DE2315501B2 - Verfahren zur Bestimmung von Cholesterin - Google Patents

Verfahren zur Bestimmung von Cholesterin

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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Cholesterin, wobei dieses in wäßrigem Medium mit Cholesterinoxidase inkubiert und entweder der Sauerstoffverbrauch oder gebildetes K2O2 bzw. Cholestenon bestimmt wird. Um nach diesem Verfahren auch gebundenes Cholesterin bestimmen zu können, wird gemäß einem älteren Vorschlag in einem Ansatz zunächst freies Cholesterin bestimmt, dann Cholesterinesterase zugesetzt und anschließend das gebundene Cholesterin bestimmt, s. DE-OS 2264847.
Das Vorkommen einer Cholesterinesterase ist z. B. für Pankreas, Leber und andere Organe sowie für Mikroorganismen bereits bekannt. Durch die Verwendung einer derartigen Cholesterinesterase ergibt sich gegenüber einer Verseifung von gebundenem Cholesterin durch alkalische Hydrolyse, beispielsweise mit alkoholischer Kalilauge, der Vorteil einer vollenzymatischen und damit der medizinischen Routinediagnostik besser zugänglichen Methode. Bei der chemischen Hydrolyse ergeben sich nämlich Schwierigkeiten bei der anschließenden enzymatischen Bestimmung, welche eine sorgfältige Aufarbeitung des Hydrolysats vor Durchführung der enzymatischen Bestimmung erforderten.
Durch die Verwendung von Cholesterinesterase konnte zwar dieser Nachteil beseitigt werden. Es bestand jedoch bisher die Schwierigkeit, daß es mehrere Esterasen gibt, die für die Abspaltung der verschiedenen langen Fettsäurereste, mit denen das Cholesterin z. B. im Serum verestert vorliegt, spezifisch sind. Da die bekannten Cholesterinesterasen vor einer Verwendung in einem Verfahren zur Bestimmung von Cholesterin erst gereinigt werden mußten, ergab sich hierbei eine Trennung dieser unterschiedlichen Aktivitäten und eine quantitative Erfassung des Gesamtcholesterins im Serum mit derartigen Cholesterinesterasepräparaten erwies sich als schwierig.
Hinzu kommt, daß die Reinigung der meist in Lipoidmembranen gebundenen Enzyme umständlich ist und daher zu einem Präparat führt, das schon aufgrund seines Preises für eine Routinediagnostik kaum in Betracht kommt.
Aufgabe der Erfindung war die Beseitigung dieser Schwierigkeit und die Schaffung eines Präparates mit Cholesterinesterasewirksamkeit, welches auf einfachste Weise erhältlich ist und aufgrund seiner einfachen Zugänglichkeit aucn für die Routinediagnostik in Betracht kommt. Insbesondere war es eine Aufgabe der Erfindung, ein Präparat der genannten Art zu schaffen, welches in der Praxis die verschieden langen Fettsäuren am Cholesterin mit gleicher Geschwindigkeit abspaltet und diese Abspaltung in so kurzer Zeit vollzieht, daß hierdurch keine merkliche Verzögerung im Routinetest gegenüber der für die Bestimmung von freiem Cholesterin benötigten Zeit erforderlich ist.
Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäß dadurch, daß man zur Bestimmung von gebundenem Cholesterin den Mikroorganismus Candida cylindracea oder ein daraus hergestelltes Präparat mit Cholesterinesterase-Wirksamkeit zusetzt. Bevorzugt wird hierbei die Verwendung eines direkt aus dem genannten Mikroorganismus erhaltenen Acetontrockenpulvers. Es kann aber auch nicht aufgeschlossener Mikroorganismus oder eine daraus angereicherte Cholesterinesterase verwendet werden.
Bei Candida cylindracea handelt es sich um einen großtechnisch produzierten Mikroorganismus, der seit Jahren aufgrund seiner Lipaseaktivität im Handel erhältlich ist und technologisch angewendet wird. Die gebräuchliche Handelsform dieses Mikroorganismus in Form eines mit Lactose stabilisierten Trockenpulvers (Acetontrockenpulver) erwies sich als besonders gut geeignet für das Verfahren der Erfindung.
Die Erfindung beruht auf der unerwarteten Feststellung, daß der genannte Mikroorganismus eine Cholesterinesterase von außerordentlicher Aktivität enthält. Es ist ohne weitere Reinigung dieses Mikroorganismus möglich, durch Zusatz einer sehr geringen Menge desselben unter pH-Wert- und Temperaturbedingungen wie sie bei der enzymatischen Cholesterinbestimmung zur Anwendung kommen, innerhalb weniger Minuten eine quantitat;ve Freisetzung von Cholesterin aus seinen Estern : u erzielen.
Wie bereits erwähnt, sind die handelsür liehen Formen von Candida cylindracea für das Ve fahren der Erfindung besonders geeignet. Diese handelsüblichen Formen sind üblicherweise mit Kohlehydraten wie Lactose stabilisiert. Bei den im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Einsatz l.ommenden sehr geringen Mengen des Mikroorganismus bzw. seines Trockenpräparates stören derartige Stabilisierungsmittel die Cholesterinbestimmung nicht und können vernachlässigt werden.
Wie bereits erwähnt, kann im Rahmen der Erfindung auch ein angereichertes Proteinpräparat mit Cholesierinesierase verwendet werden. Eine derartige Anreicherung kann beispielsweise vom handelsüblichen Acetontrockenpulver ausgehen und aus einer Dialyse, Behandlung mit schwach-basischem
Anionenaustausch^ und Ammoniumsulfatfraktionierung bestehen. Auf diese Weise gelingt leicht eine 20- bis 30fache Anreicherung der Cholesterinesterase. Günstige Ergebnisse wurden erzielt, wenn zuerst eine Behandlung mit einem mit Diäthylaminoäthanolgruppen modifizierten Dextranpräparat, anschließend eine Ammoniumsulfatfraktionierung, bei der die Fraktion 1,8 bis 2,4 molar gewonnen wurde, und anschließende Chromatographie dieser Fraktion auf dem vorstehend genannten Austauschermaterial durchgeführt wurde.
Die erfindungsgemäß verwendete Cholesterinesterase aus Candida cylindracea weist im schwachsauren Bereich zwischen pH 5 und 6,5 sehr gute Stabilität auf. Das pH-Optimum des Enzyms liegt bei 7,5. Eine Besonderheit des Enzyms liegt darin, daß ein besonders guter Ablauf der katalytischen Reaktion bei relativ hohem Salzgehalt des Reaktionsmediums erfolgt. Vorzugsweise wird daher in einer 0,2 bis 0,8 M, insbesondere 0,4 bis 0,6 M, Pufferlösung gearbeitet. Der pH-Wert kann im Bereich zwischen 4,5 und 7,5 liegen, vorzugsweise im obenerwähnten Bereich pH 5 bis 6,5.
Zur Ausführung der Cholesterinbestimmung sind verschiedene Möglichkeiten gegeben. Prinzipiell kann der Sauerstoff verbrauch, die H2O2-Bildung oder die Cholestenonbildung gemessen werden. Die Bestimmung des Sauerstoffverbrauchs kann beispielsweise gaschromatographisch, polarometrisch oder nach dem Polarisationsverfahren erfolgen. Diese Bestimmungsmethoden sind an sich bekannt. Gebildetes Wasserstoffperoxid kann titrimetrisch, potentiometrisch, polarographisch und colorimetrisch sowie enzymatisch bestimmt werden. Bevorzugt ist die enzymatische Bestimmung unter Verwendung von Katalase oder Peroxidase, insbesondere die Bestimmung mittels Katalase in Gegenwart von ß-Diketonen, wie Acetylaceton und niedrigen Alkoholen, oder die Bestimmung mittels Peroxidase in Gegenwart eines. Chromogens, wie 2,2'-Aminobenzthiazolinsulfonsäure. Cholestenon wird mit Hilfe von Ketoreagentien, z. B. 2,4-Dinitrophenylhydrazin, bestimmt.
Gegenstand der Erfindung ist weiter auch ein Reagens zur Bestimmung von Cholesterin, bestehend aus Cholesterinoxidase, einem System zur Bestimmung von H2O2 oder einem System zur Bestimmung von Cholestonen und einem Mittel zur Verseifung von verestertem Cholesterin, bei dem das Mittel zur Verseifung von verestertem Cholesterin aus dem Mikroorganismus Candida cylindracea, oder einem daraus hergestellten Präparat mit Cholesterinesterasewirksamkeit besteht.
Bevorzugt kann dieses Reagens aus Cholesterinoxidase, einem Candida cylindracea-Präparat mit Cholesterinesterasewirksamkeit, Katalase, Acetylaceton, Methanol und Puffer bestehen. Eine andere bevorzugte Ausführungsform umfaßt Cholesterinoxidase, ein Candida cylindracea-Präparat mit Cholesterinesteraseaktivität, Peroxidase, Chromogen und Puffer. Als Chromogen wird 2,2'-Aminobenzthiazolinsulfonsäure bevorzugt.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Reagens umfaßt Cholesterinoxidase, ein Candida cylindracea-Präparat mit Cholesterinesterasewirksamkeit und ein mit Keiogruppen unter Hydrazonbildung reagierendes Hydrazinderivat sowie gegebenenfalls einen Puffer. Als Hydrazinderivat wird 2,4-Dinitrophenylhydrazin bevorzugt.
Die Reagenskombinationen können außer den angeführten obligaten Bestandteilen zusätzlich übliche Lösungsmittel, Stabilisatoren oder/und oberflächenaktive Substanzen enthalten. Alle diese Zusatzstoffe sind dem Fachmann bekannt und in Nachweissystemen fur Wasserstoffperoxid bzw. Cholestenon üblich.
Vorzugsweise enthalten die Reagenskombinationen die essentiellen Bestandteile in folgenden Mengenverhältnissen:
1. 13 bis 15 U Cholesterinoxidase, 0,05 bis 0,5 mg Candida cylindracea-Acetontrockenpulver (bezogen auf das Protein), 2 X 104 bis 5 X 105 U Katalase, 0,05 bis 0,2 ml Acetylaceton und 2 bis 10 ml Methanol in 100 ml Ammoniumionenhaltigern Puffer pH 5 bis 7 sowie gegebenenfalls 0,02 bis 0,3 ml eines oberflächenaktiven Mittels, vorzugsweise Hydroxypolyäthoxydodecan.
2. 3 bis 40 U Cholesterinoxidase, 0,05 bis 0,5 mg Candida cylindracea-Acetontrockenpulver (bezogen auf das Protein), sowie 2 Χ 102 bis 1 X 10" U Peroxidase, 50 bis 200 mg 2,2'-Aminobenzthiazolinsulfonsäure sowie gegebenenfalls 0,05 bisO,5 ml oberflächenaktives Mittel, vorzugsweise Hydroxypolyäthoxydodecan, in 100 ml Puffer pH 6 bis 8.
3. 0,1 bis 1 U Cholesterinoxidase, 0,05 bis 0,5 mg Candida cylindracea-Acetontrockenpalver (bezogen F.uf das Protein), 1 bis 5 ml einer 1 mM Lösung von 2,4-Dinitrophenylhydrazin sowie gegebenenfalls 0,005 bis 0,1 ml oberflächenaktives Mittel.
4. 2 bis 100 U Choleüterinoxidase, 0,05 bis 0,5 mg Candida cylindracca-Acetontrockenpulver (bezogen auf das Protein), sowie gegebenenfalls 0,1 bis 2,0 ml oberflächenaktives Mittel (vorzugsweise Hydroxypolyäthoxydodecan), in 50 ml Puffer pH 5 bis 9, vorzugsweise in 0,5 m Natriumphosphatpuffer pH 7,5.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren und Reagens läßt sich eine außerordentlich rasche und vollständige Verseifung von gebundenem Cholesterin durchführen. Beispielweise wird unter den Bedingungen der Cholesterinbestimmung mit Cholesterinoxidase erfindungsgemiiß eine quantitative Spaltung von gebundenem Cholesterin innerhalb von 1 bis 3 Minuten bei einem Zusatz von Candida cylindracea-Acetontrockenpulver in einer Menge zwischen 0,1 und 0,3 mg erzielt.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.
Beispiel 1
In Serum wurde unter Anwendung des in Beispiel 1 der DE-OS 2264847 beschriebenen Verfahrens der Gehalt an freiem Cholesterin zu 63 mg% (63 mg in 100 ml) bestimmt. Zur Bestimmung von gebundenem Cholesterin wurde eine Vergleichsprobe des Serums 30Minuten mit alkoholischer Kalilauge bei 70° C behandelt. Nach Neutralisation und erneuter Messung des vorhandenen Cholesterins ergab sich ein Gesamtgehalt von 181 mg% Cholesterin. Hieraus ergibt sich, daß 118 mg Cholesterin/100 ml in gebundener Form vorlagen.
Das Verfahren wurde mit unbehandelten Serum wiederholt, jedoch wurden zu Beginn der Bestimmung 0,3 mg (bezogen auf das Protein) Candida cylindracea-Acetontrockenpulver in handelsüblicher Form zugesetzt. Nach 3 Minuten ergab die polarographisehe
Bestimmung einen Gehalt von 183 mg% Gesamt-Cholesterin.
Beispiel 2
Das Verfahren von Beispiel 2 der DE-OS 2 264847 wurde wiederholt unter Zusatz von 0,1 mg Candida cylindracea-Acetontrockenpulver. Die erhaltenen Ergebnisse hinsichtlich des Gehaltes an gebundenem Cholesterin standen in guter Übereinstimmung mit den durch alkalische Verseifung erhaltenen Resultaten. Dies zeigt, daß keine Störung der üblichen Wasserstoffperoxydnachweisreaktion vorliegt.
Ein entsprechendes Ergebnis wurde erhalten, wenn gemäß Beispie; 4 obiger DE-OS gebildetes Cholestenon bestimmt wurde und in Gegenwart von Candida cylindracea-Acetontrockenpulver gearbeitet wurde.
Beispiel 3
Zur Anreicherung der Cholesterinesteraseaktivität wurde handelsübliches Acetontiockenpulver von Candida cylindracea in Kaiiumphosphatpulver pH 6,0 gelöst und gegen den gleichen Puffer dialysiert. Nach Entfernung der als Stabilisierungsmittel enthaltenen Lactose ergab sich eine spezifische Cholesterinesteraseaktivität von 0,3 U/mg Protein in der dialysierten Lösung.
Die so erhaltene Lösung wurde mit einem mit Diäthylaminoäthanolgruppen modifizier: cn Ionenaustauscher auf Dextranbasis verrührt, der Austauscher abgetrennt und mit 0,2 M Phosphatpuffer pH 6,0 eluiert. Im Eluat ergab sich eine spezifische Cholesterinesteraseaktivität von 1,2 U/mg.
Die so erhaltene Lösung wurde einer Ammoniumsulfatfraktionierung unterworfen. Die zwischen 1,8 und 2,4 M Ammoniumsulfat ausfallende Proteinfraktion wurde abgetrennt. Sie wies eine spezifische Cholesterinesteraseaktivität von 2,5 U/mg auf.
Das erhaltene Produkt vvurde erneut in Phosphatpuffer pH 6,0 aufgelöst, gegen den gleichen Puffer bis zur Salzfreiheit dialysiert und dann über eine Säule, die mit dem gleichen Anionenaustauscher wie oben angegeben gefüllt war, Chromatographien. Die EIution erfolgte wiederum mit 0,2 M Phosphatpuffer pH 6,0. In der Fraktion mit Cholesterinesteraseaktivität ergab sich eine spezifische Aktivität von 7 U/mg Protein.
Das so erhaltene angereicherte Cholesterinesterasepräparat wurde wie in Beispiel 1 beschrieben in der Cholesterinbestimmung eingesetzt. Die eingesetzte Menge betrug jedoch lediglich 0,001 mg, bezogen auf Protein. Das Ergebnis entsprach dem von Beispiel 1.
Die Cholesterinesterase aus Candida cylindracea kann nach den üblichen Methoden der Enzymfeinreinigung weiter gereinigt werden. Anstelle der obengenannten Anreicherungsschritte können auch andere biochemische Reinigungsschritte wie z. B. Fällung bzw. Fraktionierung mit Polyäthylenimin. organischen Lösungsmitteln oder Salzen, Chromatographie über Molekularsiebmaterialien oder schwache Anionenaustauscher mit anderen funktioneilen Gruppen als Diäthylaminoäthanolgruppen, Protaminsulfatfällung u. dgl. angewandt werden.
Das Acetontrockenpulver wird unter der Bezeichnung MY-Lipase von der Firma Welding in Deutschland vertrieben.

Claims (4)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Bestimmung von Cholesterin, wobei dieses in wäßrigem Medium mit Cholesterinoxidase inkubiert und entweder der Sauerstoffverbrauch oder gebildetes H2O2 oder Cholestenon bestimmt wird, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Bestimmung von gebundenem Cholesterin den Mikroorganismus Candida cylindracea oder ein daraus hergestelltes Präparat mit Cholesterinesterase-Wirksamkeit zusetzt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Candida cylindracea in Form eines Acetontrockenpulvers zugesetzt wird.
; 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekannzeichnet, daß eine, durch Herstellung eines Acetontrockenpulvers aus Candida cylindracea, Behandlung mit einem Anionenaustauscher, Ammoniumsulfatfraktionierung zwischen 1,8 und 2,4 M und Chromatographie über Anionenaustauscher erhaltene Cholesterinesterase zugesetzt wird.
4. Reagens zur Bestimmung von Cholesterin, bestehend aus Cholesterinoxidase, einem System zur Bestimmung von H2O2 oder einem System zur Bestimmung von Cholesterin und einem Mittel zur Verseifung von verestertem Cholesterin, dadurch gekennzeichnet, daß das Mittel zur Verseifung von verestertem Cholesterin aus dem Mikroorganismus Candida cylindracea oder einem daraus hergestellten Präparat mitCholesterinesterase-Wirksamkeit besteht.
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