DE2337312A1 - Verfahren zur isolierung und reinigung von dehydrogenasen - Google Patents

Description

Patentanwälte Dipl. -I* g. H Wlick .jann,

Dipl.-Ing. H.Weickmann.-Dipl.-Phys. Dr. K. Fincke Dipl.-Ing. F. A.¥eickmann, Dipl.-Chem. B. Hober

8 MÜNCHEN 86, DEN HKVi POSTFACH 860820

int Nr 1894. möhlstrasse 22, rufnummer 983921/22

BOEHRINGER MANNHEIM GIiBH, 68 Mannheim, Sandhofer Straße 112-132

Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Dehydrogenasen

Dehydrogenasen spielen eine bedeutende Rolle in vielen enzymatisch-analytisehen Prozessen. Insbesondere werden NADP-abhängige Enzyme wie die Glueose-6-Phosphat-Dehydrogenase (G6P-DH) für die im klinischen Labor sehr bedeutende Bestimmung der Glucose eingesetzt. Es besteht danach ein Bedarf nach einfachen Isolierungsmethoden für die genannten Enzyme.

Im wesentlichen werden zwei Methoden zur enzymatischem Bestimmung der Glucose angewandt. Pur den Routinegebrauch im klinischen Labor hat sich das Verfahren mit Glueose-Oxydase und einer HoCU-visualisierenden Farbreaktion bewährt.

Für höchst Genauigkeitsansprüche jedoch verwendet man bevorzugt die Enzyme Hexokinase und Glucose-ö-Fhosphat-Dehydrogenase (Ki.ehe z.B. H.U. Dergmoyer, E. Bernt, F. Schmidt und H. Stork, in H.U. Bergmivv-er Methoden der enzymabischen Analyse, 2. Auflage, 1970, Seite 1163). Die Bestimmung des Blur.zuckers

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nach dieser Methode erfordert jedoch Enzyme hoher Reinheit. So stören insbesondere folgende enzymatisch^ Verunreinigungen: 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase (6-PGDH), Phosphogluco-Mutase (PGIuM), Hexokinase (HK), Phosphoglucose-Isomerase (PGI) und Glutathion-Reduktase (GR). Ihre Anwesenheit würde unkontrollierbar die Glueose-Änalysenwerte verfälschen. Enthält die zu analysierende Probe, z.B. menschliche Serum, ATP und Glucose neben G6P, so ist eine genaue Analyse beider Substrate nicht nebeneinander möglich, wenn die G6P-DH mit Hexokinase verunreinigt ist. Vergleichbare Schwierigkeiten ergeben sich bei Anwesenheit der anderen erwähnten Fremdenzyme in der G6P-DH, wie von z.B. PGI, da hier Fructose mitreagieren würde, GR, da das Glutathion in der Probe mit erfaßt würde, 6-PGDH, da sie mit dem Reaktionsprodukt der GöP-BeStimmung weiterreagieren und zu hohe Werte vortäuschen würde.

Die Beseitigung der genannten Fremdaktivitäten erfordert einen Isolierungsprozeß, der aufwendig und teuer ist. So werden in den von L. Glaser u. D.H.Brown, J.B.C. 216,67 (1955) publizierten Verfahre*: zur Reinigung der G6P-DH aus Hefe folgende Schritte angewandt: Autolyse, Protamin-Fällung, Ammonsulfatfrakt.ionierung, Dialyse, Calcium-Phosphat-Gel-Adsorption, Dialyse, Äthanol-Fraktionierung, Aluminiumoxyd-Adsorption, Stärke-Cellit-Adsorption, Ammonsulfat-Abtrennung, Ribonucleinsäure. Jedoch gelang es mit diesen Verfahren nicht, Restspuren von Hexokinase zu beseitigen. Zusätzlich waren die Ausbeuten gering (19 i>). S.A. Kuby, E.A. Noldman (in Meth. in Enzym. Band 9, 1969, Seite 160) publizierten ebenfalls ein äußerst aufwendiges Verfahren (s. auch J. Biol. Chem. J56, 1225 (1961)), das über 17 Stufen mit geringer Ausbeute zu einem anscheinend reinen Präparat führt. Bei diesem Verfahren wird zuerst ein Hefeextrakt hergestellt, es folgt dann eine Ammonsulfat(A3^Fraktionierung, anschließend eine Silbernitrat-Fällung, eine Extraktion mit

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Äthylendiamintetraessigsäure (EDTA), eine erneute Aminonsulfat-Fraktionierung. Nach der Dialyse erfolgt eine Äthanol-Fraktionierung, eine Bentonit-Adsorption, eine erneute AS-Fraktionierung und nachfolgende Dialyse, anschließend erfolgt eine Aceton-Fällung, eine erneute Ammonsulfat-Fällung; nach einer Dialyse schließen sich eine DEAE-Cellulose-Adsorption, eine Dialyse und eine zweite DEAE-Cellulose-Adsorption, eine Ammonsulfat-Fällung, eine Sulfat-Fraktionierung und drei Umkristallisationen an. Dieses Verfahren ist nicht nur außerordentlich umständlich und aufwendig, sondern es läßt sich auch nicht in beliebig großen Ansätzen in technischem Maßstab durchführen« Keines der genannten Verfahren war in der lage, das Bedürfnis nach einem einfachen, reproduzierbaren Anreicherungsverfahren für G6P-DH zu befriedigen. Insbesondere war es auch nicht möglich, die beiden Enzyme G6P-DH und HK aus ein- und demselben Ansatz zu isolieren.

Zur Beseitigung der oben aufgeführten Schwierigkeiten und Nachteile hat man auch bereits versucht, Dehydrogenasen nach dem Prinzip der Affinitätschromatographie zu reinigen. Ein derartiges Verfahren, welches die Wechselwirkung zwischen Coenzym und Enzym ausnützt, indem an einem festen Träger das Coenzym des zu reinigenden Enzyms fixiert wird, wurde für die Dehydrogenasen von CR. Lowe und P.D.G. Dean in FEBS-Letters 14 0971) Seite 313 beschrieben. Die Anwendung dieses Verfahrens auch für die Reinigung von -G6P-DH wird in der DT-OS 2 206 636 vorgeschlagen. Bei diesem Verfahren wurde jedoch nur eine etwa 20-fache Auf reinigung erzielt (vgl. J. D.. Hocking und J.I. Harris in Biochem. J. 1972). Dieses Verfahren bringt bereits einen gewissen Fortschritt, ein wirklich einfaches Verfahren zur Reinigung der Dehydrogenasen wird dadurch jedoch immer noch nicht geschaffen, da die erzielbare Anreicherung viel zu gering ist, um zu hochreinen Enzymen zu ge-

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langen und daher stets die bekannten älteren umständlichen Methoden noch zusätzlich angewandt werden mußten.

Aufgabe der Erfindung ist es, die oben geschilderten Nachteile zu beseitigen und ein äußerst wirksames und einfaches Verfahren zur Reinigung der Dehydrogenasen, insbesondere der G6P-DH zu schaffen, welches es gestattet, zu den für diese Zwecke erforderlichen hohen Reinheitsgraden der Enzyme in wesentlich einfacherer Weise zu gelangen und damit diese Enzyme einer vielfältigeren und verbreiteteren Anwendung zuzuführen.

Erfindungsgemäß besteht ein Verfahren zur Abtrennung und Reinigung von NADP-abhängigen !Dehydrogenasen wie G6P-DH unter Anwendung der Affinitätschromatographie darin, daß als Affinitätsmaterial ein an einen festen Träger gebundenes Nucleotid mit einer Phosphatgruppe in 2'- oder 3'-Stellung verwendet wird.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht in einem einzigen Schritt eine außerordentlich hohe Anreicherung bis zum 700-fachen. Da mit dem natürlichen Coenzym, welches als die weitaus günstigste Akzeptorgruppe an einem Träger angesehen werden mußte, nur Anreicherungen bis zum 20-fachen gelangen, ist dieses Ergebnis äußerst überraschend, da mit einer Akzeptorgruppe, welche dem natürlichen Coenzym relativ ferne steht, wie .sie erfindungsgemäß zur Anwendung kommt, ein wesentlich schlechteres Ergebnis erwartet werden mußte als mit dem natürlichen Coenzym als Akzeptor, welches eine maximale Affinität zu seinem Apoenzyra aufweist und eine Ablösung vom Affinitätschromatographiematerial gestattet, bei welcher eine Inaktivierung des Enzyms nicht besorgt werden muß.

Als Trägermaterial wird im Rahmen der Erfindung sowohl ein

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natürliches als auch ein synthetisches Material verwendet. Bevorzugt werden jedoch hydrophile Tragermaterialien, wie beispielsweise Polyacrylamid, Polymere mit freien Hydroxylgruppen wie Cellulose, Stärke, Dextran, Agarose und deren chemische Abwandlungsprodukte, Polyvinylalkohol sowie insolubilisierte Proteine. Auch Polyamide, Polyester und Polystyrolderivate sind brauchbar, desgleichen anorganische Trägermaterialien, wie z.B. Glas. Das Trägermaterial kann in Form von Perlen oder Granulaten, als Gewebe oder eingebettet in Stützmaterialien vorliegen. Sehr gute Ergebnisse werden mit einem Trägermaterial in Form permeabler Perlen oder Granulate erzielt, die sowohl in einer Säule als auch im Batch-Verfahren eingesetzt werden können. Besonders bevorzugtes Trägermaterial sind vernetztes Dextran und Agarose.

Die im erfindungsgemäßen Verfahren als Akzeptor verwendete Gruppierung besteht aus einem Nucleotid mit einer Phosphatgruppe in Stellung 2' oder 3¹. Diesen Verbindungen kommt nachstehende Formel zu

-CH₀ Base
^ά 0

HO

PO₃H₂

Die Bindung dieses AkKeptormolcküls kann sowohl über die CHp-Gruppe des Zuckers als auch über die Base erfolgen. Die Bindung kann direkt erfolgen oder unter Zwischenschaltung einer weitoron bindenden Gruppierung. Die Art dieser Bindun-

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gen ist für das Prinzip des erfindungsgemäßen Verfahrens unwichtig, kann jedoch im Einzelfall das Ergebnis des Verfahrens in gewissem Umfang beeinflussen. TJm daher in einem speziellen Fall eine optimale Anreicherung eines bestimmten Enzyms zu erzielen, ist es zweckmäßig, verschiedene Bindungsarten auf die beste Anreicherungswirkung auszuprobieren.

Als Base können im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens innerhalb der Akzeptor gruppierung sowohl die natürlichen in Nucleotiden vorkommenden Basen wie Uridin, Guanosin, Adenosin, Thymidin, Cytidin, Xanthin, Methylxanthin und dgl. als auch deren substituierte Derivate oder Homologe verwendet werden.

Zur Bindung des Akzeptors an den Träger können die bekannten chemischen Verknüpfungsmethoden angewendet werden. Die Art der Fixierung ist nicht Gegenstand der Erfindung. Geeignete bekannte Methoden sind beispielsweise Aktivierung mit BrCN, Kupplung mit p-Aminophenylgruppierung, mit Aminocapronsäure, Aminoäthylamidobernsteinsäure usw.

Andere Beispiele für bekannte Kupplungsmethoden zur Bindung des Akzeptors an den Träger sind die Einführung von Azidgruppen oder Chlortriazinylgruppferungen in den Träger, die anschließend mit dem Akzeptor umgesetzt werden. Bei Aminogruppen- bav/. Carboxylgruppen-haltigen Trägermaterialien kann beispielsweise auch eine Kupplung unter Verwendung von Carbödiimiden erfolgen.

Wie oben erwähnt, eignet sich das Verfahren der Erfindung zur Abtrennung und Reinigung der NADP-abhängigen Dehydrogenasen. Unter NADP-abhängigen Dehydi'ogenasen werden dabei ira Ralfen

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der vorliegenden Erfindung auch solche Dehydrogenasen verstanden, die nicht alleine von IABP, sondern auch von NAD abhängig sein können. Beispiele für NADP-abhängige Dehydrogenasen, die erfindungsgemäß gereinigt werden können; sind außer G6P-DH, die bevorzugt wird, Glutamatdehydrogenase, Isocitratdehydrogenase, Glutathion-Reduktase, Glycerinäldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase, e-Phosphogluconsäure-Dehydrogenase, Lactat-Dehydrogenase und Malat-Dehydrogenase.

Die verschiedenen HADP-abhängigen Dehydrogenasen v/eisen überraschenderweise zu den verschiedenen erfindungsgemäß verwendbaren Akzeptoren unterschiedliche Affinität auf, so daß die Erfindung auch eine Auftrennung der einzelnen NADP-abhängigen Dehydrogenasen untereinander ermöglicht. Die Dehydrogenasen, die erfindungsgemäß isoliert und gereinigt werden können, umfassen rohe Enzymextrakte und Enzymgemische, die aus tierischen, pflanzlichen oder mikrobiologischen Geweben stammen.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird vorzugsweise so durchgeführt, daß eine Lösung, die die gesuchte Dehydrogenase enthält, beispielsweise als Bestandteil eines Enzym- oder Proteingemisches, durch eine Säule passieren gelassen wird, die mit dem erfindungsgemäßen Chromatographiematerial gefüllt ist. Nach dem Waschen der Säule zur Entfernung unerwünschter Begleitstoffe werden dann die adsorbierten Enzyme durch Elution entfernt, wobei vorzugsweise Pufferlösungen mit steigender lonenstärke eingesetzt werden, also eine Gradientenelution. Besonders gute Ergebnisse wurden mit anorganischen Phosphatpufferlösungen erhalten, geeignet sind jedoch auch andere Pufferlösungen, welche keine Denaturierung des gewünschten Enzyms hervorrufen können. Geeignet sind ferner auch Neutralsalzlösungen, beispielsweise Lösungen von Natriumchlorid oder Ammoniumsulfat. Die Elution ist schließlich auch mit dem Coenzym, Substrat oder einem Inhibitor durchführbar. Das Verfah-

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ren der Erfindung kann jedoch auch durch Adsorption und EIution in Batch durchgeführt werden.

Wie bereits erwähnt, gestattet das Verfahren der Erfindung eine außerordentlich weitgehende Reinigung und Anreicherung der gewünschten Enzyme in einem einzigen Verfahrensschritt. Das Verfahren der Erfindung ist außerordentlich spezifisch und unkompliziert und rasch durchführbar. Da bis zu viel-100-fache Reinigungen in einem einzigen Schritt möglich sind, genügt zumeist eine einzige Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, um zu einem für praktische Zwecke ausreichend reinen Enzympräparat zu gelangen. Pur besondere Zwecke kann jedoch die erfindungsgemäße Behandlung wiederholt werden, zweckmäßig unter Verwendung verschiedener Affinitätschromatographiematerialien, wobei sowohl der Träger als auch die Akzeptorgruppe variiert werden können. Es ist schließlich auch möglich, erfindungsgemäß gereinigte Dehydrogenasen auch nach den bekannten IPeinreinigungsmethoden für die derartige Enzyme noch weiter zu reinigen.

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Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung v/elter. In diesen Beispielen werden die nachstehend aufgeführten Abkürzungen verwendet:

APUT = 5'(p~Amino-phenyl-phosphoryl)-Uridin-2· (3')-phosphat APGP = 5'(p-Amino-phenyl-phosphoryl)-Gaanosin-2'(3')-phosphat APAP = 5'(p-Amino-phenyl-phosphoryl)-Adenosin-2'(3^f)-phosphat APG- = 5^!(p-Aiiiino-phenyl-phosphoryl)-(Tuanosin APA = 5'(p-Amino-phenyl-phosphoryl)-Adenosin O-AD-A-5-MP = 8-Amino-äthylamino~adenosin-5'-phosphat B ACS--APG = APG- gekuppelt an --amino-caproneäure GT)A-APG- = APG gekuppelt an y^ee-amino-äthyl-amido-bernsteinsäure

8-IIMD-A-5-KP = 8-Amino~hexyl-amino-adenosin"!5'-phosphat B 8-HMD-A-2,5-DP = 8-Amino-hexyl-amino-adenoöin-2'(3'),5'-phosphat B GlDH = Glutamät-Dehydrogenase
ICDH = Isocitrat-Dehydrogenase
GR = Glutathion-Reduktase

GAPDH = Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase ^e J- H h D - A - V , LDH = lactat-Dehydrogenase
MDH = Malat-Dehydrogenase
PGK = 3-Phosphoglycerat-Kinase
HK = Hexokinase
GK = Glycerokinase
AS = Amrnoniumsulfat
CK = Creatinkinase
I4K ■= Myokinase
PK = Pyruvatkinase

Die Schreibweise Base-2'(3')-phosphat bedeutet, daß die Phosphatgruppe in 2¹- oder 3'-Stellung steht, die genaue Stellung

nachträglich
geändert

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jedoch nicht bestimmt wurde. Vermutlich liegen Gemische vor. B = Akzeptor über Stellung 8 der Base an den Träger gebunden.

Beispiel 1

A. Herstellung des Affinitätsadsorbens:

500 g abgesaugte Agarose (Sepharose 4Bd, Ea. Pharmacia, Uppsala) werden in 500 ml dest. Wasser auf ge.schlämmt. Daneben v/erden 50 g Bromcyan in dest. Wasser gelöst. Die Agarose wird dann mit 5 IT NaOH auf pH 11 eingestellt und das gelöste Bromcyan wird zugegeben. Durch Zusatz von 5 N Natronlauge wird der pH bei ca. 11 über 10 min gehalten. Danach wird die aktivierte Agarose abgesaugt und mit 0,5 M eiskalter K₂HPO.-Lösung gründlich gewaschen. Sie wird anschließend mit dem zu fixierenden Akzeptor (5 g in .1 000 ml 0,5 M K₂HPO.) bei pH 9 über Nacht bei 4⁰C gekuppelt. Der fertige Träger wird schließlich mit jeweils ca 1 1 0,5 M K₂HPO., dest. Wasser, 0,1 M Essigsäure, dest. Wasser, 1,0 M NaCl und dest. Wasser inhibitorfrei gewaschen. Der Gehalt des so dargestellten Affinitätsadsorbens beträgt zwischen ca. 5 und 10 μΜοΙ Akzeptor pro g auf einer Fritte abgesaugten Gels.

B. Adsorption von G—6-P-DH aus dein Hefe-Autolysat:

Ausgehend von 285 g Trockenhefe wurde der durch AS-Fraktionierung bei einer AS-Konzentration von 1,6 - 2,6 M erhaltene Niederschlag gelöst und gegen Wasser dialysiert. Zu 500 ml Dialysat mit einer spezifischen G6P-DH-Aktivität von 0,6 wurden anschließend 25 g APGP-Agarose, hergestellt gemäß A. unter Verwendung von APGP als Akzeptor, gegeben. Nach 20-minütigem Rühren wurde abgesaugt. Der Überstand enthielt noch 8,6 ^

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der eingesetzten G-6-P-DII. Nach Waschen des Adsorbens mit 0,4 M Kochsalzlösung vrardei;· anschließend 60 # der G-6-P-DH bei einem pH von 7,6 mit 0,5 M Phosphat eluiert. Erhalten wurde eine spezifische Aktivität von 96. Das Enzym enthielt noch folgende Fremdaktivität en:

ADH 0,26 #, HK 0,22 %_t PGIuM 0,02 fo, PGI 0,12■ #, GR 0,37 #, 6PGBH 1,46 ?S.

Beispiel 2

Chromatographie von G-6-P-DH aus dem Hefe-Autolysat nach einer positiven AS-Fällung:

Ausgehend von 950 g Trockenhefe vmrden nach 5 Std. Gärung der v/ie in Beispiel 1 B. beschrieben erhaltene Niederschlag der Ammonsulfatfällung geüst und gegen Wasser dialysiert. Das Dialysat v/urde auf 5 1 (20 mg Protein/ml) verdünnt und über 150 g APGP-Agaröse chromatographiert. Nach Viaschen mit 0,4 H Kochsalzlösung vmrde die G-6-P-DH mit 1 H Ammoneulfatlösung eluiert in einer Ausbeute von ca. 80 5$ mit einer ßx>ezi.fifichen Alctivität von 420 und mit folgendem Gehalt an Prcmdaktivitäten: 6PGDH 0,04 ?», PGI 0,01 #, HK 0,08 $>_t GR 0,01 i>_% PGIuM 0,01 #, 0_}01 %.

Nachstehende Tabelle faßt die Ergebnisse zusammen:

Schritt speK. Alct. Ausbeute an Reinigungs

Ai.tivität in io faktor

Autolyse
AS-Praktion i (O'

0,6 100

ßv.· ?.'!··Ιο Α 20 00 700

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Beispiel 3 (Vergleichsbeispiel)

Die folgende Tabelle enthält die Ergebnisse des Verfahrens zur Isolierung der G-6-P-DH nach S.A. Kuby und E.A. Noltmann, Kolowick-Kaplan, Methods in Enzymology, Band _9, (1966) 116 f.

Schritt	spez. Aktivität	16	Ausbeute an Aktivität in #	Reiiu gungs- faktor
Autolyse	O,	20	100
AS-Fraktionierung	O,	5	90	1,2
Silbernitrat- Fällung, Extrak tion des Nieder schlags	0,	7	70	2,5
AS-Fraktionierung	o,		65	1,4
Äthanol-Fraktion.	13		56	18
Betonit-Adsorp.	22		46	1,7
AS-Fraktionierung	37		42	1,5
Ace ton-Fraktion.	71		34	2,1
AS-Fraktionierung	106		27	1,5
Dialyse, DEAE- Cellulose	160		23	1,5
AS-Fraktionierung	200		21	1,2
Verschiedene Kri s tallisationen	410	10

Beispiel 4

Isolierung der G-6-P-DH aus dem Hefe-Autolysat durch direkte Chromatographie:

500 g Trockenhefe wurden bei 37⁰C 20 Std. in 1,2 1 0,025 M bei pH 5 autolysiert. Das Autolysat wird mit 3,0 1

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eiskaltem Wasser verdünnt, nach Zusatz von 4,5 ?° Polyäthylenirain wird das Zentrifugat an 150 g APGP-Agarose chromatographiert. Erhalten wurden ausgehend von einer spezifischen Aktivität von ca. o,4 U/mg nach Elution mit 1 M Ammonsulfat-Lösimg in einer Ausbeute von 83 5^» 66 mg G-6-P-DII einer spezifischen Aktivität von 174. Anreicherung ca. 435-fach.

Beispiel 5

Isolierung der G--6-P-DH aus dem Frischhefeextrakt:

Die Frischhefe wird mit einer Glaskugel-Mühle aufgeschlossen. Aus 1,5 kg Frisehhefe, die in 10 1 Leitungswasser suspendiert wurden, wird nach Zusatz von 1 $ Polyathylenimin und Zentrifugation ein klares Zentrifugat erhalten. 6,5 1 dieses Zentrifugats wurden an einer 10Og APGP-Agarose enthaltenden Säule chroraatographiert. Nach gründlichem Waschen mit 0,4 M Kochsalzlösung wurden 84 $ der G-6-P-DH mit 1 M Ammonsulfat-Lösung elufert (50 mg, spez. Aktivität = 264). Das Präparat enthielt keine PGI, keine ADH, GR 0,1 $, HK 0,01 i> und 6PGDH 0,02 <?<>.

Analoge Ergebnisse wie in den vorhergehenden Beispielen wurden erhalten, wenn mit 0,1 M Citratpuffer pH 6, 1 M Kochsalzlösung, 0,3 M Magnesiumchloridlösung, 0,1 M Pyrophosphatpuffer pH6,5 oder 0,3 M Phosphatpuffer pH 7,6 eluiert wurde.

Beispiel 6

Dieses Beispiel zeigt die Adsorption der G6P-DH (spezifische Aktivität ca. 150) an Agarosen, die verschiedene Akzeptoren enthalten. Die Akzeptoren wurden alle nach der Bromeyan-Aktivierung gebunden. Die Beladung (Henge Akzeptor pro g Träger) betrug ca. 5 - 10 μΜοΐ/g. Es wurden jeweils 5 ml Enzymlösung

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mit einer Konsentration von 1 mg/ml eingesetzt. Zu dieser Enzymlösung wurden 500 mg akzeptorhaltige Agarose gegeben. Die nachstellende Tabelle zeigt die verwendeten Akzeptoren und die mit diesen erhaltenen Ergebnisse.

Akzeptor % gebunden

erfindungsgemäß	75
APUP	95
APGP	95
APAP	62
8-HMD-A-5-MP	97
8-HMD-A-2,5-DP
Vergleich	8
APG	0
APA	15
8-AD-A-5-MP	20
AGS-APG	20
GDA-APG

Die nicht erfindungsgemäßen Akzeptoren, die also keine Phosphatgruppe in Stellung 2' oder 3' enthalten, wie APG und APA sowie solche, bei denen die Phosphatgruppe in Stellung 5¹ steht, wie 8-AD-A-5-MP, ACS-APG und'GDA-APG sind, wie die obigen Ergebnisse zeigen, zur Reinigung der Dehydrogenasen ungeeignet.

Beispiel 7

Chromatographie von G6P-DH aus Hefedialysat an APUP-Agarose

3,2 1 Hefedialysat, erhalten wie in Beispiel 2 beschrieben, wurden auf 8 1 verdünnt (20 mg Protein/ml, 1,1.10^ U). Dieae

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lösung wurde an 0,5 kg APUP-Agarose cliromatograpliiert (Säulendimension 5 χ 32 cm), Eluiert wurde mit 0,25 M Phosphat, pH = 7,6. Ausbeute 200 mg zu 320 U/mg (entspricht 58 #).

Beispiel 8

Chromatographie von G6P-DH aus' Trockenhefe an APUP-Agarose

460 g Trockenhefe wurden in 1,2 1 0,2 M Natrium-Phosphat-Puffer 6 Std. bei 37⁰C und pH 6,5 autolysiert. Anschließend wurde mit Eiswasser 1:4 verdünnt und durch Zusatz von 1 % Polyäthylenimin wurden die Zellrückstände gefallt. Das Zentrifugat enthielt 3,1.1O^4- U (spezifische Aktivität 0,55). Nach dex* Verdünnung auf 21 1 wurde die Enzymlösung an 200 g APUP-Agarose chromatographiert. Die G6P-DH wurde nach Waschen mit 0,15 M Kochsalzlösung mit 0,25 M Phosphat, pH = 7,6 eluiert. Erhalten wurden 76 $> (223 mg, spezifische Aktivität = 105, 0,02 # HK, 0,04 % GR, 0,4 $ 6-PG-DII). Gesamtausbeute 42 mg der spezifischen Aktivität von 380, Anreicherung ca. 700-fach.

Beispiel 9

Chromatographie von G6P-DH aus Frischhefe an APUP-Agarose

1,5 kg Frischhefe wurden in 10 1 Wasser auf ge schlämmt und in einer Glasperlen-Mühle aufgeschlossen. Nach Zugabe von 1 S Polyäthylenimin und Abzentrifugation des Niederschlags wurde das Filtrat, das in 8,5 1 1.9.1Ο⁴ U = 100 % enthielt, an einer 200 g-APUP-Agaröse-Säule chromatogrnphiert. Das Eluat (0,25 M PO^, pH = 7,6) enthielt 91 % (265 mc, spezifische Aktivität = 63). Der Gehalt an Fremdaktivitäten betrug 6-PG-DH 0,33 #, HK 0,02 Jb, GR 0,03 $.

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Beispiel 10

Verschiedene NADP-abhängige Dehydrogenasen wurden an APGP-Agarose adsorbiert. Dabei wurden jeweils 500 mg der akzeptorhaltigen e zu 5 ml Enzymlösung mit einem Gehalt von 1 mg/ml gegeben. Nachstehende Tabelle zeigt die verwendeten Enzyme, die prozentuale Adsorption derselben an das Chroniatographiematerial unter vergleichbaren Bedingungen sowie die prozentuale Elution beim Waschen mit 0,05 M Kochsalz.

Enzyme # Adsorption unter Elution beim Waschen

vergleichbaren Be- mit 0,05 M Kochsalz dingungen

G6P-DH 95 0

6PG-DH 87 0

GlDH 87 0

IGDH 100 0

GR 95 5

GAPDH 99 14

MDH 99 5

Beispiel 11

Abtrennung von 6PG-DH als Fremdaktivität aus a-Glucosidase an HMD-A-2'(3^f)-Phosphat-Agarose

30 mg einer a-Glucosidase der spezifischen Aktivität 40 U/mg mit einem Gehalt von 0,52 # 6PG-DH als Verunreinigung wurden in 6 ml 0,1 M Citratpuffer pH 6,5 gelöst und diese Lösung auf einer 1x8 cm-Säule, enthaltend 6 g HMD-A-2' (3^f)-Ph.osphat-Agarose, chromatographiert. Die a-Glueosidase wird hierbei

nacmrüalteh
geändert

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nicht gebunden und findet sich beim Waschen der Säule mit zwei Säulenvolumina des Gitratpuffers in einer Ausbeute von 93,7 $ wieder. Der Gehalt an .6PG-DH beträgt 0,0017 1°.

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Claims (4)

1. Patentansprüche

   My Verfahren zur Abtrennung und Reinigung von NADP-abliängigen Dehydrogenasen, wie G6P-DH, unter Anwendung der Affinitätschromatographie, dadurch gekennzeichnet, daß als Affinitätschromatographiematerial ein an einen festen Träger gebundenes Nucleotid mit einer Phosphatgruppe in 2^f- oder 3'-Stellung verwendet wird.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Nucleotid Uridin-, Guanosin- oder Adenosin-2·(3¹)-phosphat verwendet wird.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein hydrophiles Trägermaterial verwendet wird.
4. 4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Trägermaterial fernetztes Dextran oder Agarose verwendet werden.

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