SU482934A3 - Способ очистки калликреина - Google Patents

Description

(54) СПОСОБ ОЧИСТКИ КАЛЛИКРЕИНА сом. Адсобрцию осуществл ют при значении рН 4,8-8,0. Элюирование осуществл ют повыщением концентрации соли при посто нном значении рН, или снижением значени  рН при посто н ной концентрации соли, или комбинацией обоих способов. Изменение рН и концентрации соли осуществл ют беспрерывно, как градиентное про вление, или постепенно. Примен ют все известные буферные соли, но предпочитают летучие буферные соли, например формиат аммони , ацетат аммони , пропионат аммони  или соответствующие соли алкиламмони , например формиат триэтиламмони . Адсорбируют калликреин из 0,2 М ацетата аммони  со значением рН 5,0 на ДЕАЕ-сефадексе в виде колонны, неактивный протеин промывают 0,25 М ацетатом аммони  со значением рН 5,0 и затем элюируют обогащенный калликреин 0,3 М ацетатом аммони  со значением рН 4,5. Обогащенный таким образом калликреин подвергают дальнейп1ей очистке обработкой макропористыми катионитами. Получают препаоаты чистотой 90%. В качестве макропориЛ . --- стых катионитов примен ют кислозамещенные целлюлозы или кислозамещенные гели, например, из декстранов с поперечными св з ми или полиакриламида, с достаточной величиной пор. Обработку раствора обогащенного калликреина катионитом осуществл ют посредством размешивани  его с катионитом или фильтровани  через слои катионита. Во врем  размешивани  или фильтрации удерживаютс  сопутствующие вещества гелей, в то врем  как калликреин беспреп тственно проходит через фильтрующий слой. Примен емые дл  фильтрации или перемешивани  макропористые катиониты лодвергают предварительной обработке известными приемами. Дл  фильтрации их вмещивают в разбавленные буферные растворы и подают в виде суспензии, например, в колонны с большим диаметром. Дл  получени  буферных растворов примен ют известные буферные соли , но предпочитают летучие буферные соли, например формиат аммони , ацетат аммони , пропионат аммони , или соли алкиламмони , например формиат триэтиламмони . Значение рП буферных растворов выбирают между 4,5 и 8,5, Дл  получени  кристаллического калликреина кристаллизуют калликреин высокой чистоты прибавлением сульфата аммони  в твердом виде или в виде концентрированного раствора при значении рН 4,0-8,0. Кристаллизацию начинают при насыщении сульфатом аммони  45% по истечении нескольких дней при температуре 15-25°С. Кристаллы выдел ют из маточного раствора центрифугированием или фильтрованием, промывают 50%-ным насыщенным раствором сзльфата аммони  и раствор ют в разбавленных солевых растворах или в воде. g Дл  получени  кристаллических компонентов А и Б калликреина раздел ют очищенный калликреин известными методами - хроматографией с ДЕЛЕ-сефадексом. Компоненты калликреина высокой частоты кристаллизуют отдельно прибавлением сульфата аммони  в твердом виде или в виде концентрированного раствора при значении рН 4,0-8,0. Кристаллизацию начинают при насыщении сульфатом аммони  по истечении нескольких дней при температуре 15-25°С. Кристаллы имеют форму игл, соедин ющихс  в пучки. Кристаллы выдел ют из маточного раствора центрифугированием или фильтрованием, промывают50%-ным насыщенным растворомсуль ,,, ,„„,- сгглп; 1,- -,, ..-фата аммони  и раствор ют в разбавленных солевых растворах или в воде. Кристаллы состо т из чистого, электрофоретически однородного калликреина А и Б. Раствор кристаллов калликреина и компонентов калликреина характеризуетс  УФспектром при значении рН 7 с максимумом при 282 нм, минимумом при 251 нм, с 2 плечами при 277 и 290 нм и соотнощением экстинкции при 280 и 260 нм 1,78. Кристаллический калликреин и кристаллические компоненты А и Б примен ют в качестве эффективных составных частей лекарственных средств. Пример 1. 200 л полученного из поджелудочной железы свиней и подверженного диализу элюата осадка свинцовой соли, содержащего 10,8 млн. ед. калликреина, сгущают в тонкопленочном выпарном аппарате до 15 л и затем обессоливают гель-фильтрацией в колонне сефадекса Г-25. Значение рН обессоленного раствора устанавливают 5,0 и отфильтровывают образовавщийс  при этом осадок. Затем прибавл ют твердый ацетат аммони  до удельной электропроводности 12 ms (микросименс). Этот раствор подают на колонну ДЕАЕ сефадекса А-50, уравновещенного с 0,2 М ацетатом аммони  со значением рН 5,0, калликреин при этом адсорбируетс . Затем элюируют колонну сперва л и 0,25 М ацетатом аммони  со значением рН 5,0, а потом 0,3 М ацетатом аммони  со значением рН 4, 5. Калликреин про вл етс  в элюате после того, как значение рН снижаетс  до 4,5. Активные фракции содержат 9,35 млн. ед. калликреина (86,5%). Раствор концентрируют в вакууме и обессоливают в олонне сефадекса G-25. Лиофилизованна  роба имеет специфическую активность 14 ед. калликреина/мг. Пример 2. Обессоленный раствор объеом 300 мл фильтруют в колонне СМ-сефаекса G-50, уравновешенного с 0,01 М ацетаом аммони  со значением рП 5,0. В злюате о вл етс  калликреин, затем неактивные зар знени . Фракци  калликреина (930 мл) соержит 5,5 млн. ед. калликреина (59%). Лио ,,- ...л. . I/IWOилизованна  проба имеет специфическую ктивность 1060 ед. калликреина/мг 220 ед. калликреина/мг протеина. 56

Предмет изобретени целью повышени  чистоты и выхода целевого

Способ очистки калликреина путем хрома-на макропористом катионите, например,

тографии частично очищенного препарата на СМ-сефадексе, с последующей кристаллизамакропористом анионите, например ДЕАЕ- 5 дией и разделением на активные компоненты целлюлозе, отличающийс  тем, что, с при необходимости.

482934

продукта, провод т дополнительную очистку