JPS62500A - アビジンの溶出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はリゾチーム・アビジン等の塩基性蛋白を吸着さ
せた陽イオン交換樹脂からアビジンを能率よく溶出させ
るアビジンの溶出方法に関する。

〔従来技術〕

アビジンは動物性蛋白質中に含まれている分子量約６８
，０００の塩基性蛋白であり、動物原料の中でも際立っ
て多く含まれているとされている卵白でさえ、卵白液に
対して０．００５　％程度の微量にしか含まれていない
。

ところで、卵白から抽出・精製して得られる純度の高い
アビジンは、ビタミンの一種であるビオチンと強い親和
性を示すため、最近この性質を活用し、生物工学や医療
の分野で、免疫抗体のクローンの検出、ガンのミサイル
療法、病原の検出薬等に使用され、需要が増大しつつあ
る。

従来、卵白からアビジンを抽出するには、まず、卵白液
にイオン交換体を加えて攪拌し、この交換体にリゾチー
ム・アビジン等の塩基性蛋白を吸着させ、次に、この交
換体をカラムに詰め、カラム内に濃度の異なる塩溶液を
７段階程度に分けて加え、カラム内の交換体よりアビジ
ンを特異的に溶出させ、最後に、溶出したアビジンを溶
液から分離する方法が採用されていた。

しかしながら、上記従来法によると、アビジンの溶出工
程において、 イ、濃度の異なる塩溶液をカラム内に加えるとき、各段
階毎に塩濃度に対するアビジンの溶出量を吸光度計等で
測定しなければならず、口、また、カラム方式であるか
ら、一度に少量しかアビジ／を溶出できないばかりか、
溶出に時間がかかり、 ハ、さらには、アビノンの溶出に、塩溶液を多量に使用
しなければならない、 という問題があった。

つまり、従来法によると、人手・時間及び処理剤がかか
る割には、アビノンが少量しか得られず、したがってア
ビノンを低コストで供給できないという問題があった。

〔発明が解決しようとする問題点〕

ところで、アビジンの需要が増大しつつある今日におい
ては、アビジンを低コストで供給することが急務であり
、そのためには、アビジンを能率よく溶出する技術の確
立が望まれている。

そこで、本発明者等はそのような技術を開発すべく研究
を重ねた結果、本発明を完成したものである。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明は、アビジンの溶出方法に関し、リゾチーム・ア
ビノン等の塩基性蛋白を吸着させた陽イオン交換樹脂を
、まず、３．０％以下の中性塩水溶液中で処理した後、
水溶液を除去し、次に、この吸着樹脂を３．０％を越え
る中性塩水溶液中で処理することを特徴とするものであ
る。

本発明の実施に当っては、まず、卵白液・牛乳等のリゾ
チーム・アビジン等の塩基性蛋白を含む原料を用意する
。これらの原料は、次工程で行なう樹脂による吸着を容
易にするため、予め、ホモｒナイズし、また、その−を
６．５〜７．５に調整しておくことが望ましい。

次に、上記原料に約２〜３割の容量の陽イオン交換樹脂
を添加し、ゆっくりと数時間（約１〜８時間）攪拌して
原料中のリゾチーム・アビジン等の塩基性蛋白を樹脂に
吸着させる。

本発明で使用する陽イオン交換樹脂としては、ロームア
ンドバースト社製の「アンバーライトＩＲＣ−５０Ｊ　
・「アンバーライトＩＲＣ−８４ｊ・「アンノぐ一うイ
トＣＧ−５０４、ダイヤモンドジャムロックケミカル社
製の「デュオライ）　Ｃ８−１０１ｊ・「デュオライト
ＣＣ−３Ｊ　・「デュオライトＥＳ−８０Ｊ、ダウケミ
カル社製の「ダウエックスＣＣＫ−２Ｊ１．バイエル社
製「レバチットＣＮＰ　ｊ　・「レバチットＧＮＰ−８
０Ｊ、又は三菱化成工業（株）製の「ダイヤイオンＷＫ
−１０Ｊ　・。

［ダイヤイオンＷＫ−２０Ｊ　・「ダイヤイオンＷＫ−
１ｉＪ等の弱酸性陽イオン交換樹脂が望ましい。

次に、上記のようにして得られたリゾチーム・アビジン
等の塩基性蛋白を吸着した樹脂を原料から取り出し、水
洗して吸着樹脂に付着した原料を洗い落した後、この吸
着樹脂を３，０％（重量％をいう、以下同じ）以下の中
性塩溶液中で処理する。

中性塩としては、塩化ナトリウム（食塩）・塩化カリウ
ム・塩化アンモニウム等の水に溶解させたときその水溶
液の−が中性付近になるものを使用する。

この処理により、樹脂に吸着させたリゾチーム・アビジ
ン等の塩基性蛋白のうち、主としてリゾチ−ムを吸着樹
脂から水溶液中に溶出する。水溶液の塩濃度が３．０チ
を越えると、吸着樹脂よりリゾチームと一緒にアビジン
も溶出してしまい、リゾに行なうには、水溶液の中性塩
濃度を２．０〜３．０チにすることが望ましい。

吸着樹脂の処理は、上記濃度の中性塩水溶液中で行なえ
ばよいが、その操作は容量比で中性塩水溶液１００部に
対して吸着樹脂１０〜１００部程度の割合で混合するの
が作業上能率がよい。また、リゾチームの溶出を効率よ
く行なうには、３０ｒ’ｐ’ｍ程度の速度で水溶液と樹
脂を１０〜６０分間攪拌するとよい。

次に、上記処理が終了した吸着樹脂から中性塩水溶液を
抜き取り、この吸着樹脂を３．０チを越える中性塩水溶
液中で処理し、吸着樹脂に吸着させているアビジンを水
溶液中に溶出させる。

中性塩としては、前記リゾチーム等の溶出に用いたもの
と同じものを使用すればよい。

この処理により、樹脂に吸着させているアビジンが水溶
液中に溶出する。

この処理工程で使用する水溶液の中性塩の濃度は、３，
０％を越えること、好ましくは、４．０〜６．０％であ
ることが望ましい。塩濃度が３．０％を越える水溶液で
あれば、後の試験例にも示すように吸着樹脂より水溶液
中にアビノンを溶出させることができる。しかし、その
濃度が３％台であると溶出に時間がかかり、また、６．
０　％を越えると中性塩の無駄使いとなるので望ましく
ない。

吸着樹脂からのアビジンの溶出は、上記濃度の中性塩水
溶液中で処理すればよいが、この操作は容積比で中性塩
水溶液１００部に対して、吸着樹脂５０〜２００部程度
の割合で混合して行なうことが望ましい。問、水溶液の
使用量を多くし過ぎると、水溶液に溶解したアビジンの
濃度が低くなってしまい、水溶液からのアビジンの回収
作業が難しくなり、望ましくない。また、この溶出工程
を効率よく行なうＫは、前記リゾチーム溶出工程と同様
に、３０ｒ−ｐ−ｍ程度の速度で水溶液と吸着樹脂を１
０〜６０分間程度攪拌するとよい。

最後に、上記樹脂が含まれている中性塩水溶液をフィル
ター等の濾過装置にて濾過して涙液を得、このＦ液を公
知の方法で処理してアビジンの結晶を析出させ、この結
晶を回収・脱塩すれば粗製のアビジンを得ることができ
る。

尚、このようにして得られる粗製のアビノンには、コン
アルブミン等の不純物が混入しているので、純度の高い
アビジンに仕上げるには、再結晶化法や膜濾過法等によ
り粗製のアビジンを精製するとよい。

〔実施例〕

実施例Ｉ Ａ、アビジン・リゾチーム吸着樹脂の調整クエン酸を添
加し−を７．０に調整した卵白液１０ｋｇをホモグナイ
ズした後、この卵白液に陽イオン交換樹脂（三菱化成工
業（株）製・商品名「ダイヤイオンＷＫ−１０」を２．
５１添加し、低速で２時間攪拌した。

次いで、卵白液より樹脂を戸別し、得られた樹脂に清水
１０ｋｌ？を加えて樹脂を３回洗浄し、リゾチーム・ア
ビジン等が、吸着している樹脂を得た。

上記のようにして得られた吸着樹脂に、３．０　％食塩
水６１を添加し、３０ｒ−ｐ−ｍの速度で３０分間攪拌
して、樹脂に吸着しているリゾチームを食塩水中に溶出
させた。　　　− 次いで、食塩水から吸着樹脂を戸別し、得られた樹脂に
清水１０ｋｌ？を加えて樹脂を３回洗浄し、アビジンが
吸着している樹脂を得た。

Ｃ，アビジンの溶出 上記のようにして得られた吸着樹脂に、５．０％食塩水
２１を添加し、３０ｒ−ｐ−ｍの速度で３０分間攪拌し
て、樹脂に吸着しているアビジンを食塩水中に溶出させ
た。

Ｄ、溶出アビノンの分離・精製 次いで、上記樹脂が含まれている食塩水を８０メツシユ
のストレーナ−にて濾過し、さらにストレーナ−に戸別
された樹脂を５％食塩水０．５１で押し出し濾過をして
、涙液を得た。

次いで、得られたｐ液に硫安を添加して３．５Ｍ硫安溶
液となるように調整し、さらに、この溶液にＩＮの塩酸
を添加して溶液のＰＨを４．０とし、低速で８時間攪拌
して溶液中のアビジンを塩析させた。そして、この溶液
を遠心分離して粗アビジンの結晶を得た。

最後に、得られた粗アビジンの結晶を５％食塩水２１に
溶解させ、次いで、この食塩水に硫安を添加して３．５
Ｍ硫安溶液となるように調整し、さらに、この溶液にＩ
Ｎの塩酸を添加して溶液のＰＨを５．０とし、低速で８
時間攪拌して溶液中にアビジンを塩析させた。そして、
この溶液を遠心分離してアビジンの結晶を回収し、結晶
付着の塩類を水洗して脱塩し、結晶を乾燥したところ精
製アビジン２００Ｉｎ９（収率０．００２％）を得た。

実施例２ 実施例１．、において、Ｂのリゾチーム溶出工程で使用
する食塩水の濃度を２．０％とし、Ｃのアビジン溶出工
程で使用する食塩水の濃度を４．０％としたほかは、実
施例１と同じ方法でアビジンを抽出・精製し、精製アビ
ジン３００■（収率０．００３％）を得た。

実施例３ 実施例１．において、Ｂのリゾチーム溶出工程で使用す
る食塩水の濃度を２．０％とし、Ｃのアビジン溶出工程
で使用する食塩水の濃度を３，２％としたほかは、実施
１と同じ方法でアビジンを抽出・精製し、精製アビジン
１００ｒｎ９（収率０．００１％）を得た。

〔作用〕

以下、本発明の作用を試験例で立証すると次のとおりで
ある。

試験例１ アビジン（ＢＥＬＯＶＯ社製）とリゾチーム（キューピ
ー（株）製）とをそれぞれ１０ｍ９づつ用意し、これを
２０ｍ１の蒸留水に添加して溶解させた。

次に、陽イオン交換樹脂（三菱化成工業（株）製・商品
名「ダイヤイオンＷＫ−１０Ｊ　）　１５　ｍｌに上記
アビジンとりゾチームの溶解液を加え、３０分間攪拌し
て樹脂にアビジンとリゾチームを吸着させた。

次に、上記吸着樹脂を溶液から取り出し、水洗した後、
得られた吸着樹脂を１０等分して１０個のサンプルを得
た。

上記サンプルを各別に表−１に示す濃度の食塩水５１ｎ
ｌにそれぞれ添加し、３０分間攪拌した。

得られた溶液について、それぞれ次の二つの定性試験を
行なったところ、表−１の結果が得られた。

試験Ａ・・・Ｌｏｗｒｙ法により、リゾチームの溶存を
確認した。

試験Ｂ・・・４−ヒドロキシアゾベン゛ゼンー２′−カ
ルがン酸を添加し、アビノンの溶存を確 認した。

表　−１ 尚、表中の記号は、−は呈色しなかったこと（リゾチー
ム又はアビノンは溶出していない）を、Ｏは呈色したこ
と（リゾチーム又はアビジンは溶出している）を示す。

試験例２ 試験例１の処理がなされた各樹脂を水洗した後、３．５
％食塩水５　ｍｌ中にそれぞれ添加し、３０分間攪拌し
た。

得られた溶液について、それぞれ試験例と同じ方法で定
性試験を行なったところ、表−２の結果が得られた。

表　　−２ 同、表中、樹脂の種類の欄における数値は、試験例１に
おいてその数値の濃度の食塩水で処理した樹脂であるこ
とを示し、また、表中の記号の意味は表−１の場合と同
じである。

以上のようＫ、リゾチームとアビジンを吸着させた陽イ
オン交換樹脂は、３．０　％以下の中性塩水溶液中で処
理すると、アビノンを樹脂に吸着させたままリゾチーム
のみをこの水溶液中に溶出させることができる。そして
、リゾチームを吸着させた樹脂を３．０チ越える中性塩
水溶液で処理すると、アビジンのみを水溶液中に溶出さ
せることができる。

伺、卵白液等のアビジン含有原料を用い、陽イオン交換
樹脂にリゾチームとアビジンを吸着させた場合には、こ
の樹脂にはりゾチームやアビジンと同性質のコンアルブ
ミン拳オぎアルブミン等の塩基性蛋白も吸着させること
になる。しかし、これらの塩基性蛋白の大部分は、リゾ
チームの溶出工程でリゾチームと一緒に水溶液中に溶出
させることができる。また、これらの塩基性蛋白がアビ
ジンの溶出工程でアビジンと一緒に不純物として溶出し
ても、水溶液から分離して得られる粗アビノンは結晶化
精製法等で処理することにより、純度の高いアビジンに
仕上げることができる。

〔発明の効果〕

以上述べたように本発明によれば、リゾチーム・アビジ
ン等の塩基性蛋白を吸着させた陽イオン交換樹脂を濃度
の異なる中性塩溶液中で二度の処理をするだけで樹脂に
吸着させたアビジンを能率よく溶出させることができる
。したがって、本発明をアビジンの抽出工程に適用すれ
ばアビジンを工業的規模で安価に生産することができる
。

尚、３．０チ以下の中性塩水溶液中に溶出させたす戸チ
ームは、公知の方法で回収することができ、このように
すれば、アビノンばかりでなくリゾチ−ムも得られ、ア
ビジンの生産コス＋−ｙ下げるのに寄与することができ
る。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. リゾチーム・アビジン等の塩基性蛋白を吸着させた陽イ
   オン交換樹脂を、まず、３．０％以下の中性塩水溶液中
   で処理した後、水溶液を除去し、次に、この吸着樹脂を
   ３．０％を越える中性塩水溶液中で処理することを特徴
   とするアビジンの溶出方法。