JPH07100718B2 - アビジンの製造方法 - Google Patents
アビジンの製造方法Info
- Publication number
- JPH07100718B2 JPH07100718B2 JP5311487A JP5311487A JPH07100718B2 JP H07100718 B2 JPH07100718 B2 JP H07100718B2 JP 5311487 A JP5311487 A JP 5311487A JP 5311487 A JP5311487 A JP 5311487A JP H07100718 B2 JPH07100718 B2 JP H07100718B2
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- JP
- Japan
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- avidin
- egg white
- molecular weight
- ion
- dextran
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は卵白アビジンの製造方法に関し，更に詳しくは
卵白中のリゾチームやアビジン等の塩基性蛋白質を吸着
させた陽イオン交換樹脂から高純度のアビジンを効率的
に製造する方法に関するものである。
卵白中のリゾチームやアビジン等の塩基性蛋白質を吸着
させた陽イオン交換樹脂から高純度のアビジンを効率的
に製造する方法に関するものである。
ここでいう卵白とは生卵白，乾燥卵白，濃縮卵白，冷凍
卵白等をいう。
卵白等をいう。
卵白アビジンは，ニワトリ卵白中に0.003％程度含まれ
る。分子量6,800の塩基性糖蛋白質（サブユニット）が
４分子結合した複合体（分子量27,000）として卵白中に
存在している物質であるが，本物質はピチオンと強固に
結合する性質を有することから，近年分子生物学の分野
における架橋試薬として広く利用され，特に酵素免疫法
における架橋試薬として種々の診断薬に使用され需要が
増大しつつある。
る。分子量6,800の塩基性糖蛋白質（サブユニット）が
４分子結合した複合体（分子量27,000）として卵白中に
存在している物質であるが，本物質はピチオンと強固に
結合する性質を有することから，近年分子生物学の分野
における架橋試薬として広く利用され，特に酵素免疫法
における架橋試薬として種々の診断薬に使用され需要が
増大しつつある。
（従来技術） 卵白アビジンはこのように卵白中の微量成分であるた
め，精製工程で卵白成分中のアルブミン類やオボムコイ
ド等の他の蛋白質成分の夾雑が生じやすく高純度のアビ
ジンを得ることは難かしい。従って，夾雑蛋白質を除く
ため塩濃度勾配溶出という工業的な製造法としては不適
当なクロマトグラフィー法を行っている。
め，精製工程で卵白成分中のアルブミン類やオボムコイ
ド等の他の蛋白質成分の夾雑が生じやすく高純度のアビ
ジンを得ることは難かしい。従って，夾雑蛋白質を除く
ため塩濃度勾配溶出という工業的な製造法としては不適
当なクロマトグラフィー法を行っている。
すなわちこの溶出方法は，まず卵白液の塩基性蛋白質を
吸着し，ついで無機塩を用いた濃度勾配法によるクロマ
トグラフィーでアビジン画分を抽出し，これを濃縮後共
存するリゾチームを結晶化させて除去し，更にCM−セル
ローズによるクロマトグラムを再度行い，同じく塩濃度
勾配法によってアビジン画分を溶出して，これを濃縮後
硫安による結晶化を行い分離する方法が行われている。
吸着し，ついで無機塩を用いた濃度勾配法によるクロマ
トグラフィーでアビジン画分を抽出し，これを濃縮後共
存するリゾチームを結晶化させて除去し，更にCM−セル
ローズによるクロマトグラムを再度行い，同じく塩濃度
勾配法によってアビジン画分を溶出して，これを濃縮後
硫安による結晶化を行い分離する方法が行われている。
（発明が解決しようとする問題点） しかしながら前述の従来法においては，一度に少量しか
アビジンを溶出できない上に，溶出に時間と手間を要す
るため，工業的大量生産する製造法として不適当である
という問題があった。
アビジンを溶出できない上に，溶出に時間と手間を要す
るため，工業的大量生産する製造法として不適当である
という問題があった。
また，アビジンは現在市販されているが,93％程度の純
度のものしか得られず，これらは前述したような医薬的
用途にむかないのが現状である。
度のものしか得られず，これらは前述したような医薬的
用途にむかないのが現状である。
（問題点を解決するための手段） そこでアビジンの需要が増大しつつある今日において，
アビジンを高純度でかつ工業的に製造する技術の確立が
望まれていることから，本発明者等は鋭意研究を重ねた
結果，卵白中の塩基性蛋白質に低分子吸着用イオン交換
デキストランに吸着させると，リゾチームが吸着される
とともに，驚くべきことに高分子のアビジンをも吸着
し，夾雑するアルブミン類やオボムコイドなどを容易に
除去しうることを見い出し，高純度のアビジンを効率よ
く容易に製造する本発明を完成するに至った。
アビジンを高純度でかつ工業的に製造する技術の確立が
望まれていることから，本発明者等は鋭意研究を重ねた
結果，卵白中の塩基性蛋白質に低分子吸着用イオン交換
デキストランに吸着させると，リゾチームが吸着される
とともに，驚くべきことに高分子のアビジンをも吸着
し，夾雑するアルブミン類やオボムコイドなどを容易に
除去しうることを見い出し，高純度のアビジンを効率よ
く容易に製造する本発明を完成するに至った。
すなわち，本発明は卵白中の塩基性蛋白質に低分子吸着
用イオン交換デキストランを使用して，アビジンを吸着
させて分離することを特徴とするアビジンの製造方法に
関する。
用イオン交換デキストランを使用して，アビジンを吸着
させて分離することを特徴とするアビジンの製造方法に
関する。
本発明の実施にあたっては，まず生卵白液，乾燥卵白，
濃縮卵白，冷凍卵白のリゾチーム，アビジン等の塩基性
蛋白を含む原料を用意し，濃縮卵白，乾燥卵白は適宜水
で稀釈するか，あるいは水戻しすることにより適当な固
形分濃度に調整すると共に，次に行う樹脂による吸着を
容易にするため，予めホモゲナイズし，そのpHを6.5〜
7.5に調整しておくことが望ましい。
濃縮卵白，冷凍卵白のリゾチーム，アビジン等の塩基性
蛋白を含む原料を用意し，濃縮卵白，乾燥卵白は適宜水
で稀釈するか，あるいは水戻しすることにより適当な固
形分濃度に調整すると共に，次に行う樹脂による吸着を
容易にするため，予めホモゲナイズし，そのpHを6.5〜
7.5に調整しておくことが望ましい。
次に上記原料に弱酸性陽イオン交換樹脂を添加してリゾ
チームアビジン等の塩基性蛋白を吸着させる。
チームアビジン等の塩基性蛋白を吸着させる。
本発明で使用する弱酸性陽イオン交換樹脂としては，デ
ュオライト−Ｃ−464（ダイヤモンドシャロックケミカ
ル社製），アンバーライトIRC−50（ロームアンドハー
スター社製），ダウエックスMWC−１（ダウケミカル社
製），ダイアイオンWK−10（三菱化成工業社製）などの
弱酸性陽イオン交換樹脂が使用できる。
ュオライト−Ｃ−464（ダイヤモンドシャロックケミカ
ル社製），アンバーライトIRC−50（ロームアンドハー
スター社製），ダウエックスMWC−１（ダウケミカル社
製），ダイアイオンWK−10（三菱化成工業社製）などの
弱酸性陽イオン交換樹脂が使用できる。
次に吸着させた弱酸性陽イオン交換樹脂を水洗して洗浄
した後，塩溶液で脱着する。
した後，塩溶液で脱着する。
塩溶液としては，塩化ナトリウム，塩化カリウム，硫酸
ナトリウム等強酸・強塩基の塩の水に溶解した時pH6〜
8,濃度２〜６％付近のものを使用する。
ナトリウム等強酸・強塩基の塩の水に溶解した時pH6〜
8,濃度２〜６％付近のものを使用する。
この脱着処理により樹脂に吸着されたリゾチーム・アビ
ジン等の塩基性蛋白が塩溶液中に溶出するが，アルブミ
ン類やオボムコイドなどの夾雑蛋白も共存して溶出す
る。そこで電導度20ms/cm以下,pH6.5〜7.5の条件下で低
分子吸着用イオン交換デキストランに吸着させ，同条件
下で充分に洗浄することにより共存するアルブミン類や
オボムコイドなどが充分に除去される。
ジン等の塩基性蛋白が塩溶液中に溶出するが，アルブミ
ン類やオボムコイドなどの夾雑蛋白も共存して溶出す
る。そこで電導度20ms/cm以下,pH6.5〜7.5の条件下で低
分子吸着用イオン交換デキストランに吸着させ，同条件
下で充分に洗浄することにより共存するアルブミン類や
オボムコイドなどが充分に除去される。
低分子吸着用イオン交換デキストランは，分子量が10,0
00程度の低分子量蛋白質の吸着剤として使用されている
架橋デキストランで，例えばCM−セファデックスC.25
（ファルマシア社製）等を用いる。
00程度の低分子量蛋白質の吸着剤として使用されている
架橋デキストランで，例えばCM−セファデックスC.25
（ファルマシア社製）等を用いる。
この吸着樹脂の脱着処理は,pH6〜8,濃度２〜６％付近の
塩溶液，例えば塩化ナトリウム，塩化カリウム，硫酸ナ
トリウム等の強酸・強塩基の塩溶液で行い，次に該塩溶
液に夾雑するリゾチームを食塩による結晶化法や硫安分
画等の塩折あるいはチキンや，非イオン交換性の吸着剤
〔例えばアンバーライトXAD−７（オルガノ社製）〕等
による吸着によって除去する。
塩溶液，例えば塩化ナトリウム，塩化カリウム，硫酸ナ
トリウム等の強酸・強塩基の塩溶液で行い，次に該塩溶
液に夾雑するリゾチームを食塩による結晶化法や硫安分
画等の塩折あるいはチキンや，非イオン交換性の吸着剤
〔例えばアンバーライトXAD−７（オルガノ社製）〕等
による吸着によって除去する。
硫安分画の場合，硫安濃度30〜80％飽和，好ましくは50
〜75％飽和で行い，ここで得られる画分から夾雑アルブ
ミン類やオボムコイド，更にはリゾチームなどを充分に
とりのぞいた高純度のアビジンが得られる。
〜75％飽和で行い，ここで得られる画分から夾雑アルブ
ミン類やオボムコイド，更にはリゾチームなどを充分に
とりのぞいた高純度のアビジンが得られる。
実施例１ 生卵白１をホモジナイズ後2N−HClを加えpH6.5とす
る。次に0.1Mリン酸緩衝液（pH6.5）で緩衝化したデュ
オライトＣ−464 160gr（wet）（ダイヤモンドシャロッ
クケミカル社製）に接触せしめアビジンを吸着させた
後，水により充分洗浄して,3％NaCl溶液150mlで溶出し
アビジンを含む溶出液150mlが得られた。
る。次に0.1Mリン酸緩衝液（pH6.5）で緩衝化したデュ
オライトＣ−464 160gr（wet）（ダイヤモンドシャロッ
クケミカル社製）に接触せしめアビジンを吸着させた
後，水により充分洗浄して,3％NaCl溶液150mlで溶出し
アビジンを含む溶出液150mlが得られた。
この溶出液を水で希釈し電導度12ms/cm,pH6.5にしてか
らCM−セェファデックスC.25 5gr（dry）（ファルマシ
ア社製）に接触させた。電導度12ms/cmのNaCl溶液（pH
6.5）によって充分に洗浄し，次に３％NaCl溶液10mlで
溶出を行う。得られる溶出液をpH3.5に調整し,NaClを５
％となるように加え４℃で放置し夾雑するリゾチームを
結晶化除去し，アビジン液を得た。このアビジン液に硫
安濃度50％飽和になるよう硫安を加え共存リゾチームを
除去後，硫安75％飽和に加えた。得られる画分を別
し，溶解後セロファン膜で透析・脱塩後，凍結乾燥にて
アビジン末300mgを得た。（収率10％） 実施例２ 生卵白10lをホモジナイズ後,2N−HClを加えpH6.5とし，
次に0.1Mリン酸緩衝液（pH6.5）で緩衝化したデュオラ
イトＣ−464 1,600gr（wet）（ダイヤモンドシャロック
ケミカル社製）に接触せしめアビジンを吸着させた。水
により充分に洗浄し,3％NaCl溶液1,500mlで溶出し，ア
ビジンを含む溶出液1,500mlが得られた。
らCM−セェファデックスC.25 5gr（dry）（ファルマシ
ア社製）に接触させた。電導度12ms/cmのNaCl溶液（pH
6.5）によって充分に洗浄し，次に３％NaCl溶液10mlで
溶出を行う。得られる溶出液をpH3.5に調整し,NaClを５
％となるように加え４℃で放置し夾雑するリゾチームを
結晶化除去し，アビジン液を得た。このアビジン液に硫
安濃度50％飽和になるよう硫安を加え共存リゾチームを
除去後，硫安75％飽和に加えた。得られる画分を別
し，溶解後セロファン膜で透析・脱塩後，凍結乾燥にて
アビジン末300mgを得た。（収率10％） 実施例２ 生卵白10lをホモジナイズ後,2N−HClを加えpH6.5とし，
次に0.1Mリン酸緩衝液（pH6.5）で緩衝化したデュオラ
イトＣ−464 1,600gr（wet）（ダイヤモンドシャロック
ケミカル社製）に接触せしめアビジンを吸着させた。水
により充分に洗浄し,3％NaCl溶液1,500mlで溶出し，ア
ビジンを含む溶出液1,500mlが得られた。
この溶出液を限外過で脱塩し，電導度5ms/cm,pH6.5に
してからCM−セェファデックスC.25 35gr（dry）（ファ
ルマシア社製）に接触させた。次に電導度5ms/cmのNaCl
溶液（pH6.5）により充分に洗浄し,3％NaCl溶液100mlで
溶出を行う。得られる溶出液をpH3.5に調整しNaClを５
％となるように加え４℃に放置し夾雑するリゾチームを
結晶しアビジン液を得る。
してからCM−セェファデックスC.25 35gr（dry）（ファ
ルマシア社製）に接触させた。次に電導度5ms/cmのNaCl
溶液（pH6.5）により充分に洗浄し,3％NaCl溶液100mlで
溶出を行う。得られる溶出液をpH3.5に調整しNaClを５
％となるように加え４℃に放置し夾雑するリゾチームを
結晶しアビジン液を得る。
このアビジン液に硫安濃度50％飽和になるよう硫安を加
え沈殿除去後さらに硫安75％飽和になるよう加えて分画
を行った。得られる画分を別し，水で溶解し，セロフ
ァン膜で透析・脱塩後凍結乾燥にてアビジン末2.5grを
得た。（収率8.3％） （純度試験） 実施例１で得られたアビジンを次の条件によるゲル浸透
−高速液体クロマトグラフィーによって分析した結果純
度98.7％であった。
え沈殿除去後さらに硫安75％飽和になるよう加えて分画
を行った。得られる画分を別し，水で溶解し，セロフ
ァン膜で透析・脱塩後凍結乾燥にてアビジン末2.5grを
得た。（収率8.3％） （純度試験） 実施例１で得られたアビジンを次の条件によるゲル浸透
−高速液体クロマトグラフィーによって分析した結果純
度98.7％であった。
ゲル浸透−高速液体クロマトグラフィー（GPC−HPLC）
の条件 カラム:TSKゲルG3,000SW,75cmID×60cm 溶媒:0.1M燐酸緩衝液,0.2M NaCl 流速:1.0ml/分 検出波長:275nm （効果） 以上のごとく，卵白中のリゾチーム・アビジン等の塩基
性蛋白質を低分子吸着用イオン交換デキストランに吸着
させる処理を一度だけ行うだけで，効率よくしかも高純
度のアビジンを溶出することができるもので，工業的製
造を容易にした。
の条件 カラム:TSKゲルG3,000SW,75cmID×60cm 溶媒:0.1M燐酸緩衝液,0.2M NaCl 流速:1.0ml/分 検出波長:275nm （効果） 以上のごとく，卵白中のリゾチーム・アビジン等の塩基
性蛋白質を低分子吸着用イオン交換デキストランに吸着
させる処理を一度だけ行うだけで，効率よくしかも高純
度のアビジンを溶出することができるもので，工業的製
造を容易にした。
Claims (4)
- 【請求項１】卵白中の塩基性蛋白質に低分子吸着用イオ
ン交換デキストランを使用してアビジンを吸着させて，
分離することを特徴とするアビジンの製造方法。 - 【請求項２】低分子吸着用イオン交換デキストランは，
分子量10,000程度の低分子量蛋白質を吸着する架橋デキ
ストランあることを特徴とする特許請求の範囲第１項記
載のアビジンの製造方法。 - 【請求項３】低分子吸着用イオン交換デキストランから
吸着したアビジンを脱着するにあたり３％〜５％の中性
塩溶液を使用することを特徴とする特許請求の範囲第１
項記載のアビジンの製造方法。 - 【請求項４】低分子吸着用イオン交換デキストランから
アビジンを脱着させた後，塩折またはおよび吸着によっ
て，アビジンを分離することを特徴とする特許請求の範
囲第１項記載のアビジンの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5311487A JPH07100718B2 (ja) | 1987-03-10 | 1987-03-10 | アビジンの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5311487A JPH07100718B2 (ja) | 1987-03-10 | 1987-03-10 | アビジンの製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63222200A JPS63222200A (ja) | 1988-09-16 |
| JPH07100718B2 true JPH07100718B2 (ja) | 1995-11-01 |
Family
ID=12933771
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5311487A Expired - Lifetime JPH07100718B2 (ja) | 1987-03-10 | 1987-03-10 | アビジンの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07100718B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1283072C (en) * | 1986-12-01 | 1991-04-16 | Timothy Durance | Process for the isolation and separation of lysozyme and avidin from eggwhite |
| JP2006515559A (ja) | 2002-05-23 | 2006-06-01 | インディアン インスティチュート オブ テクノロジー | 糖タンパク質であるアビジンを単離および精製するプロセス |
-
1987
- 1987-03-10 JP JP5311487A patent/JPH07100718B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS63222200A (ja) | 1988-09-16 |
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