JPS6011922B2

JPS6011922B2 - 高活性ヘパリンの製造法

Info

Publication number: JPS6011922B2
Application number: JP11586578A
Authority: JP
Inventors: 隆一富永; 隆一大矢
Original assignee: Amano Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Amano Enzyme Inc
Priority date: 1978-09-22
Filing date: 1978-09-22
Publication date: 1985-03-29
Also published as: JPS5543123A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は医療上有用な高活性へパリンを製造する方法に
関するものである。

一般に、ヘバリンは豚、牛、羊など健康な食用獣の肝、
肺及び腸粘膜より抽出される酸性ムコ多糖であり、強力
な凝血阻止作用をもっている。

へパリンは極めて強力な凝血阻止作用をもち、かつ、そ
の霧性が低いため、殆んど唯一の凝血阻止剤として医療
面において長年の間用いられてきている。へパリンはこ
のように長い間医薬として用いられたにもかかわらずそ
の本体は今日に至るもなお明らかではない。

最近の研究によれば現在市販されているへバリンは２の
蚤以上の分画よりなる不均一な混合物であり、各分画は
それぞれ分子量、硫酸ェステル基舎量などが異なった構
成成分からなっており、それに応じて各分画の凝血阻止
活性は強弱さまざまである。従って、従来のへパリン製
品は活性にばらつきがあり、特に低活性画分と高活性画
分との混合物である点に問題があった。従来用いられて
きたへパリンの精製法はへパリンがカルボキシル基や硫
酸基をもつ強酸性物質であるという事実を利用したもの
である。即ち、セチルトリメチルアンモニウムブロマイ
ド、セチルピリジニウムクロラィド、ベンジンなどの塩
基怪物質による選択的沈澱、Ｄｏｗｅｘ−１、ＤＥＡＥ
−セルロース、ＤＥＡＥ−セフアデツクスなどの陰イオ
ン交換体による吸着溶離、あるいはバリウム塩への結晶
化などが提案されてきた。しかしながらこれらの方法は
へパリンの電気的性質を利用したものであることから、
ヘパリンと蛋白質や核酸との分離かあるいは他の酸性コ
ム多糖などから分離するには有効であるが、ヘパリンの
各分画を相互に分離することは不可能である。このため
従来の方法により精製されたへパリンは高凝血阻止活性
分国と低凝血阻止活性分画の混合物として得られ、その
結果製品の凝血阻止活性は１４５Ｊ．Ｐ皿船／雌前後を
示すのが普通であった。近年Ｒｏｓｅｎ戊ｒｇ（Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈ災．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．、６９
５７０、１９７６）らはアンチトロンビン−へパＩＪン
コフアクターを用いて市販へパリンから高活性を有する
へパリンを実験室的に得ることに成功した。

この方法はへパリン分子相互の分画法として最初のもの
である。しかしながらアンチトロンビン−へパリンコフ
アクターは動物の血液より複雑な精製工程を経ていまだ
実験室的に得られる程度であり、これをもちいて工業的
に高活性へパリンを製造することは困難である。本発明
者らは、このような欠点をもつへパリンの製造法を改善
し、高活性のへパリンを効率よく製造するために研究を
行った結果、固定化プロタミンをカラムに充填し、低濃
度の塩類溶液かあるいは同程度のイオン強度を有する緩
衝液にへパリンを溶解せしめ、カラムに流し、つぎに塩
類濃度を順次増加させて吸着したへパリンを溶出したと
ころ、低濃度の塩類溶液で溶出される画分からは低活性
へパリンが得られ、高濃度の塩類溶液で溶出される画分
からは高活性へパリンが得られることを見し、出した。

本発明は、この知見によって完成されたもので、ヘパリ
ン含有液を固定化にプロタミンに接触させ、溶液中のへ
パリンを固定化プロタミンに吸着せしめた後、低濃度の
塩類溶液、あるいはこれに相当するイオン強度を有する
緩衝液で処理し、溶出する低活性へパリン画分を除き、
ついで高濃度の塩類溶液、あるいはこれに相当するイオ
ン強度を有る緩衝液で溶出させて高活性へパリンを製造
する方法である。

本発明は医療上使用される高活性へパリンをきわめて簡
単な操作で得られる利点を有している。

本発明の原料であるへパリン含有液は豚「牛、羊などの
肝、肺、腸粘膜から抽出し、部分精製した粗へパリン液
、市販のへパリン標品を溶解したへパリン液などで、好
ましくは緩衝液に熔解して用意される。また、本発明に
おいてへパリンを吸着せしめるプロタミンは固定化した
ものを用いるが、プロタミンの固定化は公知の方法によ
って行うことができる。

まず担体としてはセフアロース、粒状澱粉、セルロース
、あるいは合成樹脂などが用いられ、結合方法としては
臭化シアンやヒドラジンなどによる共有結合法が用いら
れる。得られた固定化プロタミンはカラムにつめ、この
カラムにへパリン含有液が通液される。

ここで低活性へパリンも高活性へパリンも同時に固定化
プロタミンに吸着されてしまう。本発明において、セフ
アロース固定化プロ夕ミンに吸着した低活性へパリンを
溶出除去する場合の塩類濃度又はイオン強度の範囲とし
ては使用する原料により異なるが、塩類濃度５％以下又
は電導度５０のひ以下に相当するイオン強度を有する緩
衝液を用いるのが好ましい。

次いで高活性へパリンを溶出取得する場合の塩類濃度又
はイオン強度の範囲としては塩類濃度５％以上又は電導
度５０の○以上に相当するイオン強度を有する緩衝液を
用いるのが好ましい。

又、固定用プロタミンへのへパリンの吸着、溶離時の風
は斑３〜１０の範囲で行なうことができるが、より好ま
しくはｐＨ５〜７の範囲である。

本発明の方法によれば、従来市販へパリンの凝血阻止活
性が１４Ｗ．Ｐ皿ｉｔｓ′腿前後であったものを、きわ
めて簡単な操作で、２００Ｊ．ＰｕｎｉＰ／の９前後ま
での高活性へパリンにすることができ、医療上益すると
ころきわめて大なるものがある。次に本発明の試験例と
実施例を示す。

なお本発明の試験例、実施例に示したへパリンの凝血阻
止活性は日本薬局法（第９改正）５１９頁記載の方法に
準じて測定した。

試験例１湿溶量７００の‘のセフアロース固定化プロタミンをカ
ラムに充填し、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）で緩
衝化した後、粗へパリン標品（米国ラィカー社製品：１
１０Ｊ．Ｐｕｎ船／双９）１．５夕を０．１Ｍ酢酸緩衝
液（ｐＨ５．０）に溶解せしめたものをカラムに流し、
ヘパリンをセフアロース固定化プロタミンに吸着せしめ
、ついで食塩の濃度勾配法により吸着しているへパリン
を溶機せしめた。

各画分における電導度とフェノール硫酸法による０．Ｄ
４９瓜仇の吸光度との関係を示したものが第１図である
。第１図における電導度０〜２５肌○（食塩濃度０〜１
．５％）、２６〜５０ｍ○（食塩濃度１．６〜４．０％
）、５１〜７５肌○（食塩濃度４。１〜６．５％）、７
６〜１００机ひ（食塩濃度６．６〜９．０％）の範囲の
各画分を集めて、このへパリン含有液にエタノールを加
え、ヘパリンを回収し、乾燥し、その凝血阻止活性を求
めたところ第１表の如き結果が得られた。

第１表第１表から明らかな如く、電導度０〜２５のひ（食塩０
〜１．５％）の区分はへパリン含量が比較的多いが、活
性が極端に低く、いわゆる低活性へパリンを多く含んで
いる。

又、電導度２６〜５０の○（食塩濃度１．６〜４．０％
）の場合でもへパリン活性は１２幻．Ｐｕｎｉｔｓ／の
９であり、あまり活性の上昇はみられないが、電導度５
１〜７５の○（食塩濃度４．１〜６．５％）では活性が
１８９０．Ｐ皿ｉｔｓ／雌となり、さらに電導度７６〜
１００肌○（食塩濃度６．６〜９．０％）では活性が２
０１Ｊ．Ｐ皿ｉｔｓ／柵と上昇した。このように溶出液
の食塩濃度が高い区分には高活性へパリンが含まれてい
ることがわかる。なお、電導度５１〜１００仇ひの区分
から得られたへパリンの活性回収率は粗へパリン標品に
対して８４．１％であった。

試験例２試験例１に準じて、セフアロース固定化プロタミンカラ
ムに粗へパリン標品（米国ラィカー社製品：１１０Ｊ．
Ｐ皿ｉｔｓ／磯）１．５夕を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．０）５０の‘に溶かしたものを流入せしめ、セフ
アロース固定化プロタミンにへパリンを吸着せしめた後
、４％食塩を含む０．１Ｍリン酸緩衝液１５０肌を流し
て、低活性へパリン区分を溶出除去し、ついで１０％食
塩を含む０．１Ｍリン酸緩衝液１５０泌をカラムに流し
、高活性へパーＪン区分を集めた。

こうして得られた高活性へパリン含有液にエタノールを
等量加えへパリンを沈澱せしめ、さらにエタノールで洗
糠した後、真空乾燥して力価２０１Ｊ．Ｐ肌ｉｔｓ′の
９のへパリンが７１０の９得られた。このものの粗へバ
リン標品に対する活性収率は８６．５％である。実施例
１粗へパリン際品（米国ライカー社製品：１１０Ｊ．
Ｐ皿ｉ＄／の９）４夕を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７
）１００の‘に溶かし、セフアロース固定化プロタミン
カラム（７００の‘）に流し、ヘパリンを吸着せしめた
後、４％食塩を含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０
）５００の【を該カラムに流して低活性のへパリンを溶
出除去する。

ついで１０％食塩を含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７
．０）を該カラムに流し、高活性へパリン区分を溶出取
得する。この高活性へパリン溶出液に等量のエタノール
を加え、生じた沈澱物を集め、エタノール、アセトンで
洗族後真空乾燥すると２０５Ｊ．Ｐ皿ｉｂ′の９の活性
を有するへパリン１８１０の９が得られた。このものの
粗へパリン標品に対する回収率は８４．３％である。実
施例２煮沸して細切りした豚の陽１．５ｋ９に水２〆、食塩２
００夕、炭酸ソーダ５０夕を加えて７０００で１時間保
った後、冷却して固形分を除去した抽出液に酢酸を加え
てｐＨ７．０にする。

これにメチルセロソルブを等量加えて一夜放置する。上
液を傾斜して捨て、沈澱物をガラスフィルターで集め、
アセトンで洗糠し乾燥すると３幻．Ｐ肌船′雌の粗へパ
リンが２．８タ得られた。この粗へパリンを１％食塩を
含む０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）５０泌に溶かし
、セフアロース固定化プロタミソカラム（７００の【）
に流す。ついで４％食塩を含む０．１Ｍ酢酸緩衝液３０
０私を流して不純物及び低活性へパリソを港出、除去す
る。さらに１０％食塩を含む０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ
５．０）３００凧‘を該カラムに流し、高活性へパリン
を含む溶出液を得、該熔出液に等量のエタノールを加え
、生じた沈澱物を集め、エタノール、ァセトンで洗糠後
乾燥すると２０５Ｊ．Ｐｕｎｉｔｓ／ｍ９の活性を有す
るへパリンが３７０雌得られた。このものの粗へパリン
に対する回収率は８４．６％である。実施例３粗へパ
リン標品（米国ラィカー社製品：１２６Ｊ．Ｐ肌ｉｂ／
の９）１５夕を１％食塩を含む０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐ
Ｈ５．０）４００の‘に溶かし、セファロース固定化プ
ロタミンカラム（７そ）に流し、ヘパリンをカラムに吸
着せしめた後、該カラムに３％食塩を含む０．１Ｍ酢酸
緩衝液（ｐＨ５．０）を流し、低活性へパリンを溶出除
去した後、さらに１０％食塩を含む０．１Ｍ酢酸緩衝液
を該カラムに流し、高活性へパリンを含む溶出液を得、
該溶出液に等量のエタノールを加え、生じた沈澱物を集
めエタノール、アセトンで洗糠後真空乾燥すると、２０
幻．Ｐ肌ｉｔｓ′の９のへパリンが８．２タ得られた。

このものの粗へパリン標品に対する回収率は９０．２％
である。

【図面の簡単な説明】

第１図は試験例１においてセフアロース固定化プロタミ
ンに吸着したへパリンを１０％食塩を含む０．１Ｍ酢酸
緩衝液（ｐＨ５．０）で濃度勾配法により綾離せしめた
図である。図中、実線はフェノール硫酸法による０．Ｄ４９瓜仇の
吸光度を示すものであり、点線は電導度を示すものであ
る。第１図

Claims

【特許請求の範囲】

１ヘパリン含有液を固定化プロタミンに接触させ、溶
液中のヘパリンを固定化プロタミンに吸着せしめた後、
低濃度の塩類溶液、あるいはこれに相当するイオン強度
を有する緩衝液で処理し、溶出する低活性ヘパリン画分
を除き、ついで高濃度の塩類溶液、あるいはこれに相当
するイオン強度を有する緩衝液で溶出せしめることを特
徴とする高活性ヘパリンの製造法。