DE2315501B2 - Verfahren zur Bestimmung von Cholesterin - Google Patents
Verfahren zur Bestimmung von CholesterinInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Cholesterin, wobei dieses in wäßrigem Medium
mit Cholesterinoxidase inkubiert und entweder der Sauerstoffverbrauch oder gebildetes K2O2 bzw.
Cholestenon bestimmt wird. Um nach diesem Verfahren auch gebundenes Cholesterin bestimmen zu können,
wird gemäß einem älteren Vorschlag in einem Ansatz zunächst freies Cholesterin bestimmt, dann
Cholesterinesterase zugesetzt und anschließend das gebundene Cholesterin bestimmt, s. DE-OS
2264847.
Das Vorkommen einer Cholesterinesterase ist z. B. für Pankreas, Leber und andere Organe sowie für Mikroorganismen
bereits bekannt. Durch die Verwendung einer derartigen Cholesterinesterase ergibt sich
gegenüber einer Verseifung von gebundenem Cholesterin durch alkalische Hydrolyse, beispielsweise mit
alkoholischer Kalilauge, der Vorteil einer vollenzymatischen und damit der medizinischen Routinediagnostik
besser zugänglichen Methode. Bei der chemischen Hydrolyse ergeben sich nämlich Schwierigkeiten
bei der anschließenden enzymatischen Bestimmung, welche eine sorgfältige Aufarbeitung des
Hydrolysats vor Durchführung der enzymatischen Bestimmung erforderten.
Durch die Verwendung von Cholesterinesterase konnte zwar dieser Nachteil beseitigt werden. Es bestand
jedoch bisher die Schwierigkeit, daß es mehrere Esterasen gibt, die für die Abspaltung der verschiedenen
langen Fettsäurereste, mit denen das Cholesterin z. B. im Serum verestert vorliegt, spezifisch sind. Da
die bekannten Cholesterinesterasen vor einer Verwendung in einem Verfahren zur Bestimmung von
Cholesterin erst gereinigt werden mußten, ergab sich hierbei eine Trennung dieser unterschiedlichen Aktivitäten
und eine quantitative Erfassung des Gesamtcholesterins im Serum mit derartigen Cholesterinesterasepräparaten
erwies sich als schwierig.
Hinzu kommt, daß die Reinigung der meist in Lipoidmembranen gebundenen Enzyme umständlich ist
und daher zu einem Präparat führt, das schon aufgrund seines Preises für eine Routinediagnostik kaum
in Betracht kommt.
Aufgabe der Erfindung war die Beseitigung dieser Schwierigkeit und die Schaffung eines Präparates mit
Cholesterinesterasewirksamkeit, welches auf einfachste Weise erhältlich ist und aufgrund seiner einfachen
Zugänglichkeit aucn für die Routinediagnostik in Betracht
kommt. Insbesondere war es eine Aufgabe der Erfindung, ein Präparat der genannten Art zu schaffen,
welches in der Praxis die verschieden langen Fettsäuren am Cholesterin mit gleicher Geschwindigkeit
abspaltet und diese Abspaltung in so kurzer Zeit vollzieht, daß hierdurch keine merkliche Verzögerung im
Routinetest gegenüber der für die Bestimmung von freiem Cholesterin benötigten Zeit erforderlich ist.
Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäß dadurch, daß man zur Bestimmung von gebundenem
Cholesterin den Mikroorganismus Candida cylindracea oder ein daraus hergestelltes Präparat mit Cholesterinesterase-Wirksamkeit
zusetzt. Bevorzugt wird hierbei die Verwendung eines direkt aus dem genannten Mikroorganismus erhaltenen Acetontrockenpulvers.
Es kann aber auch nicht aufgeschlossener Mikroorganismus oder eine daraus angereicherte Cholesterinesterase
verwendet werden.
Bei Candida cylindracea handelt es sich um einen großtechnisch produzierten Mikroorganismus, der seit
Jahren aufgrund seiner Lipaseaktivität im Handel erhältlich ist und technologisch angewendet wird. Die
gebräuchliche Handelsform dieses Mikroorganismus in Form eines mit Lactose stabilisierten Trockenpulvers
(Acetontrockenpulver) erwies sich als besonders gut geeignet für das Verfahren der Erfindung.
Die Erfindung beruht auf der unerwarteten Feststellung, daß der genannte Mikroorganismus eine
Cholesterinesterase von außerordentlicher Aktivität enthält. Es ist ohne weitere Reinigung dieses Mikroorganismus
möglich, durch Zusatz einer sehr geringen Menge desselben unter pH-Wert- und Temperaturbedingungen
wie sie bei der enzymatischen Cholesterinbestimmung zur Anwendung kommen, innerhalb weniger Minuten eine quantitat;ve Freisetzung
von Cholesterin aus seinen Estern : u erzielen.
Wie bereits erwähnt, sind die handelsür liehen Formen
von Candida cylindracea für das Ve fahren der Erfindung besonders geeignet. Diese handelsüblichen
Formen sind üblicherweise mit Kohlehydraten wie Lactose stabilisiert. Bei den im Rahmen des erfindungsgemäßen
Verfahrens zum Einsatz l.ommenden sehr geringen Mengen des Mikroorganismus bzw. seines
Trockenpräparates stören derartige Stabilisierungsmittel die Cholesterinbestimmung nicht und
können vernachlässigt werden.
Wie bereits erwähnt, kann im Rahmen der Erfindung auch ein angereichertes Proteinpräparat mit
Cholesierinesierase verwendet werden. Eine derartige
Anreicherung kann beispielsweise vom handelsüblichen Acetontrockenpulver ausgehen und aus einer
Dialyse, Behandlung mit schwach-basischem
Anionenaustausch^ und Ammoniumsulfatfraktionierung bestehen. Auf diese Weise gelingt leicht eine
20- bis 30fache Anreicherung der Cholesterinesterase. Günstige Ergebnisse wurden erzielt, wenn zuerst
eine Behandlung mit einem mit Diäthylaminoäthanolgruppen modifizierten Dextranpräparat, anschließend
eine Ammoniumsulfatfraktionierung, bei der die Fraktion 1,8 bis 2,4 molar gewonnen wurde, und anschließende
Chromatographie dieser Fraktion auf dem vorstehend genannten Austauschermaterial
durchgeführt wurde.
Die erfindungsgemäß verwendete Cholesterinesterase
aus Candida cylindracea weist im schwachsauren Bereich zwischen pH 5 und 6,5 sehr gute Stabilität
auf. Das pH-Optimum des Enzyms liegt bei 7,5. Eine Besonderheit des Enzyms liegt darin, daß ein
besonders guter Ablauf der katalytischen Reaktion bei relativ hohem Salzgehalt des Reaktionsmediums
erfolgt. Vorzugsweise wird daher in einer 0,2 bis 0,8 M, insbesondere 0,4 bis 0,6 M, Pufferlösung gearbeitet.
Der pH-Wert kann im Bereich zwischen 4,5 und 7,5 liegen, vorzugsweise im obenerwähnten Bereich
pH 5 bis 6,5.
Zur Ausführung der Cholesterinbestimmung sind verschiedene Möglichkeiten gegeben. Prinzipiell kann
der Sauerstoff verbrauch, die H2O2-Bildung oder die
Cholestenonbildung gemessen werden. Die Bestimmung des Sauerstoffverbrauchs kann beispielsweise
gaschromatographisch, polarometrisch oder nach dem Polarisationsverfahren erfolgen. Diese Bestimmungsmethoden sind an sich bekannt. Gebildetes Wasserstoffperoxid
kann titrimetrisch, potentiometrisch, polarographisch
und colorimetrisch sowie enzymatisch bestimmt werden. Bevorzugt ist die enzymatische Bestimmung
unter Verwendung von Katalase oder Peroxidase, insbesondere die Bestimmung mittels Katalase
in Gegenwart von ß-Diketonen, wie Acetylaceton und niedrigen Alkoholen, oder die Bestimmung mittels
Peroxidase in Gegenwart eines. Chromogens, wie 2,2'-Aminobenzthiazolinsulfonsäure. Cholestenon
wird mit Hilfe von Ketoreagentien, z. B. 2,4-Dinitrophenylhydrazin, bestimmt.
Gegenstand der Erfindung ist weiter auch ein Reagens zur Bestimmung von Cholesterin, bestehend aus
Cholesterinoxidase, einem System zur Bestimmung von H2O2 oder einem System zur Bestimmung von
Cholestonen und einem Mittel zur Verseifung von verestertem Cholesterin, bei dem das Mittel zur Verseifung
von verestertem Cholesterin aus dem Mikroorganismus Candida cylindracea, oder einem daraus
hergestellten Präparat mit Cholesterinesterasewirksamkeit besteht.
Bevorzugt kann dieses Reagens aus Cholesterinoxidase, einem Candida cylindracea-Präparat mit
Cholesterinesterasewirksamkeit, Katalase, Acetylaceton, Methanol und Puffer bestehen. Eine andere
bevorzugte Ausführungsform umfaßt Cholesterinoxidase, ein Candida cylindracea-Präparat mit Cholesterinesteraseaktivität,
Peroxidase, Chromogen und Puffer. Als Chromogen wird 2,2'-Aminobenzthiazolinsulfonsäure
bevorzugt.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Reagens umfaßt Cholesterinoxidase,
ein Candida cylindracea-Präparat mit Cholesterinesterasewirksamkeit
und ein mit Keiogruppen unter Hydrazonbildung reagierendes Hydrazinderivat
sowie gegebenenfalls einen Puffer. Als Hydrazinderivat wird 2,4-Dinitrophenylhydrazin bevorzugt.
Die Reagenskombinationen können außer den angeführten obligaten Bestandteilen zusätzlich übliche
Lösungsmittel, Stabilisatoren oder/und oberflächenaktive Substanzen enthalten. Alle diese Zusatzstoffe
sind dem Fachmann bekannt und in Nachweissystemen fur Wasserstoffperoxid bzw. Cholestenon üblich.
Vorzugsweise enthalten die Reagenskombinationen die essentiellen Bestandteile in folgenden Mengenverhältnissen:
1. 13 bis 15 U Cholesterinoxidase, 0,05 bis 0,5 mg Candida cylindracea-Acetontrockenpulver (bezogen
auf das Protein), 2 X 104 bis 5 X 105 U Katalase, 0,05 bis 0,2 ml Acetylaceton und 2 bis
10 ml Methanol in 100 ml Ammoniumionenhaltigern Puffer pH 5 bis 7 sowie gegebenenfalls
0,02 bis 0,3 ml eines oberflächenaktiven Mittels, vorzugsweise Hydroxypolyäthoxydodecan.
2. 3 bis 40 U Cholesterinoxidase, 0,05 bis 0,5 mg Candida cylindracea-Acetontrockenpulver (bezogen
auf das Protein), sowie 2 Χ 102 bis 1 X 10" U Peroxidase, 50 bis 200 mg 2,2'-Aminobenzthiazolinsulfonsäure
sowie gegebenenfalls 0,05 bisO,5 ml oberflächenaktives Mittel, vorzugsweise Hydroxypolyäthoxydodecan, in
100 ml Puffer pH 6 bis 8.
3. 0,1 bis 1 U Cholesterinoxidase, 0,05 bis 0,5 mg Candida cylindracea-Acetontrockenpalver (bezogen
F.uf das Protein), 1 bis 5 ml einer 1 mM Lösung von 2,4-Dinitrophenylhydrazin sowie
gegebenenfalls 0,005 bis 0,1 ml oberflächenaktives Mittel.
4. 2 bis 100 U Choleüterinoxidase, 0,05 bis 0,5 mg
Candida cylindracca-Acetontrockenpulver (bezogen auf das Protein), sowie gegebenenfalls 0,1
bis 2,0 ml oberflächenaktives Mittel (vorzugsweise Hydroxypolyäthoxydodecan), in 50 ml
Puffer pH 5 bis 9, vorzugsweise in 0,5 m Natriumphosphatpuffer pH 7,5.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren und Reagens läßt sich eine außerordentlich rasche und vollständige
Verseifung von gebundenem Cholesterin durchführen. Beispielweise wird unter den Bedingungen
der Cholesterinbestimmung mit Cholesterinoxidase erfindungsgemiiß eine quantitative Spaltung
von gebundenem Cholesterin innerhalb von 1 bis 3 Minuten bei einem Zusatz von Candida cylindracea-Acetontrockenpulver
in einer Menge zwischen 0,1 und 0,3 mg erzielt.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.
In Serum wurde unter Anwendung des in Beispiel 1 der DE-OS 2264847 beschriebenen Verfahrens der
Gehalt an freiem Cholesterin zu 63 mg% (63 mg in 100 ml) bestimmt. Zur Bestimmung von gebundenem
Cholesterin wurde eine Vergleichsprobe des Serums 30Minuten mit alkoholischer Kalilauge bei 70° C behandelt.
Nach Neutralisation und erneuter Messung des vorhandenen Cholesterins ergab sich ein Gesamtgehalt
von 181 mg% Cholesterin. Hieraus ergibt sich, daß 118 mg Cholesterin/100 ml in gebundener Form
vorlagen.
Das Verfahren wurde mit unbehandelten Serum wiederholt, jedoch wurden zu Beginn der Bestimmung
0,3 mg (bezogen auf das Protein) Candida cylindracea-Acetontrockenpulver
in handelsüblicher Form zugesetzt. Nach 3 Minuten ergab die polarographisehe
Bestimmung einen Gehalt von 183 mg% Gesamt-Cholesterin.
Das Verfahren von Beispiel 2 der DE-OS 2 264847
wurde wiederholt unter Zusatz von 0,1 mg Candida cylindracea-Acetontrockenpulver. Die erhaltenen
Ergebnisse hinsichtlich des Gehaltes an gebundenem Cholesterin standen in guter Übereinstimmung mit
den durch alkalische Verseifung erhaltenen Resultaten. Dies zeigt, daß keine Störung der üblichen Wasserstoffperoxydnachweisreaktion
vorliegt.
Ein entsprechendes Ergebnis wurde erhalten, wenn gemäß Beispie; 4 obiger DE-OS gebildetes Cholestenon
bestimmt wurde und in Gegenwart von Candida cylindracea-Acetontrockenpulver gearbeitet wurde.
Zur Anreicherung der Cholesterinesteraseaktivität wurde handelsübliches Acetontiockenpulver von
Candida cylindracea in Kaiiumphosphatpulver pH 6,0
gelöst und gegen den gleichen Puffer dialysiert. Nach Entfernung der als Stabilisierungsmittel enthaltenen
Lactose ergab sich eine spezifische Cholesterinesteraseaktivität von 0,3 U/mg Protein in der dialysierten
Lösung.
Die so erhaltene Lösung wurde mit einem mit Diäthylaminoäthanolgruppen
modifizier: cn Ionenaustauscher auf Dextranbasis verrührt, der Austauscher abgetrennt und mit 0,2 M Phosphatpuffer pH 6,0 eluiert.
Im Eluat ergab sich eine spezifische Cholesterinesteraseaktivität von 1,2 U/mg.
Die so erhaltene Lösung wurde einer Ammoniumsulfatfraktionierung unterworfen. Die zwischen 1,8
und 2,4 M Ammoniumsulfat ausfallende Proteinfraktion wurde abgetrennt. Sie wies eine spezifische Cholesterinesteraseaktivität
von 2,5 U/mg auf.
Das erhaltene Produkt vvurde erneut in Phosphatpuffer pH 6,0 aufgelöst, gegen den gleichen Puffer
bis zur Salzfreiheit dialysiert und dann über eine Säule, die mit dem gleichen Anionenaustauscher wie oben
angegeben gefüllt war, Chromatographien. Die EIution erfolgte wiederum mit 0,2 M Phosphatpuffer pH
6,0. In der Fraktion mit Cholesterinesteraseaktivität ergab sich eine spezifische Aktivität von 7 U/mg Protein.
Das so erhaltene angereicherte Cholesterinesterasepräparat wurde wie in Beispiel 1 beschrieben in
der Cholesterinbestimmung eingesetzt. Die eingesetzte Menge betrug jedoch lediglich 0,001 mg, bezogen
auf Protein. Das Ergebnis entsprach dem von Beispiel 1.
Die Cholesterinesterase aus Candida cylindracea kann nach den üblichen Methoden der Enzymfeinreinigung
weiter gereinigt werden. Anstelle der obengenannten Anreicherungsschritte können auch andere
biochemische Reinigungsschritte wie z. B. Fällung bzw. Fraktionierung mit Polyäthylenimin. organischen
Lösungsmitteln oder Salzen, Chromatographie über Molekularsiebmaterialien oder schwache Anionenaustauscher
mit anderen funktioneilen Gruppen als Diäthylaminoäthanolgruppen, Protaminsulfatfällung
u. dgl. angewandt werden.
Das Acetontrockenpulver wird unter der Bezeichnung MY-Lipase von der Firma Welding in Deutschland
vertrieben.
Claims (4)
1. Verfahren zur Bestimmung von Cholesterin,
wobei dieses in wäßrigem Medium mit Cholesterinoxidase inkubiert und entweder der Sauerstoffverbrauch
oder gebildetes H2O2 oder Cholestenon
bestimmt wird, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Bestimmung von gebundenem Cholesterin
den Mikroorganismus Candida cylindracea oder ein daraus hergestelltes Präparat mit Cholesterinesterase-Wirksamkeit
zusetzt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Candida cylindracea in Form
eines Acetontrockenpulvers zugesetzt wird.
; 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekannzeichnet,
daß eine, durch Herstellung eines Acetontrockenpulvers aus Candida cylindracea, Behandlung mit einem Anionenaustauscher, Ammoniumsulfatfraktionierung
zwischen 1,8 und 2,4 M und Chromatographie über Anionenaustauscher erhaltene Cholesterinesterase zugesetzt
wird.
4. Reagens zur Bestimmung von Cholesterin, bestehend aus Cholesterinoxidase, einem System
zur Bestimmung von H2O2 oder einem System zur
Bestimmung von Cholesterin und einem Mittel zur Verseifung von verestertem Cholesterin, dadurch
gekennzeichnet, daß das Mittel zur Verseifung von verestertem Cholesterin aus dem Mikroorganismus
Candida cylindracea oder einem daraus hergestellten Präparat mitCholesterinesterase-Wirksamkeit
besteht.
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