JP3262128B2 - 蛋白質の精製方法 - Google Patents
蛋白質の精製方法Info
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/18—Ion-exchange chromatography
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
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Description
【０００１】
【本発明の分野】本発明は一般に蛋白質の精製方法、特
に沈澱剤または塩溶液を使用せずにｐＨを調節して蛋白
質を精製する三工程から成る方法に関する。
に沈澱剤または塩溶液を使用せずにｐＨを調節して蛋白
質を精製する三工程から成る方法に関する。
【０００２】
【従来法】蛋白質を精製する現行の方法は沈澱剤、例え
ば塩、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のよう
な塩でない物質を使用している。不幸にして多くの場
合、蛋白質の収率は所望の割合よりも少ない。このよう
な方法は往々にして時間がかかり、またしばしば大きな
遠心分離器のような特殊な装置を必要とする。さらにこ
のような沈澱法を工業的規模に拡大するのは困難なこと
が多く、出来たとしても得られた沈澱の溶解速度は遅
く、必ずしも完全ではない。
ば塩、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のよう
な塩でない物質を使用している。不幸にして多くの場
合、蛋白質の収率は所望の割合よりも少ない。このよう
な方法は往々にして時間がかかり、またしばしば大きな
遠心分離器のような特殊な装置を必要とする。さらにこ
のような沈澱法を工業的規模に拡大するのは困難なこと
が多く、出来たとしても得られた沈澱の溶解速度は遅
く、必ずしも完全ではない。
【０００３】蛋白質を精製する他の通常用いられる方法
は、蛋白質を含む溶液のｐＨを所望の蛋白質の結合が容
易になる値にして該溶液をイオン交換性材料に通す方法
である。この方法では通常その後で、該蛋白質の放出を
容易にするイオン強度またはｐＨにおいて洗滌工程およ
び溶出工程を行う。例えばｐＨに下向きの勾配を付けＤ
ＥＡＥ セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）(R)から
蛋白質を溶出させ得ることを記載したジェー・ラミー
（Ｊ．Ｌａｍｙ）等のＡｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ．、１９３巻１４０〜１４９頁（１９７９
年）の論文参照。一般に蛋白質のｐＨをその等電位点の
方へ変化させると全体としての電荷が失われ、イオン交
換剤からの溶出が起こる。
は、蛋白質を含む溶液のｐＨを所望の蛋白質の結合が容
易になる値にして該溶液をイオン交換性材料に通す方法
である。この方法では通常その後で、該蛋白質の放出を
容易にするイオン強度またはｐＨにおいて洗滌工程およ
び溶出工程を行う。例えばｐＨに下向きの勾配を付けＤ
ＥＡＥ セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）(R)から
蛋白質を溶出させ得ることを記載したジェー・ラミー
（Ｊ．Ｌａｍｙ）等のＡｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ．、１９３巻１４０〜１４９頁（１９７９
年）の論文参照。一般に蛋白質のｐＨをその等電位点の
方へ変化させると全体としての電荷が失われ、イオン交
換剤からの溶出が起こる。
【０００４】ｐＨおよびイオン強度を変化させてイオン
交換剤から溶出を行う方法は英国ロンドンのピットマン
・アンド・サンズ（Ｐｉｔｔｍａｎ ａｎｄ Ｓｏｎ
ｓ）社１９６４年発行、モリス（Ｍｏｒｒｉｓ）等著、
「生化学における分離方法（Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」に
記載されている。また米国ニューヨークのシュプリンガ
ー・フェルラーク（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ）
１９８２年発行、ロバート・スコープス（Ｒｏｂｅｒｔ
Ｓｃｏｐｅｓ）著、「蛋白質の精製（ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」参照のこと。その８５
頁において著者は緩衝液のｐＨを変化させる方法は一般
に非常な成功を収める方法ではない（蛋白質の精製に対
し）ことを指摘している。
交換剤から溶出を行う方法は英国ロンドンのピットマン
・アンド・サンズ（Ｐｉｔｔｍａｎ ａｎｄ Ｓｏｎ
ｓ）社１９６４年発行、モリス（Ｍｏｒｒｉｓ）等著、
「生化学における分離方法（Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」に
記載されている。また米国ニューヨークのシュプリンガ
ー・フェルラーク（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ）
１９８２年発行、ロバート・スコープス（Ｒｏｂｅｒｔ
Ｓｃｏｐｅｓ）著、「蛋白質の精製（ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」参照のこと。その８５
頁において著者は緩衝液のｐＨを変化させる方法は一般
に非常な成功を収める方法ではない（蛋白質の精製に対
し）ことを指摘している。
【０００５】本発明においては、上記のイオン交換／ｐ
Ｈ法を少し変形することにより、単クローン抗体のよう
な蛋白質を比較的簡単に精製でき、現行の蛋白質精製
法、特に溶液のイオン強度を増加させて行く方法に通常
伴う蛋白質の損失を避けることができることが見出ださ
れた。次に本発明方法の詳細について述べる。
Ｈ法を少し変形することにより、単クローン抗体のよう
な蛋白質を比較的簡単に精製でき、現行の蛋白質精製
法、特に溶液のイオン強度を増加させて行く方法に通常
伴う蛋白質の損失を避けることができることが見出ださ
れた。次に本発明方法の詳細について述べる。
【０００６】
【本発明の総括】不純物を含む水溶液から蛋白質を精製
する本発明方法は三つの本質的な工程からなっている。
第１の工程においては所望の蛋白質が結合し易い溶液ｐ
Ｈ（第１のｐＨ）で溶液をイオン交換材料と接触させ
る。この工程中他の物質（不純物）も結合することがで
きる。次の工程においては蛋白質を溶出させない異なっ
たｐＨ（第２のｐＨ）をもつ溶液で蛋白質が結合したイ
オン交換材料を洗滌する。このｐＨは結合していない蛋
白質の結合を容易にする値ではないが、何らかの理由で
既に結合している蛋白質の溶出も容易にはしない値では
ある。第３工程においては蛋白質の溶出を容易にするｐ
Ｈ（第３のｐＨ）をもつ溶液で蛋白質を溶出させる。
する本発明方法は三つの本質的な工程からなっている。
第１の工程においては所望の蛋白質が結合し易い溶液ｐ
Ｈ（第１のｐＨ）で溶液をイオン交換材料と接触させ
る。この工程中他の物質（不純物）も結合することがで
きる。次の工程においては蛋白質を溶出させない異なっ
たｐＨ（第２のｐＨ）をもつ溶液で蛋白質が結合したイ
オン交換材料を洗滌する。このｐＨは結合していない蛋
白質の結合を容易にする値ではないが、何らかの理由で
既に結合している蛋白質の溶出も容易にはしない値では
ある。第３工程においては蛋白質の溶出を容易にするｐ
Ｈ（第３のｐＨ）をもつ溶液で蛋白質を溶出させる。
【０００７】好適具体化例においては、蛋白質は抗体で
ある。下記実施例においては腫瘍壊死因子即ちＴＮＦと
して知られている物質に特異的に結合する単クローン抗
体を用いて本発明方法を例示する。これらの実施例にお
いて、３個の異なった次第に増加して行くｐＨ値におい
て抗体を結合させ、洗滌し、溶出させることにより最良
の結果が得られることが見出だされた。
ある。下記実施例においては腫瘍壊死因子即ちＴＮＦと
して知られている物質に特異的に結合する単クローン抗
体を用いて本発明方法を例示する。これらの実施例にお
いて、３個の異なった次第に増加して行くｐＨ値におい
て抗体を結合させ、洗滌し、溶出させることにより最良
の結果が得られることが見出だされた。
【０００８】
【特定の具体化例】本発明を下記実施例によりさらに例
示する。これらの実施例においてＡＴＣＣ登録番号ＨＢ
９７３６の寄託された細胞系のサブ・クローンから抽出
された抗ＴＮＦ抗体を精製した。この細胞系は１９８８
年７月１８日付けの米国特許願第２２０，２０６号に記
載されている。
示する。これらの実施例においてＡＴＣＣ登録番号ＨＢ
９７３６の寄託された細胞系のサブ・クローンから抽出
された抗ＴＮＦ抗体を精製した。この細胞系は１９８８
年７月１８日付けの米国特許願第２２０，２０６号に記
載されている。
【０００９】本発明の改良された精製法は、透明にした
（濾過された）組織培養液（ＴＣＦ）中でＴＮＦに対す
る単クローン抗体を精製する際に沈澱工程を用いること
に伴う蛋白質の損失を減少させる方法を見出だすことを
試みて発見された方法である。
（濾過された）組織培養液（ＴＣＦ）中でＴＮＦに対す
る単クローン抗体を精製する際に沈澱工程を用いること
に伴う蛋白質の損失を減少させる方法を見出だすことを
試みて発見された方法である。
【００１０】この場合に処理したＴＣＦにおいては、主
な蛋白質成分は抗ＴＮＦ単クローン抗体および人のアル
ブミンであり、アルブミンは元の（透明にしない）ＴＣ
Ｆの細胞を安定化するために存在している。等電位点が
似ている（差は僅か１．５ｐＨ単位）ために、アルブミ
ンを抗ＴＮＦ抗体から分離するのが特に困難なことが見
出だされた。他の抗体は等電位点が高い（２．０ｐＨ単
位よりも高い）ために、一般に分離が容易である。本明
細書において人のアルブミンと抗体、特に単クローン抗
体との間で等電位点に著しい差があるとは、その差が約
２．０ｐＨ単位以上であることを意味する。等電位点が
似ているとはその差が２．０ｐＨ単位より小さいことを
意味する。
な蛋白質成分は抗ＴＮＦ単クローン抗体および人のアル
ブミンであり、アルブミンは元の（透明にしない）ＴＣ
Ｆの細胞を安定化するために存在している。等電位点が
似ている（差は僅か１．５ｐＨ単位）ために、アルブミ
ンを抗ＴＮＦ抗体から分離するのが特に困難なことが見
出だされた。他の抗体は等電位点が高い（２．０ｐＨ単
位よりも高い）ために、一般に分離が容易である。本明
細書において人のアルブミンと抗体、特に単クローン抗
体との間で等電位点に著しい差があるとは、その差が約
２．０ｐＨ単位以上であることを意味する。等電位点が
似ているとはその差が２．０ｐＨ単位より小さいことを
意味する。
【００１１】従って、陽イオン交換法は蛋白質の精製に
おいてはあまり使用されてはいないけれど、不満足なＰ
ＥＧ沈澱工程の代わりにこの方法を使用することにし
た。
おいてはあまり使用されてはいないけれど、不満足なＰ
ＥＧ沈澱工程の代わりにこの方法を使用することにし
た。
【００１２】本発明で使用した最初の方法はかなり標準
的なイオン交換法である。即ち或る特定のｐＨおよびイ
オン強度において陽イオン交換カラムを平衡状態に保
つ。イオン交換マトリックスはＳ−セファロース(R)で
あり、これはファルマシア（Ｆａｒｍａｃｉａ）社製の
表面をスルフォプロピル変性されたアガロースである。
所望の蛋白質を含む水性供給溶液（透明にしたＴＣＦ）
を同じ条件に調節し（ｐＨ４．６、酢酸ナトリウム０．
０１モル）、カラムに供給する。ＴＣＦは細胞培養器か
ら得られた培養液である。これは炭水化物、塩、アミノ
酸、蛋白質、他の細胞成長因子、および細胞を含んでい
る。透明にしたＴＣＦは濾過または他の方法で細胞が除
去されたものである。透明にしたＴＣＦは濃縮すること
ができる。この条件でカラムの容量を決定し、この容量
またはそれ以下まで充填を行った。次いで平衡化緩衝液
でカラムを洗滌した後、イオン交換法における典型的な
方法でイオン強度を増加させることによりカラムを溶出
させる。この場合条件はｐＨ４．６、酢酸ナトリウム
０．０１モル、ＮａＣｌ ０．２７モルであった（即ち
塩の濃度を上昇させた）。
的なイオン交換法である。即ち或る特定のｐＨおよびイ
オン強度において陽イオン交換カラムを平衡状態に保
つ。イオン交換マトリックスはＳ−セファロース(R)で
あり、これはファルマシア（Ｆａｒｍａｃｉａ）社製の
表面をスルフォプロピル変性されたアガロースである。
所望の蛋白質を含む水性供給溶液（透明にしたＴＣＦ）
を同じ条件に調節し（ｐＨ４．６、酢酸ナトリウム０．
０１モル）、カラムに供給する。ＴＣＦは細胞培養器か
ら得られた培養液である。これは炭水化物、塩、アミノ
酸、蛋白質、他の細胞成長因子、および細胞を含んでい
る。透明にしたＴＣＦは濾過または他の方法で細胞が除
去されたものである。透明にしたＴＣＦは濃縮すること
ができる。この条件でカラムの容量を決定し、この容量
またはそれ以下まで充填を行った。次いで平衡化緩衝液
でカラムを洗滌した後、イオン交換法における典型的な
方法でイオン強度を増加させることによりカラムを溶出
させる。この場合条件はｐＨ４．６、酢酸ナトリウム
０．０１モル、ＮａＣｌ ０．２７モルであった（即ち
塩の濃度を上昇させた）。
【００１３】この方法を用い、抗体の回収率は＞８５％
であり、その純度は約１５％であった。この方法におけ
る次の工程は、さらに精製を行うために陰イオン交換材
料（例えばＱ−セファロース(R)）を用いる方法であろ
う。
であり、その純度は約１５％であった。この方法におけ
る次の工程は、さらに精製を行うために陰イオン交換材
料（例えばＱ−セファロース(R)）を用いる方法であろ
う。
【００１４】この場合塩の濃度が高い状態で行われるＳ
−セファロース(R)の溶出には新しい工程（塩の減少ま
たは除去）を付加することが必要であるが、それによっ
て蛋白質の損失が多くなると期待される。これは望まし
くないことである。
−セファロース(R)の溶出には新しい工程（塩の減少ま
たは除去）を付加することが必要であるが、それによっ
て蛋白質の損失が多くなると期待される。これは望まし
くないことである。
【００１５】そこで上記の溶出法（イオン強度を変化さ
せる方法）を使用する代わりに、イオン強度を増加させ
ないでｐＨを増加させる洗滌および流出条件を考察する
ことにした。
せる方法）を使用する代わりに、イオン強度を増加させ
ないでｐＨを増加させる洗滌および流出条件を考察する
ことにした。
【００１６】本発明において驚くべきことには、特定の
実施例で大部分の不純物（この例では大部分はアルブミ
ン）を洗滌して除去し得る一組の条件が見出だされた。
他の工程において再びｐＨを上昇させると抗体を流出さ
せることができた。従ってこの例においては或る初期ｐ
Ｈ値で抗ＴＮＦを充填し、次いで異なったｐＨ値（この
場合は前の値よりも高い値）で洗滌し、さらに異なった
第３のｐＨ値（この場合には最高値）で溶出を行うこと
ができた。
実施例で大部分の不純物（この例では大部分はアルブミ
ン）を洗滌して除去し得る一組の条件が見出だされた。
他の工程において再びｐＨを上昇させると抗体を流出さ
せることができた。従ってこの例においては或る初期ｐ
Ｈ値で抗ＴＮＦを充填し、次いで異なったｐＨ値（この
場合は前の値よりも高い値）で洗滌し、さらに異なった
第３のｐＨ値（この場合には最高値）で溶出を行うこと
ができた。
【００１７】驚くべきことにはカラムを中間のｐＨ値で
平衡化して充填を行うと、蛋白質の結合は殆どまたは全
く起こらないことが見出だされた。正確な機構は明らか
ではないが、異なったｐＨ条件における蛋白質のコンフ
ォーメーションの変化が結合に影響するものと考えられ
る。本発明における例の場合、抗ＴＮＦは最低のｐＨの
場合にイオン交換マトリックスと容易に結合するような
コンフォーメーションの変化を起こすと考えられる。中
間のｐＨではこのｐＨによって生じたコンフォーメーシ
ョンの変化のために、結合していない蛋白質は結合部位
が阻害されるようなコンフォーメーションをとることが
できる。しかし抗ＴＮＦが既にマトリックスと結合して
いる場合には、中間のｐＨにおいてもコンフォーメーシ
ョンは変化することができないであろう。
平衡化して充填を行うと、蛋白質の結合は殆どまたは全
く起こらないことが見出だされた。正確な機構は明らか
ではないが、異なったｐＨ条件における蛋白質のコンフ
ォーメーションの変化が結合に影響するものと考えられ
る。本発明における例の場合、抗ＴＮＦは最低のｐＨの
場合にイオン交換マトリックスと容易に結合するような
コンフォーメーションの変化を起こすと考えられる。中
間のｐＨではこのｐＨによって生じたコンフォーメーシ
ョンの変化のために、結合していない蛋白質は結合部位
が阻害されるようなコンフォーメーションをとることが
できる。しかし抗ＴＮＦが既にマトリックスと結合して
いる場合には、中間のｐＨにおいてもコンフォーメーシ
ョンは変化することができないであろう。
【００１８】本明細書において異なったｐＨという言葉
は、本明細書および特許請求の範囲の中間的な洗滌工程
に適用される場合、蛋白質（例えば下記実施例の抗ＴＮ
Ｆ単クロー抗体）が遊離のまたは結合していない状態に
あるときにはイオン交換材料（例えばＳ−セファロース
(R)）に結合せず、また既に結合しているときには同じ
イオン交換材料から溶出されないｐＨを意味するものと
する。
は、本明細書および特許請求の範囲の中間的な洗滌工程
に適用される場合、蛋白質（例えば下記実施例の抗ＴＮ
Ｆ単クロー抗体）が遊離のまたは結合していない状態に
あるときにはイオン交換材料（例えばＳ−セファロース
(R)）に結合せず、また既に結合しているときには同じ
イオン交換材料から溶出されないｐＨを意味するものと
する。
【００１９】
実施例 １ Ｓ−セファロース(R)（ファルマシア社製）カラムをｐ
Ｈ４．６において０．０１モルの酢酸ナトリウムと平衡
に保つ。抗ＴＮＦ含有溶液（ＴＣＦ）を下記に説明する
ようにしてカラムに充填する。この溶液を水で希釈する
（ＴＣＦ２部に対して水約１部）。希釈してＴＣＦのｐ
Ｈを１モルの酢酸で４．６に調節する。２８０ｎｍにお
ける吸収率（Ａ280）を測定し、カラム１ｍｌ当たり２
０Ａ280単位を充填する。これらの実施例においてＡ280
の値として１を与える蛋白質の濃度を１ｍｌ当たり１単
位として定義した。溶出液の吸収率がベースラインに戻
るまでカラムを平衡化緩衝液で洗滌する。次いでカラム
をｐＨ５．５において０．０１モルの酢酸ナトリウム、
０．０５モルの塩化ナトリウムで洗滌する。若干の蛋白
質が溶出する。カラムをＡ280がベースラインに戻るま
で洗滌する。最終工程において溶液のｐＨ５．５で抗体
が溶出する。抗体の回収率は９０％、純度は３０％であ
った。
Ｈ４．６において０．０１モルの酢酸ナトリウムと平衡
に保つ。抗ＴＮＦ含有溶液（ＴＣＦ）を下記に説明する
ようにしてカラムに充填する。この溶液を水で希釈する
（ＴＣＦ２部に対して水約１部）。希釈してＴＣＦのｐ
Ｈを１モルの酢酸で４．６に調節する。２８０ｎｍにお
ける吸収率（Ａ280）を測定し、カラム１ｍｌ当たり２
０Ａ280単位を充填する。これらの実施例においてＡ280
の値として１を与える蛋白質の濃度を１ｍｌ当たり１単
位として定義した。溶出液の吸収率がベースラインに戻
るまでカラムを平衡化緩衝液で洗滌する。次いでカラム
をｐＨ５．５において０．０１モルの酢酸ナトリウム、
０．０５モルの塩化ナトリウムで洗滌する。若干の蛋白
質が溶出する。カラムをＡ280がベースラインに戻るま
で洗滌する。最終工程において溶液のｐＨ５．５で抗体
が溶出する。抗体の回収率は９０％、純度は３０％であ
った。
【００２０】比較例 実施例１と同じ透明にしたＴＣＦを原料として使用し
た。しかし今回はＳ−セファロース(R)カラムをｐＨ
５．５において０．０１モル酢酸ナトリウム、０．０５
モル塩化ナトリウムを用いて平衡に保った。また実施例
１と同様にしてＴＣＦを希釈したが、１モルの酢酸でｐ
Ｈ５．５に調節した。カラムの充填は実施例１記載の通
りである。２８０ｎｍにおける吸収率がベースラインに
戻るまでカラムを洗滌する。流出は実施例１と同じであ
る。抗体の回収率は僅かに１０％であった。残りの抗体
は結合しない部分として存在していると考えられる。
た。しかし今回はＳ−セファロース(R)カラムをｐＨ
５．５において０．０１モル酢酸ナトリウム、０．０５
モル塩化ナトリウムを用いて平衡に保った。また実施例
１と同様にしてＴＣＦを希釈したが、１モルの酢酸でｐ
Ｈ５．５に調節した。カラムの充填は実施例１記載の通
りである。２８０ｎｍにおける吸収率がベースラインに
戻るまでカラムを洗滌する。流出は実施例１と同じであ
る。抗体の回収率は僅かに１０％であった。残りの抗体
は結合しない部分として存在していると考えられる。
【００２１】以上本発明の説明を行ったが、蛋白質精製
の専門家は多くの変形を考えることができよう。従って
上記実施例は単に例示のためであり、本発明の範囲は特
許請求の範囲記載の事項によってのみ限定されるもので
ある。
の専門家は多くの変形を考えることができよう。従って
上記実施例は単に例示のためであり、本発明の範囲は特
許請求の範囲記載の事項によってのみ限定されるもので
ある。
【００２２】本発明の主な特徴及び態様は次の通りであ
る。 １．（ａ）蛋白質の結合を容易にするような水溶液の第
１のｐＨにおいて蛋白質をイオン交換材料に結合させ、
（ｂ）洗滌溶液のｐＨを蛋白質を溶出させない第２の前
とは異なったｐＨにして結合した蛋白質を洗滌し、
（ｃ）溶出溶液のｐＨを溶出を容易にする第３のｐＨに
して蛋白質を溶出させる工程から成る水溶液中の蛋白質
を精製する方法。
る。 １．（ａ）蛋白質の結合を容易にするような水溶液の第
１のｐＨにおいて蛋白質をイオン交換材料に結合させ、
（ｂ）洗滌溶液のｐＨを蛋白質を溶出させない第２の前
とは異なったｐＨにして結合した蛋白質を洗滌し、
（ｃ）溶出溶液のｐＨを溶出を容易にする第３のｐＨに
して蛋白質を溶出させる工程から成る水溶液中の蛋白質
を精製する方法。
【００２３】２．蛋白質が抗体であり、各溶液のイオン
強度を実質的に変化させてすべての工程を行う上記第１
項記載の方法。
強度を実質的に変化させてすべての工程を行う上記第１
項記載の方法。
【００２４】３．抗体が腫瘍壊死因子と結合する上記第
２項記載の方法。
２項記載の方法。
【００２５】４．ｐＨ約４．６において抗体をイオン交
換材料と結合させ、ｐＨ約５．５で洗滌工程を行い、ｐ
Ｈ約６．５で溶出工程を行う上記第３項記載の方法。
換材料と結合させ、ｐＨ約５．５で洗滌工程を行い、ｐ
Ｈ約６．５で溶出工程を行う上記第３項記載の方法。
【００２６】５．或る与えられたｐＨにおいて蛋白質を
イオン交換材料と結合させる最初の工程、および他のｐ
Ｈにおいて該蛋白質を溶出させる最終工程を用いる蛋白
質の精製法において、不純物を溶出させるが蛋白質を実
質的には溶出させないｐＨにおいて中間的な洗滌を行う
工程を含む改良法。
イオン交換材料と結合させる最初の工程、および他のｐ
Ｈにおいて該蛋白質を溶出させる最終工程を用いる蛋白
質の精製法において、不純物を溶出させるが蛋白質を実
質的には溶出させないｐＨにおいて中間的な洗滌を行う
工程を含む改良法。
【００２７】６．蛋白質が抗体であり、最初の工程から
最終工程に至るに従いｐＨを増加させて行く上記第５項
記載の方法。
最終工程に至るに従いｐＨを増加させて行く上記第５項
記載の方法。
【００２８】７．抗体が腫瘍壊死因子と結合する上記第
６項記載の方法。
６項記載の方法。
【００２９】８．抗体は細胞系ＨＢ９７３６から抽出さ
れたものである上記第７項記載の方法。
れたものである上記第７項記載の方法。
【００３０】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭62−22724（ＪＰ，Ａ) 社団法人日本生化学会編，新生化学実 験講座１ タンパク質▲Ｉ▼−分離・精 製・性質−，株式会社東京化学同人, 1990年２月26日，ｐ．172−175 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07K 1/00 - 1/36 ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (2)
- 【請求項１】 （ａ）蛋白質の結合を容易にするような
水溶液の第１のｐＨにおいて蛋白質をイオン交換材料に
結合させ、 （ｂ）洗滌溶液のｐＨを蛋白質を溶出させない第２の前
とは異なったｐＨにして結合した蛋白質を洗滌し、 （ｃ）溶出溶液のｐＨを溶出を容易にする第３のｐＨに
して蛋白質を溶出させる工程から成ることを特徴とする
水溶液中の蛋白質を精製する方法。 - 【請求項２】 或る与えられたｐＨにおいて蛋白質をイ
オン交換材料と結合させる最初の工程、および他のｐＨ
において該蛋白質を溶出させる最終工程を用いる蛋白質
の精製法において、不純物を溶出させるが蛋白質を実質
的には溶出させないｐＨにおいて中間的な洗滌を行う工
程を含むことを特徴とする改良法。
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