JPS6411638B2

JPS6411638B2 -

Info

Publication number: JPS6411638B2
Application number: JP13917285A
Authority: JP
Inventors: Kazuya Yoshida; Mineo Hasegawa
Original assignee: QP Corp
Current assignee: Kewpie Corp
Priority date: 1985-06-27
Filing date: 1985-06-27
Publication date: 1989-02-27
Also published as: JPS62500A

Description

【発明の詳細な説明】

〔産業上の利用分野〕本発明はリゾチームとアビジンを吸着させた陽
イオン交換樹脂からアビジンを能率よく溶出させ
るアビジンの溶出方法に関する。〔従来技術〕アビジンは動物性蛋白質中に含まれている分子
量約68000の塩基性蛋白であり、動物原料の中で
も際立つて多く含まれているとされている卵白で
さえ、卵白液に対して0.005％程度の微量にしが
含まれていない。ところで、卵白から抽出・精製して得られる純
度の高いアビジンは、ビタミンの一種であるビオ
チンと強い親和性を示すため、最近この性質を活
用し、生物工学や医療の分野で、免疫抗体のクロ
ーンの検出、ガンのミサイル療法、病源の検出薬
等に使用され、需要が増大しつつある。従来、卵白からアビジンを抽出するには、ま
ず、卵白液にイオン交換体を加えて撹拌し、この
交換体にリゾチームとアビジンを吸着させ、次
に、この交換体をカラムに詰め、カラム内に濃度
の異なる塩溶液を７段階程度に分けて加え、カラ
ム内の交換体よりアビジンを特異的に溶出させ、
最後に、溶出したアビジンを溶液から分離する方
法が採用されていた。しかしながら、上記従来法によると、アビジン
の溶出工程において、イ濃度の異なる塩溶液をカラム内に加えると
き、各段階毎に塩濃度に対するアビジンの溶出
量を吸光度計等で測定しなければならず、ロまた、カラム方式であるから、一度に少量し
かアビジンを溶出できないばかりか、溶出に時
間がかかり、ハさらには、アビジンの溶出に、塩溶液を多量
に使用しなければならない、という問題があつた。つまり、従来法によると、人手・時間及び処理
剤がかかる割には、アビジンが少量しか得られ
ず、したがつてアビジンを低コストで供給できな
いという問題があつた。〔発明が解決しようとする問題点〕ところで、アビジンの需要が増大しつつある今
日においては、アビジンを低コストで供給するこ
とが急務であり、そのためには、アビジンを能率
よく溶出する技術の確立が望まれている。そこで、本発明者等はそのような技術を開発す
べく研究を重ねた結果、本発明を完成したもので
ある。〔問題点を解決するための手段〕本発明は、アビジンの溶出方法に関し、リゾチ
ームとアビジンを吸着させた陽イオン交換樹脂
を、まず、濃度1.0〜3.0％の中性塩水溶液中に浸
漬処理した後、水溶液を除去し、次に、この吸着
樹脂を濃度3.1％以上の中性塩水溶液中に浸漬処
理することを特徴とするものである。本発明の実施に当つては、まず、卵白液・牛乳
等のリゾチームとアビジンを含む原料を用意す
る。これらの原料は、次工程で行なう樹脂による
吸着を容易にするため、予め、ホモゲナイズし、
また、PHを6.5〜7.5に調整しておくことが望まし
い。次に、上記原料に約２〜３割の容量の陽イオン
交換樹脂を添加し、ゆつくりと数時間（約１〜８
時間）撹拌して原料中のリゾチームとアビジンを
樹脂に吸着させる。本発明で使用する陽イオン交換樹脂としては、
ロームアンドハースト社製の「アンバーライト
IRC−50」・「アンバーライトIRC−84」・「アンバ
ーライトCG−50」、ダイヤモンドシヤムロツクケ
ミカル社製の「デユオライトCS−101」・「デユオ
ライトCC−３」・「デユオライトES−80」、ダウ
ケミカル社製の「ダウエツクスCCK−２」、バイ
エル社製「レバチツドCNP」・「レバチツドCNP
−80」、又は三菱化成工業(株)製の「ダイヤイオン
WK−10」・「ダイヤイオンWK−20」・「ダイヤイ
オンWK−11」等の弱酸性イオン交換樹脂が望ま
しい。次に、上記のようにして得られたリゾチームと
アビジンを吸着した樹脂を原料から取り出し、水
洗して吸着樹脂に付着した原料を洗い落した後、
この吸着樹脂を濃度1.0〜3.0％の中性塩溶液中に
浸漬処理する。中性塩としては、塩化ナトリウム（食塩）・塩
化カリウム・塩化アンモニウム等の水に溶解させ
たときその水溶液のPHが中性付近になるものを使
用する。この処理により、樹脂に吸着させたリゾチーム
とアビジンのうち、リゾチームが吸着樹脂から水
溶液中に溶出する。水溶液の塩濃度が3.0％を越
えると、吸着樹脂よりリゾチームと一緒にアビジ
ンも溶出してしまい、リゾチームとアビジンを分
画することができず、また、1.0％未満であると、
吸着樹脂よりリゾチームを溶出することができな
いので好ましくない。リゾチームの溶出を短時間
で完全に行なうには、水溶液の中性塩濃度を2.0
〜3.0％にすることがましい。吸着樹脂の処理は、上記濃度の中性塩水溶液中
で行なえばよいが、その操作は容量比で中性塩水
溶液100部に対して吸着樹脂10〜100部程度の割合
で混合するのが作業上能率がよい。また、リゾチ
ームの溶出を効率よく行なうには、30r・ｐ・ｍ
程度の速度で水溶液と樹脂を10〜60分間撹拌する
とよい。次に、上記処理が終了した吸着樹脂から中性塩
水溶液を抜き取り、この吸着樹脂を濃度3.1％以
上の中性塩水溶液中に浸漬処理し、吸着樹脂に吸
着させているアビジンを水溶液中に溶出させる。中性塩としては、前記リゾチーム等の溶出に用
いたものと同じものを使用すればよい。この処理により、樹脂に吸着させているアビジ
ンが水溶液中に溶出する。この処理工程で使用する水溶液の中性塩の濃度
は、3.1％以上であること、好ましくは、4.0〜6.0
％であることが望ましい。塩濃度が3.1％以上の
水溶液であれば、後の試験例にも示すように吸着
樹脂より水溶液中にアビジンを溶出させることが
できる。しかし、その濃度が３％台であると溶出
に時間がかかり、また、6.0％を越えると中性塩
の無駄使いとなるので望ましくない。吸着樹脂からのアビジンの溶出は、上記濃度の
中性塩水溶液中で処理すればよいが、この操作は
容積比で中性塩水溶液100部に対して、吸着樹脂
50〜200部程度の割合で混合して行なうことが望
ましい。尚、水溶液の使用量を多くし過ぎると、
水溶液に溶解したアビジンの濃度が低くなつてし
まい、水溶液からのアビジンの回収作業が難しく
なり、望ましくない。また、この溶出工程を効率
よく行なうには、前記リゾチーム溶出工程と同様
に、30r・ｐ・ｍ程度の速度で水溶液と吸着樹脂
を10〜60分間程度撹拌するとよい。最後に、上記樹脂が含まれている中性塩水溶液
をフイルター等の過装置にて過して液を
得、この液を公知の方法で処理してアビジンの
結晶を析出させ、この結晶を回収・脱塩すれば粗
製のアビジンを得ることができる。尚、このようにして得られる粗製のアビジンに
は、コンアルブミン等の不純物が混入しているの
で、純度の高いアビジンに仕上げるには、再結晶
化法や膜過法等により粗製のアビジンを精製す
るとよい。また、本発明において％は全て重量％をいう。〔実施例〕実施例１Ａアビジン・リゾチームリゾチーム吸着樹脂の
調整クエン酸を添加しPHを7.0に調整した卵白液
10Kgをホモゲナイズした後、この卵白液に陽イ
オン交換樹脂（三菱化成工業(株)製・商品名「ダ
イヤイオンWK−10」を2.5添加し、低速で
２時間撹拌した。次いで、卵白液より樹脂を別し、得られた
樹脂に清水10Kgを加えて樹脂を３回洗浄し、リ
ゾチームとアビジンが吸着している樹脂を得
た。Ｂリゾチームの溶出上記のようにして得られた吸着樹脂に、3.0
％食塩水６を添加し、30r・ｐ・ｍの速度で
30分間撹拌して、樹脂に吸着しているリゾチー
ムを食塩水中に溶出させた。次いで、食塩水から吸着樹脂を別し、得ら
れた樹脂に清水10Kgを加えて樹脂を３回洗浄
し、アビジンが吸着している樹脂を得た。Ｃアビジンの溶出上記のようにして得られた吸着樹脂に、5.0
％食塩水２を添加し、30r・ｐ・ｍの速度で
30分間撹拌して、樹脂に吸着しているアビジン
を食塩水中に溶出させた。Ｄ溶出アビジンの分離・精製次いで、上記樹脂が含まれている食塩水を80
メツシユのストレーナーにて過し、さらにス
トレーナーに別された樹脂を５％食塩水0.5
で押し出し過をして、液を得た。次いで、得られた液に硫安を添加して
3.5M硫安溶液となるように調整し、さらに、
この溶液に1Nの塩酸を添加して溶液のPHを4.0
とし、低速で８時間撹拌して溶液中のアビジン
を塩析させた。そして、この溶液を遠心分離し
て粗アビジンの結晶を得た。最後に、得られた粗アビジンの結晶を５％食
塩水２に溶解させ、次いで、この食塩水に硫
安を添加して3.5M硫安溶液となるように調整
し、さらに、この溶液に1Nの塩酸を添加して
溶液のPHを5.0とし、低速で８時間撹拌して溶
液中にアビジンを塩析させた。そして、この溶
液を遠心分離してアビジンの結晶を回収し、結
晶付着の塩類を水洗して脱塩し、結晶を乾燥し
たところ精製アビジン200mg（収率0.002％）を
得た。実施例２実施例１において、Ｂのリゾチーム溶出工程で
使用する食塩水の濃度を2.0％とし、Ｃのアビジ
ン溶出工程で使用する食塩水の濃度を4.0％とし
たほかは、実施例１と同じ方法でアビジンを抽
出・精製し、精製アビジン300mg（収率0.003％）
を得た。実施例３実施例１において、Ｂのリゾチーム溶出工程で
使用する食塩水の濃度を2.0％とし、Ｃのアビジ
ン溶出工程で使用する食塩水の濃度を3.2％とし
たほかは、実施例１と同じ方法でアビジンを抽
出・精製し、精製アビジン100mg（収率0.001％）
を得た。実施例４実施例１において、Ｂのリゾチーム溶出工程で
使用する食塩水の濃度を1.0％とし、Ｃのアビジ
ン溶出工程で使用する食塩水の濃度を3.1％とし
たほかは、実施例１と同じ方法でアビジンを抽
出・精製し、精製アビジン130mg（収率0.0013％）
を得た。実施例５実施例１において、Ｂのリゾチーム溶出工程で
使用する食塩水の濃度を3.0％とし、Ｃのアビジ
ン溶出工程で使用する食塩水の濃度を3.1％とし
たほかは、実施例１と同じ方法でアビジンを抽
出・精製し、精製アビジン100mg（収率0.001％）
を得た。尚、比較として、上記方法において実施例１の
Ｃのアビジン溶出工程で使用する食塩水の濃度を
3.0％として以下同様に処理した場合においては、
アビジンは全く得られなかつた。〔作用〕以下、本発明の作用を試験例で立証すると次の
とおりである。試験例アビジン（BELOVO社製）とリゾチーム（キ
ユーピー(株)製）とをそれぞれ10mgづつ用意し、こ
れを20mlの蒸留水に添加して溶解させた。次に、陽イオン交換樹脂（三菱化成工業(株)製・
商品名「ダイヤイオンWK−10」）15mlに上記ア
ビジンとリゾチームの溶解液を加え、30分間撹拌
して樹脂にアビジンとリゾチームを吸着させた。次に、上記吸着樹脂を溶液から取り出し、水洗
した後、得られた吸着樹脂を10等分して10個のサ
ンプルを得た。上記サンプルを各別に表−１に示す濃度の食塩
水５mlにそれぞれ添加し、30分間撹拌した。得られた溶液について、それぞれ次の三つの定
性試験を行なつたところ、表−１の結果が得られ
た。試験Ａ…Lowry法により、リゾチームの溶存を
目視にて確認した。試験Ｂ……４−ヒドロキシアゾベンゼン−2′−カ
ルボン酸を添加し、アビジンの溶存を目視にて
確認した。試験Ｃ…試験Ｂで用いたサンプルを分光光度計に
て測定（500nｍ）した吸光度であつて、数値
が大きい程アビジンの溶出が大きいことを示
す。

〔発明の効果〕

以上述べたように本発明によれば、リゾチーム
とアビジンを吸着させた陽イオン交換樹脂を濃度
の異なる中性塩溶液中で二度の処理をするだけで
樹脂に吸着させたアビジンを能率よく溶出させる
ことができる。したがつて、本発明をアビジンの
抽出工程に適用すればアビジンを工業的規模で安
価に生産することができる。尚、1.0〜3.0％の中性塩水溶液中に溶出させた
リゾチームは、公知の方法で回収することがで
き、このようにすれば、アビジンばかりでなくリ
ゾチームも得られ、アビジンの生産コストを下げ
るのに寄与することができる。

Claims

【特許請求の範囲】

１リゾチームとアビジンを吸着させた陽イオン
交換樹脂を、まず、濃度1.0〜3.0％の中性塩水溶
液中に浸漬処理した後、水溶液を除去し、次に、
この吸着樹脂を濃度3.1％以上の中性塩水溶液中
に浸漬処理することを特徴とするアビジンの溶出
方法。