DE2061984B2 - Reagens zur Bestimmung der Lactat Dehydrogenase im Farbtest - Google Patents

Reagens zur Bestimmung der Lactat Dehydrogenase im Farbtest

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Description

3. Reagens nach Anspruch 2, bestehend aus 0,002 bis 0,01 Mol Kaliumphosphatpuffer, pH 7,0
1,5 g/l Serumalbumin,
6 g/1 NAD,
1 IU'ml Diaphorase,
5 bis 10 g/l Saccharose,
1 g/l Natriumazid.
l die eine NAD-Diapho-Srgu^£sTnbiese als lyophilisiLtes eToder eingefrorene Lösung vorhegende Mischung llt eine Diaphorase, die aus Clostridium cluyven ™ne^wird. Dieses bekannte Reagens ist nicht nor SuIr bedingt durch das AusgangsmatenaL aus dem !ff nianhorase hergestellt wird, sondern weist auch SeÄSnde Beständigkeit auf. Bekannt ist auch e ne ^hwemeherz-Diaphorase, die jedoch durch em auterordentlich umständliches Hersteuungsverfahren erhaltenwird und daher für ein routinemäßig emsetz-
Srist die Schaffung eines
und aus billigerem Ausgangsmatenal herge
20
35
Für die Bestimmung der Lactat-Dehydrogenase, insbesondere im Serum, hat sich der Farbtest von H οche 11 a und Weinhouse (Anal. Biochem., 13, S. 322 [1965]) zu einer Standardmethode entwickelt, die insbesondere Bedeutung hat für die Durchführung der Bestimmung in automatisierten Analysenvorrichtungen.
Durch Serum-Lactat-Dehydrogenase (LDH) wird die Oxydation von L-Lactat zu Pyruvat katalysiert, wobei gleichzeitig NAD (Nicotin-adenin-dinucleotid) zu NADH (reduziertes Nicotin-adenin-dinucleotid) reduziert wird. Diese Reaktion kann photometrisch im Ultravioletten gemessen werden. Vorteilhaft ist jedoch eine Meßwellen'änge im sichtbaren Bereich. Im obenerwähnten Farbtest wird daher in einer angekoppelten Reaktion mit Hilfe des Enzyms Diaphorase gebildetes NADH durch ein Tetrazoliumsalz (üblicherweise 3-p-N itrophenyl-2-p-jodphenyltetrazoliumchlorid = INT) oxydiert, wobei das Tetrazoliumsalz zum gefärbten Formazan reduziert, welches im Sichtbaren (500 nm) photometrisch bestimmt werden kann.
Die Bestimmung läßt sich durch folgende Gleichungen wiedergeben:
60
Serum-LDH
L(+)-Lactat + NAD < > Pyruvat + NADH
Die Hersiemms der im ernndungsgemaßen Reagens enthaltenen Schweineherz-Diaphorase erfolgt >m wesentSen indem homogenisierter Herzpreßruckstand STerdünnter Ammonsulfat-Lösung extrah.ert, aus A*m Fxtrakt die bei 1,6 bis 2,8 Mol ammo.isu.fai-SsHCh Fraktion gewonnen, nach Auflösen und Sahse zur Entfernung von Ammonsulfat mit PoIy-Siy enirnin versetzt, der Überstand wenige M.nuten auf vorzugsweise 75:C erhitzt und nach Entfernung des Niederschlags an schwachsaurem KationenausiLieraSbiert und durch Erhöhung der PuffersaSonzentration wieder eluiert w.rd Aus dem Eluat wtd das gewünschte Protein in üblicher Weise gewonnen, beispielsweise durch Ausfällung Auflosen Γη Sem für das Reagens gewünschten Puffer Zusatz von Stabilisatoren und gegebenenfalls NAD und Gefriertrocknung des so erhaltenen Reagens.
Als Kationenaustauscher wird vorzugsweise ein carboxymethyläthergruppentragendes drodimens,onalvernetztes Dextran verwendet, welches im Handel "^Pufferwird vorzugswe.se ein Kaliumphosphatpuffer pH 6,5 bis 7,3, verwendet. Bevorzugte Stabih-Ltoren sind Saccharose und Alkahazid, die zweckmäßig gemeinsam im Reagens enthalten sind. Eine bevorzugte Zusammensetzung des ernndungsgemaßen Reagens ist im Patentanspruch 2 und eine besonders bevorzugte Zusammensetzung im Patentanspruch 3
NADH + INT
Diaphorase
NAD + Formazan
Zur Durchführung dieses Farbtestes sind Reagenzienute aori gemachten Angaben »g/l« bzw. »IU/ml« beziehen sich auf das Reagens als Lösung bzw. eine trockene Pulvermischung, die bei Auflösung in der vorgeschriebenen Menge Lösungsmittel die angegebene Zusammensetzung aufweist.
Das erfindungsgemäße Reagens ist nicht nur aus billigerem und leichter zugänglichem Ausgangsmaterial und nach einfacherem Verfahren hergestellt, sondern besitzt überraschenderweise auch eine überlegene Haltbarkeit sowie allgemein günstige Gebrauchseigenschaften, wie insbesondere leichte Löslichkeit.
Um die überlegene Stabilität des erfindungsgemäßen Reagens gegenüber einem bekannten, handelsüblichen Reagens mit einem Gehalt an Diaphorase aus Cl. cluyveri zu zeigen, wurden beide Reagenzien auf ihre Lagerungsfähigkeit bei +40C als fertige Reagenslösungen untersucht. Zu bestimmten Zeitabständen wurde der NAD-Gehalt enzymatisch mit Alkohol-Dehydrogenase und der Diaphorase-Gehalt mit INT und NADH bei pH 8,8 und 37,°C gemessen. Die Messung erfolgte bei 492 nm. Als NADH-regenerierendes System wurden Laclat-Dehydrogenase, Lactat
und NAD verwendet. Die Ergebnisse zeigt die folgende
Tabelle.
Stabilität der fertigen Reagens-Lösungen
NAD/Diaphorase (Herz)
NAD/Diapborase (CL cluyveri)
Lagerung: +40C (Kühlschrank)
Test: NAD enzymatisch mit ADH
Diaphorase mit INT und NADH; pH = 8,8; 37°C; 492 μ (LDH; Lactat und NAD als NADH-regenerierendes System)
Lagerung NAD Erfindungsgemäßes Reagens Herz-Diaphorase Ol NAD Bekanntes Reagens
α. chrweri		 100 Diaphorase Vt
mg/ml 0/ U/ml la mg/ml 95 U/ml
Tage 5,12 /o 1,25 i 10% 100 3,86 90,5 0,22 ± 10 0Z0 100
5,19 100 1,19 95,5 3,68 75 0,21 95,5
J. 5,06 101 1,40 112 3,50 89 0,12 57
14 5,0 99 1,35 107 2,94 0,15 71
21 5,0 9i 1,14 91,5 3,44 0,10 47,5
27 98
Zur weiteren Untersuchung der Stabilität des erfindungsgemäßen Reagens wurde dieses als Lyophiiisat längere Zeit bei einer Temperatur von —33"C aufbewahrt. Als Indikator für die Stabilität diente die verbleibende Diaphorase-Aktivität pro Milliliter fertiger Reagenslösung, wozu 530 bis 550 mg Lyophiiisat in je 40 ml destilliertem Wasser gelöst wurden. Zur Aktivitätsbestimmung der Diaphorase wurde folgender Inkubatiorisansatz verwendet:
In die Küvette wird in folgender Reihenfolge einpipettiert:
0,1 Mol Lactat/0.1 Mol Trispuffer, pH 8,8 2,00 ml
INT-Lösung (625 mg/1) 0,30 ml
NAD-Lösung (1,5 g/250 ml 0,07 Mol Kaliumphosphat-Puffer, pH 7,4) 0,14 ml
LDH-Lösung (1 mg/ml; 360 U/mg) .... 0,01 ml
Start durch Zugabe von
NAD/Diaphorase-Reagens gemäß
Erfindung (1:10 verdünnt) 0,05 ml
Bei 37° C wird die Extinktionsdifferenz pro Minute bei 492 nrn abgelesen, im linearen Bereich der Kinetik wird gemittelt.
Zur Berechnung der Aktivität wird für INT ein Extinktionskoeffizient von 20,4 (cm* · μΜοΙ -1) eingesetzt. Folgende Ergebnisse wurden erhalten:
Lagerung bei +33°C
Tage
0
6
20
65
Diaphorase
IU/ml Reagens
1,0 bis 1.1
0,77 bis 0,85
0,78 bis 0,86
0,75 bis 0,83
Auf Grund seiner überlegenen Eigenschaften eignet sich das erfindungsgemäße Reagens insbesondere zum Einsatz in automatisierten Analysenvorrichtungen und verbessert deren Anwendungsmöglichkeit und Zuverlässigkeit.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung
weiter.
55 Beispiel 1
Herstellung der Herz-Diaphorase
Der Preßrückstand von 600 kg Schweineherzen wird homogenisiert und mit 9001 1 Mol Ammonsulfat-Lösung extrahiert. Nach Abfiltrieren vom Unlöslichen wird auf 1,64 Mol Ammoniumsulfat gebracht, der
Niederschlag abgetrennt und der Überstand auf 2,8 Mol Ammonsulfat gebracht. Der Niederschlag wird abfiltriert, in 0,01 Mol Kaliumphosphatpuffer, pH 7,0, aufgenommen und gegen den gleichen Puffer dialysiert. Dann wird mit 2 Volumprozent einer lOgewichtsprozentigen Polyäthylenimin-Lösung versetzt, der Niederschlag abfiltriert und der Überstand 5 Minuten auf 75° C erhitzt. Nach Abtrennung des Niederschlags wird der Überstand auf pH 5,7 gebracht und mit 100 g CM-Sephadex C 50 versetzt. Dann wird der Ionenaustauscher abfiltriert, gewaschen und mit 0,2 Mol Kaliumphosphatpuffer, pH 6,0, eluiert.
Aus dem Eluat wird die Diaphorase bei pH 7,0 mit Ammoniumsulfat gefällt, der Niederschlag in 0,01 Mol Kaliumphosphatpuffer, pH 7,0, aufgenommen, dialysiert und das Dialysat mit den übrigen Bestandteilen des erfindungsgemäßen Reagens versetzt und lyophilisiert.
Die Ausbeute beträgt 42 g Diaphorase (etwa 170 g Lyophiiisat), spezifische Aktivität mehr als 10 IU/mg Protein.
Die obigen Werte zeigen, daß das erfindungsgemäße Reagens selbst bei 2monatiger Lagerung bei einer ^qq mj
Temperatur von +330C voll gebrauchsfähig bleibt. 60 entnaiten-Die fertige Reagenslösung zeigte nach IOwöchiger Lagerung bei —10° C völlig unveränderte Diaphorase-Aktivität.
In der praktischen Anwendung wird das erfindungsgemäße Reagens, wie vorstehend beschrieben, eingesetzt.
Beispiel 2
Zusammensetzung des Reagens als Lösung
Kaliumphosphatpuffer, pH 7,0,
150 mg Rinderserumalbumin,
600 mg NAD,
100 IU Diaphorase,
1 g Saccharose,
100 mg Natriumazid.

Claims (2)

Patentansprüche:
1. Reagens zur Bestimmung der Lactat-Dehydrogenase im Farbtest, enthaltend Serumalbumin, 5 Diaphorase, NAD sowie gegebenenfalls Puffersubstanzen und Stabilisatoren, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Diaphorase enthält, welche aus der in 1,6 bis 2,8 Mol Ammonsulfat unlöslichen Proteinfraktion von Schweineherzen io durch Behandlung mit 0,1 bis 0,3 °/0 Gew./Vol. Poiyäthylenimin, Hitzeschritt bei 70 bis 800C, Adsorption an schwach sauren Kationenaustauscher und Elution desselben gewonnen wird.
15
2. Reagens nach Anspruch 1, bestehend aus Puffer, pH 6,5 bis 7,3,
0,5 bis 5 g 1 Rinderserumalbumin, 4 bis 12 g 1 NAD,
0,7 bis 3 IU ml Diaphorase, 3 bis 2υ g, 1 Saccharose,
0,1 bis 3 g/l Azid.
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