成およびイオン交換作用によって多 価金属イオンはタンパク質に符表平４−５０Ｒ，Ｎ３４９　（２） 強く結合する。

様々な錯体形成剤、例えばＥＤＴＡまた１、■クエン酸イオンなどで処理するこ とにより結合金属インンを除去する努力もなされている。しかしながら金属イ“ オンはタンパク質に極めて強（結合しているのでこれＩｒＩの努力は全く成功し ていない。

タンパク質中に混入している多価金属イオンは、例えば、アルミニウム、クロミ ウム、鉛、水銀、鉄、ニッケル、銅およびマグオシラムという金属の１種以上よ り成っていることがある。これらの金属イオンのうち、アルミニウム、鉄および 鉛の除去が最も重要である。

地殻の中で最も通有的な金属であるアルミニウムは、多くの臨床病態、例えばア ルツハイマー型老人性痴呆（１，２）および裂開創ａ！脳疾患（ｃＨａｉｙｓｉ ｓ　ｅｎｃｅｐｈａ３．ｏ−ｐａｔｂ）　（３，４，５）などの病因要素である と推定されている。アルミニウムが組織に蓄積され腎機能障害患者に有害な作用 を及ぼしていることははっきりと確立されている。

他の金属例えば鉄、クロミウム、ニッケルおよび鉛などに障害作用があることは 、例えばそれらの通常の毒性故に、あるいはアレルギー促進能の故に既に知られ ている。

前述の欠点は、強（結合した多価金属イオンの割合が大幅に低下した１種類以上 のタンパク質を目的生成物として得るために、タンパク質に結合した多値金属イ オンからのタンパク質浄化方法を提供する本発明により回避される。

本発明によれば、タンパク質は、結合した多価金属イオンを一価金属イオンと交 換することによって多価金属イオンを遊離させ、そして置換された多価金属イオ ンを除去することにより、結合した多価金属イオンから浄化される。本発明の特 定の一態様によれば、−価金属イオンも引き続いて除去される。

多価金属イオンのａｍに用いられる一価金属イオ゛ンは、主としてアルカリ金属 陽イオン、特にナトリウムまたはカリウム、またはアンモニウム陽イオンである 。

添付図面は透析濾過（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）プロセスのフローシートで あり、該プロセスは本発明の一態様を構成しそして下記実施例により詳細に記載 される。

タンパク質に結合した多価金属イオンはそのタンパク質の溶液を一価金属イオン の塩の高濃度溶液で処理することによりｍ個金属イオンと交換される。このプロ セスにより平衡が移動するため、多価陽イオンは一価陽イオンにより置換される 。遊離された多価金属イオンは次いで一つのまたはいくつかの既知プロセスを用 いて除くことができる。両交換段階に特に有効であると認められるプロセスは透 析濾過およびゲル濾過である。

透析濾過の場合には、濾過されるべき液体をフィルター表面と並行させて流し、 そして該フィルターに対して圧力勾配を印加する。フィルターの細孔径は浄化さ れるべきタンパク質の分子サイズに応じて選択され、それによって金属イオンは フィルターを通過するのに対しタンパク質分子は保持されるようにする。細孔径 は通常ナノメートルのオーダーである。−価金属イオンの塩の高濃實溶液をタン パク質溶液に添加してからその溶液をフィルター上に通ず。これによって結合し た多価金属イオンはタンパク質から排除されて一価金属イオンにより置換され、 そして多価金属イオンは次いでフィルターを濾液として通過する。抜き取られた 濾液に相当する量の一価金属塩の更なる溶液を次に生成タンパク質溶液濃縮液に 添加し、そしてその溶液をさらに濾過させるために再循環させ、そしてこのプロ セスを多価金属イオン含量が所望値に低下するまで続ける。

所望により、透析濾過プロセスは、次いで、塩溶液に代えて水を添加して続ける ことができ、それによって−価金属イオンはタンパク質分子から排除されそして フィルターから除去される。

同じ原理は既知のゲル濾過材料、例えば架橋デキストランゲル、例えば５ｅｐｈ ａｄｅｘ８　ＧＩＯまたｉ：ｊ、Ｇ２５、などを用いたゲル濾過にも適用できる 。ゲル濾過材料は、浄化されるべきタンパク質の分子サイズに相応した適切な細 孔径を有するように選択される。ゲル濾過プロセスは、結合された多価金属イオ ンを排除するために、高割合の一価金属塩を含む緩衝溶液中のタンパク質を用い て行われる。

所望の浄化効果は、大部分の場合に、七分な量の−価金属塩をゲル濾過されるべ き試料に添加することによって達成することができる。ゲル−フィルター材料の 細孔径を正しく適合させれば、タンパク質はフィルター触質を流過するのに対し 、多価金属イオンの方は遅れることとなり、それによって該多価金属イオンをタ ンパク質から単離することができる。

透析濾過またはゲル濾過プロセスにおいて多価金属イオンのタンパク質からの排 除に用いられる溶液中の一価金属塩の割合は比較的広い範囲にわたって変えるこ とができる。この範囲の絶対的下限は生理学的塩素量、すなわち０．９％Ｗ／Ｖ または０．１５Ｍ、によって決定される。上限の方は、原則としてその溶液にお ける当該塩の飽和含量によって決まるが、他の要因も有意であり得る。例えばタ ンパク質によっては高塩含量によって変性してしまうことがある。しかしながら 、当業者であれば簡単な実験に基づいて有効な塩含量を見出すことは困難ではな いであろう。

実に様々なタイプのタンパク質を本発明の方法によって浄化することができる。

この方法はアルブミン、例えばヒト血清アルブミン、およびガンマグロブリンの 浄化に特に有益である。しかしながら、本発明はこれらタンパク質だけの浄化に 限定されるものではない。

本発明を次に、以下の実施例を挙げてさらに説明する。

実施例１： ヒト血清アルブミン（ＩＩＳＡ）の１０％溶液５１を１Ｍ塩化ナトリウム溶液１ ５１に対して透析濾過した。この方法を実施するための装置を添付図面に概略的 に示す。

この装置は貯水槽１および１Ｍ塩化ナトリウム溶液供給槽２を含む。それら貯槽 はそれぞれ導出管３および５そして弁４および６を介してアルブミン溶液貯蔵容 器８につながる共通導管７に接続されている。アルブミン溶液は容器８から管９ を通って限外濾過装置１０に入るが該装置のフィルターは１００００の細孔度（ “カットオフ”分子量）を有する。濾液は管１１を通してフィルター装置工０か ら除去し、そして濃縮液は管１２を通して貯蔵容器８に再循環される。除去され る溶液はＦ、の容量を有し、そして容量を一定に保つために等容量Ｆ、の水また は塩溶液が管７を通して貯蔵容器８に送られる。

濾過プロセスの間は、まず弁４は閉止し弁６は開放しておき、そして塩溶液を貯 蔵槽２から貯蔵容器８に送ることによってタンパク質から多価金属イオンを排除 し、次いでこれら多価金属イオンを管１１を通して溶液に除去する。タンパク質 中の多価金属イオンの割合が所望の値まで低下するまで長時間濾過プロセスを続 けたところで弁６を閉止し弁４を開放し、そして濾過プロセスを清浄水を添加し て続行することによって今度はタンパク質から一価金属イオンを排除して管１１ を通して該−価イオンを濾液に除去する。清浄水を添加して行われる濾過は一価 金属イオンの割合が所望の値に低下するまで続けられ図示された例では、濾過プ ロセスの間、１５１の１Ｍ塩化ナトリウム溶液がアルブミン溶液に連続添加され 、それによってアルブミン溶液中の多価金属イオン、例えばアルミニウムの割合 は３０ｒｔｅ／　Ｉ！より低い値まで低下する。

金属含量の入力値は通常２００〜１５００μ９／１の範囲である。

従ってタンパク質中の望ましくない多価金属イオンの割合の低下は実に相当なも のである。

入力アルブミン溶液中のＦｅ、　ＰｂおよびＣｒの割合は、それぞれ３．２．０ ．３６および０．６ｍｙ／　ｌであった。処理後のこれらの割合はそれぞれ０． ３．０．０８および０．０２ｔｔ／ｍｌに減少していた。

実施例２： 血漿のエタノール画分（Ｆｒ、　Ｖ）よりの粗製アルブミンを蒸留水に約１０％ 含量になるように溶解した。その溶液を濾過しモしてｐＨｌを７，０に調節した 。

次に、２　ｍｏｌ／　Ｉ　ＮａＣ１含有塩化ナトリウム溶液に対して透析濾過を 行った。この溶液は全部で１３５１用いた。

４５１を添加する毎に、サンプルを取ってアルミニウム含量を測定した。１００ ００の“カットオフ”を有する限外フィルターを用いた。結果を次表１に記す： 表１ ４５　０．１６ ９０　０．１１ １３５　０．０４ ナトリウム含量を低下させた後のアルミニウム含量は０、０１り／ｌであつた。

実施例３二 実施例２による粗製アルブミンを蒸留水に約１０％の割合となるように溶解した 。その溶液を濾過しそしてその濾液のｐＨを７．０に調節した。全容量は３１で あった。固体塩化ナトリウムをその溶液に２ｍ０１／ｌの割合となるように添加 したところ、その溶液のアルミニウム割合は０．８６ｍｇ／ｍｌと測定された。

その溶液を次いで２　ｍｏｌ／　ｌの割合を有するＮａＣｌ溶液９１に対して透 析濾過した。使用した透析フィルターは分子量１００００に“カットオフ”を有 した。

アルブミン溶液および透過液のアルミニウムの割合を所与の量のＮａＣ１溶液の 添加後に測定した。結果を次表２に表２ １．５　０．４１　０．５６ ３　Ｑ、３２　０．３１ ４．５　０．２３　０．２４ ６　０．１６　０．１６ ９　６．０９　０．１０ 次にそのアルブミン溶液を脱塩目的で３０１１の蒸留水に対して透析濾過し、そ してその溶液のアルミニウム含量を脱塩プロセス中に測定した。結果を次表３に 記す：６　＜０．０１ その溶液は脱塩後、アルブミン含量２０％まで濃縮され、そしてその後アルミニ ウム含量は０．０２ｓａｇ／ｍＡ！と測定された。

実施例４： ４１．４Ｊ１９の１０％アルブミン溶液を７．０にｐＨ１１節し、そして固体状 塩化ナトリウムを２■ｏｌ／　ｌの含量となるように添加した。溶液のサンプル のＡＩ、　Ｆｅ５ＣｒおよびＭｇ含量を分析した。

その溶液を２ｍｏｌ／　ｌ含量を有する塩イ［・、ナトリウム溶液１２５１で透 析濾過した。次にその溶液イ；ナトリウム含量がＯ，’ＩＢ／ｍｌより低くなる まで蒸留水で脱塩した。２５０１の蒸留水の添加後にこのレベルに達した。

その溶液は、脱塩後、２０％のアルブミン含量まで濃縮され、滅菌濾過されそし て６０℃で１０時間熱処理するためにビン（１００ｍ／）に導入した。前述の金 属が溶液中に存在する割合を脱塩プロセス前およびビンの熱処理の後に測定した ところ、得られた分析結果を次表４に記す。

このように本発明は、タンパク質に結合された望ましくない多価金属イオンの簡 便な除去方法を提供する。この方法はタンパク質の浄化に一般的に適用でき、本 明細書に記載の例だけに限られない。さらに、特許請求の範囲の範囲内で更なる 改変が可能であるということも理解されよう。例えば、タンパク質を限外濾過に より浄化することもできる。この方法は更なる塩溶液または水の添加が必要なの で前述の方法はどには合理的でない。しかしながら発明の原理は変わらない。

参考文献： １、Ｃｒａｐｐｅｒ　Ｄ、Ｒ，にｆｓｈｎａｎ　Ｓ　Ｓ、　Ｑｕｆｔｔａｔ　Ｓ 、　Ａｌｕｍｉｎｆｕｍ。

ｎｅｕｒｏ−ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ　ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ａｌ ｚｈｅｉｍｅｒ’５ｄｉｓｅａｓｅ、　Ｂｒａｉｎ　Ｌ９７６、９９．６７〜８ ０２、Ｃｒａｐｐｅｒ　Ｄ　Ｒ，Ｑｕｉｔｔａｔ　Ｓ、　Ｋｒ１ｓｈｎａｎ　Ｓ 　Ｓ　ｅｔ　ａｌ。：Ｉｎｔｒａｎｕｅｌｅａｒ　ａｌｕｓｉｒｉｉｕｓ＋　ｃ ｏｎｔｅｎｔ　ｉｎ　Ａｌｚｈｅｉｉｅｒ’５ｄｉｓｅａｓｅ、　ｄｉａｌｙｓ ｆｓ　ｅｎｅｅｐｈａｌｏ−Ａｅｔａ　Ｎｅｕｒｏｐａｔｈ　１９８０゜５０． １９〜２４ ３、Ａｌｆｒｅｙ　Ａ　Ｃ，Ｌｅ　Ｇｅｎｄｒｅ　Ｇ　Ｒ，Ｋａｅｈｒ＋ｙ　ｉ ｔ　Ｄ：　Ｔｂｅｄｉａｌｙｓｉｓ　ｅｎｃｅｐｈａｌ、ｏｐａｔｈｙ　ｓｙｎ ｄｒｏｍｅ、　Ｐｏ５ｓｉｂｉｅ　ａｌｕｍ−ｉｎｉｕｍ　１ｎｔｏｘｔｃａｔ ｉｏｎ、　Ｎ　Ｅｎｇ、ｌ［ｅｄ　１９７６、２９４．１８４〜１８８゜ ４、Ａｌｆｒｅｙ　Ａ　Ｃ，口ｅｇｇ　Ａ、　Ｃｒａｓｗｅｌｌ　Ｉ’：　Ｍｅ ｔａｂｏｌ、ｉｓｍ　ａｎｄｔｏｘｉｅｉｔｙ　ｏｆ　ａｌ、ｕｉｊ、ｎｉｕ＠ ｕｎ　ｒｅｎａｉ　ｆａｉｌｕｒｅ、　Ａｍ　ＩＣ１ｔｎ　Ｎｕｔｒ　１９８０ ．３３．１５０９〜１５１６５、Ｐｅｒ　Ｄ　Ｐ、　Ｇａｊｄｕｓｅｋ　Ｄ　Ｃ ，Ｇａｒｒｕｔｏ　ＲＩ　ｅｔ　ａｌ、　：ＩｎｔｒａｎｅｕｒｏｎａＬ　ａｌ ｕｍｉｒｉｉｕｍ　ａｅｃｕｍｕｌａｔｆｎｎ　ｆｎ　ａｉｙｏｔｈ−ｒｏｐｔ ｅ　１ａｔｅｒａｌ　５ｃｌｅｒｏｓｉｓ　ａｒｉｄ　ｒ’ａｒｋｉｎｓｏｎ− ｄｅｍｅｎｔｉａｏｆ　Ｇｕａｍ、　５ｅｆｅｎｅｅ　１９８２．２１７．１０ ５３〜１０５５６、ｌ［ａｙ　Ｊ　Ｃ，Ｒａ１ｎｓ　Ｔ　Ｃ，Ｍａｉｅｎｔｂａ ｌ　Ｆ　Ｊ　ｅｔ　ａｔ、　：　Ａｓｕｒｖｅｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｅｏｎｅｅｒ ＋ｔｒａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｅｌｅｖｅｒ＋　ｍｅｔａｆｆｓ　ｔｒ＋ｖａｃｅ ｉｒ＋ｓ、　ａｌｌｅｒｇｅｎｉｅ　ｅｘｔｒａｃｔｓ、ｔｏｘｏｉｄｓ、ｂｌ ｏｏｄ。

ｂｌｏｏｄ　ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ、　ａｎｄ　ｏｔｈｅｒ　ｂｕｏｌｏｇｊ 、ｅａｌ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ。

Ｊ　Ｂｉｏｌ　５ｔａｎｄ　１９８６．１４．３６３〜３７５濃縮液 補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成３年１２月２６日

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. １．結合した多価金属イオンを一価金属イオンと交換することにより多価金属イ オンを遊離させ、次いで該多価金属イオンを除去することを特徴とする、結合し た多価金属イオンからのタンパク質の浄化方法。
2. ２．多価金属イオンが結合した有機化合物を一価金属イオン含有溶液に対する透 析濾過プロセスに付すことにより該多価金属イオンを遊離させそして除去するこ とを特徴とする請求項１記載の方法。
3. ３．多価金属イオンを一価金属イオンで交換した後、有機化合物を金属イオンを 本質的に含まない溶液に対する透析濾過に改めて付すことを特徴とする請求項２ 記載の方法。
4. ４．多価金属イオンが結合した有機化合物を一価金属イオンの溶液中でゲル濾過 プロセスに付すことにより該多価金属イオンを遊離させそして除去することを特 徴とする請求項１記載の方法。
5. ５．多価金属イオンを一価金属イオンで交換した後、有機化合物を金属イオンを 本質的に含まない溶液中でのゲル濾過プロセスに改めて付すことを特徴とする請 求項４記載の方法。
6. ６．多価金属イオンがアルミニウム、鉄および鉛という金属の１種以上より成る ことを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
7. ７．多価金属イオンを遊離させそして除去した後に一価金属イオンを遊離させそ して除去することを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
8. ８．一価金属イオンがアルカリ金属イオンまたはアンモニウムイオンより成るこ とを特徴とする請求項７記載の方法。
9. ９．一価金属イオンがナトリウム、カリウムまたはアンモニウムイオンより成る ことを特徴とする請求項８記載の方法。
10. １０．一価金属イオンを約０．１５Ｍ〜飽和含量の範囲の含量を有する水性溶液 の形で用いることを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
11. １１．タンパク質がアルブミンまたはガンマグロブリンであることを特徴とする 請求項１記載の方法。
12. １２．タンパク質がアルブミンであり、そして多価イオンがアルミニウムイオン である請求項１記載の方法。