JPH0469160B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、ガングリオシドを濃縮しかつ精製す
る方法に関するものである。

ガングリオシドは人及び動物の神経系組織、特
に、脳に多く含まれている糖脂質の１種で、その
構成成分の一つであるシアル酸の結合数及び結合
位置によつて多数の分子種があり、ガングリオシ
ドとはそれらの総称である。

近年、ガングリオシドの生体内での作用の解明
が進歩しており、また医薬品として中枢神経系お
よび末梢神経系の神経刺激伝達障害の治療に利用
されている。

従来技術 従来からガングリオシドの抽出・精製方法は種
種研究されている。例えば、Svennerholmらの
方法（Biochim.Biophys.Acta 617巻（1980）97
−109頁）によれば、組織からクロロホルム、メ
タノール及び水の混合溶液によつて抽出し、フオ
ルチの分配（J.Folch、J.Biol.Chem、，226巻
（1957）497−509）によつてガングリオシドを水
性溶液として分解し、消泡剤を添加しながら蒸発
乾固し、再度、クロロホルム、メタノール及び水
の混合溶液に溶解し、不溶物を除去して蒸発乾固
し、更に、これを水に溶解し透析して蒸発乾固す
ることによりガングリオシドを精製している。ま
た、医薬品に応用する目的で別の抽出法が特許出
願されている。（フイデイーア、ソシエタ、ペル、
アチオニ、特開昭52−34912）この方法では、動
物の脳組織からガングリオシドをテトラヒドロフ
ランにより抽出し、イオン交換カラムクロマトグ
ラフイーで精製し、水酸化バリウムで沈澱として
分離し、これを塩酸水溶液に溶解して透析したの
ち蒸発乾固し、フオルチの分配により水性溶液と
して再度透析し凍結乾燥して製品としている。

更に、このガングリオシドを各ガングリオシド
分子種に分離・精製するためにはNagaiらの方法
（Biochim.Biophys.Acta、528巻（1978）257−
267）が広く用いられている。すなわち、陰イオ
ン交換樹脂によるイオン交換カラムクロマトグラ
フイーでシアル酸の結合数により分画し、それぞ
れの画分を蒸発乾固し、蒸溜水に溶解し透析を行
い脱塩する。これをシリカゲルカラムクロマトグ
ラフイーで精製して単一分子種としている。

解決しようとする問題点 この様に非常に煩雑な方法によつて抽出・精製
されているガングリオシドを、治療薬として利用
するために大量に調製することは、特に、ガング
リオシドを含んだ大量の水性溶液を、発泡を抑え
ながら蒸発乾固すること、あるいはイオン交換カ
ラムより溶出するために用いられた塩類を除去す
るために透析することに、多大の時間と費用を要
し、困難であつた。

問題解決の手段 本発明者らは、大量のガングリオシドを効率的
に濃縮、精製する方法について鋭意研究を重ねた
結果、溶液中のガングリオシドが適当な条件下で
活性炭に接触することにより高い割合で活性炭に
吸着されることを見い出して、本発明を完成し
た。即ち、ガングリオシド又は単一のガングリオ
シド分子種を溶解または懸濁した水、メタノー
ル、エタノール、テトラヒドロフランおよびクロ
ロホルムあるいはこれらの２種以上の混合溶液が
原料として用いられる。また、この溶液は塩類を
含んでいてもかまわない。例えば、前述したフオ
ルチの分配によつて生じたガングリオシドの水性
溶液（水、メタノールの混合液に少量のクロロホ
ルムを含む）、あるいはNagaiらの方法でイオン
交換カラムクロマトグラフイーで分画したそれぞ
れのガングリオシド分子種の画分（メタノール溶
液で酢酸アンモニウムを含む）などが用いられ
る。特に、水性の溶液において有用である。使用
する活性炭は特に制限は無く、通常の脱色炭、粒
状活性炭が利用できる。クロマトグラフ用粒状活
性炭は特に好都合である。これらの活性炭はその
まま使用してもよいが、常法により酸、アルカリ
洗滌して活性化してもよい。アンニア水で洗滌し
次いで水、メタノールで洗滌して使用することが
好ましい。活性炭の使用量は溶解しているガング
リオシドに対して10倍ないし100倍量（重量／重
量）が好ましく、ガングリオシド溶液中に加え
て、１時間ないし24時間撹拌することによりガン
グリオシドの吸着が達成される。活性炭への吸着
は90％以上、ほぼ100％に達する。ガングリオシ
ドを吸着した活性炭は水洗することにより、ガン
グリオシドを失うことなく共存する塩類を除去で
きる。活性炭からガングリオシドを溶離するため
に、メタノール、エタノール、テトラヒドロフラ
ンおよびクロロホルムなどの溶媒でも可能だが充
分ではない。しかし、塩基性の溶液により容易に
殆んどが溶離する。例えば、アンモニア水、トリ
エチルアミン、ビリジン類、ジメチルアニリン等
の塩基を含んだメタノール、エタノール、テトラ
ヒドロフランおよびクロロホルムあるいはこれら
の２種以上の混合溶液が好適に用いられる。溶出
の効果と溶離液からのガングリオシドの回収を考
慮するとこれらの溶液のうちでも特にメタノー
ル、クロロホルムの混合溶液にアンモニア、アン
モニア水又はトリエチルアミンを含んだ系が好都
合である。ガングリオシドを吸着した活性炭は、
その５倍ないし10倍（重量／重量）の溶液に10分
ないし６時間接触させることにより、95％以上の
ガングリオシドを溶離させ回収することが出来
る。

発明の効果 本発明の方法により、非常に困難であつた発泡
性のガングリオシド水溶液（例えば、フオルチの
分配による水溶性溶液）の濃縮あるいは塩類を含
んだガングリオシド水溶液の透析による脱塩は活
性炭による吸着、溶離の操作によつて簡単な有機
溶媒の蒸発乾固に変えることが出来た。更に、こ
の処理によりガングリオシドにきよう雑している
蛋白質を除去することも出来る。本発明の方法を
用いると、まず組織から大量のガングリオシドを
抽出し、フオルチの分配に続けてその水性溶液か
ら活性炭へ吸着させ、クロロホルム、メタノー
ル、アンモニア混合溶液により溶出し、同溶液の
蒸発乾固、更に必要あればイオン交換カラムクロ
マトグラフイーによる精製及び塩類を含む場合に
は再度、活性炭吸着と溶出を行ない、溶出液の蒸
発乾固の操作によりガングリオシドの濃縮物を得
ることができる。本発明をさらに具体的に説明す
るために実施例を示す。

実施例 １ アセトンで脱脂、脱水した牛脳からメタノール
で抽出したガングリオシドをクロロホルム、メタ
ノール、水で分配した上層の水性溶液100ml（シ
アル酸、207.6mg：ガングリオシドとして664.3mg
含有）にクロマトグラフ用活性炭（希塩酸、クロ
ロホルム、メタノール、濃アンモニア水混合液で
処理後メタノール、水で洗浄、95℃で乾燥）10ｇ
を加えて撹拌した。溶液中のシアル酸量は、30分
後に49.8mg（24％）、２時間後に14.5mg（７％）
となり、１夜放置しても13.0mgであつた。吸引
過して活性炭を水、メタノール（１：１、ｖ／
ｖ）の混合溶液で洗浄したのち、クロロホルム、
メタノール、濃アンモニア水（６：４：１、ｖ／
ｖ／ｖ）の混合溶液50mlに加えて撹拌した。５時
間後には溶液中にシアル酸195.2mg（94％）が溶
出した。過後、同じ組成の溶媒10mlで洗浄し、
液、洗液を合せて減圧濃縮して、ガングリオシ
ド換算587.9mgを含む粗結晶846.8mgを得た。回収
率88.5％であつた。共存した蛋白質については、
原料の水性溶液中に15.3mg（2.3％対ガングリオ
シド）であつたものが、粗結晶中には9.0mg（1.5
％）になりガングリオシドが精製されていた。

実施例 ２ 実施例１と同じ方法で得たガングリオシドの水
性溶液100mlをイオン交換樹脂（DEAE−セフア
セル、アセテート型、フアルマシア製）50mlに流
してガングリオシドを吸着させた。メタノール
200mlで洗浄したのち１モルの酢酸アンモニウム、
メタノール溶液で溶出し、ガングリオシドを含む
画分100mlを得た。これを1/2に濃縮し、同量の水
で希釈し、クロマトグラフ用活性炭10ｇを加えて
１夜撹拌し吸着後、活性炭を過、蒸溜水で充分
洗浄した。この活性炭をクロロホルム、メタノー
ル、濃アンモニア水（６：４：１、ｖ／ｖ／ｖ）
の混合液50ml中で２時間撹拌し、過、洗滌し、
溶出液を蒸発乾固して塩類を含まないガングリオ
シド606.7mg得た。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ガングリオシドを含む溶液を活性炭に接触せ
   しめてガングリオシドを吸着させ、次いで塩基性
   の溶液でガングリオシドを溶出することを特徴と
   するガングリオシドの濃縮方法。 ２ ガングリオシドを含む溶液が、水、メタノー
   ル、エタノール、テトラヒドロフラン、又はクロ
   ロホルムを含む溶液である第１項の方法。 ３ 塩基性の溶液が、メタノール、クロロホル
   ム、アンモニア、アンモニア水、メタノール、ク
   ロロホルム又はトリエチルアミンを含む溶液であ
   る第１項の方法。