FI57783B - Foerfarande foer bestaemning av kolesterol - Google Patents

Description

1--.---- Γβ1 KUULUTUSJULICAISU £-0,70-7 jSK -M ^UTLÄCGNINGSSKRIFT 5 7783

c Patirnlti rayutii'ii tty i'O 10 . voO

Patent-seddelat ---- (51) Ky.ik.Va.3 C 12 Q 1/60, G 01 N 33/92

SUOMI —FINLAND (21) P»MMtJhtk«rw*-f*»t*nen«eki»»nl 9J+1M

(22) Hslnffliiptlvt—AiN»knmpd« 27.03-71* (23) Alkvpaivl—GiMglMttda| 27-03-7^ (41) Tuikit {ulkMui — BIMt effmtllf 29.09.7k

Htmttl. I» r«kl>tTih»llltOT ,.k*U*Um ,«n.-

Patent- och regicteratyrelMn ' ' AmMcm utiagdoch utUkrifne pubMcwad 30.06.80 (32)(33)(31) P)74«t*y «*»oilw»«—Begird priority 28.03*73 - 03.0U.73 Saksan Liittotasavalta-Förbunds- republiken Tyskland(DE) P 2315501.3, p 2316637.2 * (71) Boehringer Mannheim GmbH., Sandhofer Strasse 112-132, D-6800 Mannheim-

Waldhof, Saksan Liittotasavalta-Förbundsrepubliken Tyskland(DE) (72) Klaus Beaucamp, Tutzing/Obb., Hans Mollering, Tutzing/Obb., Gunter Lang, Tutzing/Obb., Wolfgang Gruber, Tutzing/Obb., Peter Roeschlau, Tutzing/Obb., Saksan Liittotasavalta-Förbundsrepubliken Tyskland(LE) (7U) Berggren Oy Ab (5U) Menetelmä kolesterolin määrittämiseksi - Förfarande för bestämning av kolesterol

Esillä oleva keksintö koskee menetelmää kolesterolin määrittämiseksi ja tällöin joko kokonaiskolesterolin tai sitoutuneen kolesterolin määrittämistä.

Kolesteroli esiintyy biologisessa materiaalissa, kuten esim. seerumissa yms., osittain vapaassa muodossa ja osittain sitoutuneessa muodossa esterinä. Sitoutuneen kolesterolin tai kokonaiskolesterolin määrittämiseksi on tarpeellista vapauttaa ensin sitoutu- - neessa muodossa oleva kolesteroli. Tämä on tapahtunut tähän asti saippuoimalla aikalisissä olosuhteissa käyttäen esim. alkoholipitoista kalilipeää. Saippuoimisen jälkeen voidaan vapautettu kolesteroli määrittää jollain tunnetulla menetelmällä joko kemiallisesti tai entsymaattisesti. Kemiallinen määritys voi tapahtua esim. Liebermann-Burchard-menetelmällä, ja entsymaattinen määritys voidaan suorittaa käyttäen kolesterolioksidaasia, kolesterolidehydrogenaa-sia tai kolesterolidehydraasia. Koska tunnetusti yksittäisillä ko-lesteroliesterillä sekä myös vapaalla kolesterolilla on kemiallisissa määritysmenetelmissä erilaiset ekstinktiokertoimet, on tarpeellista, että kolesteroliesteri muutetaan alkalisen hydrolyy- sin avulla vapaaksi kolesteroliksi.

57783

Joka tapauksessa on alkalinen sitoutuneen kolesterolin saippuoiminen häiritsevä ja aikaa vaativa menetelmän vaihe. Tämän lisäksi on otettava huomioon, että käytetyt suhteellisen voimaakkaat rea-genssit voivat aiheuttaa kolesterolin hajoamisen. Tällaisen hajoamisen ja väärien analyysitulosten estämiseksi on hydrolyysi suoritettava suhteellisen lievissä olosuhteissa, joka taas puolestaan pidentää haitallisesti määritykseen tarvittavaa aikaa.

Erittäin haitallinen on kolesterolin alkalinen vapauttaminen silloin, kun kolesterolin määrityksen yhteydessä on käytettävä edullisempia entsymaattisia menetelmiä. Koska entsyymit tulevat tunnetusti inaktiivisiksi voimaakkaasti alkalisessa väliaineessa, on hydrolysaatti saatettava happoa lisäämällä pH-arvoon 5-8 ennen ent-symaattisen määrityksen suorittamista. Kaikki tämä aiheuttaa sen, että kokonaiskolesterolinpitoisuuden ja sitoutuneen kolesterolipitoisuuden määritys kestää yhä pidemmän ajan ja vaatii paljon työtä.

Esillä olevan keksinnön tehtävänä on tämän johdosta aikaansaada sellainen menetelmä kokonaiskolesterolin tai sitoutuneen kolesterolin määrittämiseksi, jonka avulla vältetään edellä mainitut haitat.

Keksinnön mukaisesti voidaan tämä toteuttaa menetelmällä kokonaiskolesterolin tai sitoutuneen kolesterolin määrittämiseksi vapauttamalla sitoutunut kolesteroli ja määrittämällä tämän jälkeen vapautunut kolesteroli tunnetuilla menetelmillä, jolle menetelmälle on luonteenomaista se, että sitoutunut kolesteroli vapautetaan mikro-organismista saadun kolesteroliesteraasin avulla.

On todettu, että kolesteroliesteraasin avulla voidaan toteuttaa nopea ja kvantitatiivinen sitoutuneen kolesterolin saippuoiminen. Tämä menetelmä on erittäin edullinen varsinkin silloin, kun vapautetun kolesterolin määritys tapahtuu entsymaattisesti esim. käyttäen kolesterolioksidaasia tai kolesterolidehydraasia. Tässä tapauksessa mahdollistaa keksinnön mukainen menetelmä kolesterolin täys-entsymaattisen määrityksen ja muodostaa täten ratkaisevan parannuksen lääketieteelliseen rutiinidiagnostiikkaan sekä menetelmän helpon soveltamisen automaattisten analyysien suorittamiseen.

Aikaisemmin on ollut jo tunnettua, että haimassa, maksassa ja Nocardia restrictuksessa esiintyy kolesteroliesteraasivaikutus. Tästä ei kuitenkaan ole voitu päätellä, että tällainen entsyymi kykenisi aikaansaamaan nopean ja täydellisen kolesteroliestereiöen saip-puoitumisen kvantitatiivisen analyysimenetelmän puitteissa sillä todetut lohkeamistuotteet eivät olleet kvantitatiivisia vaan saavutti- 3 57783 vat korkeintaan arvon 80 % (Biochimica et Biophysica Acta 270 (1972) 156-166). Edelleen esiintyy sitoutunut kolesteroli biologisessa materiaalissa hyvin erilaisten happojen estereiden muodossa. Analyysimenetelmän käyttökelpoisuuden kannalta on edellytyksenä se, että kaikki esiintyvät esterit hajoavat kvantitatiivisesti suunnilleen samalla nopeudella ja samalla helppoudella. Näiden entsyymien tunnettujen ominaisuuksien perusteella on yllättävää, että kdlesterolies-teraasi kykenee lohkaisemaan kvantitatiivisesti kaikki esiintyvät ko-lesteriiniesterit erittäin lyhyen ajan kuluessa. Tämä on yllättävää erikoisesti myös sen johdosta, koska on ollut tunnettua, että tunnet-tuja kolesteroliesteraaseja käytettäessä on esiintynyt huomattavia eroavaisuuksia niiden tehokkuudessa erilaisten kolesteroliesterien suhteen.

Keksinnön mukaiset mikro-organismeista saadut kolesterolieste-raasit ovat osoittautuneet, mitä tulee lohkaisunopeuteen ja tehokkuuteen, mitä erilaisimpiin muualta peräisin oleviin kolesterolies-tereihin nähden ylivoimaisiksi.

Edelleen on todettu, että erilaiset mikro-organismit sisältävät erittäin aktiivisia kolesteroliesteraaseja ja niitä voidaan käyttää keksinnön mukaisen menetelmän puitteissa sellaisinaan kolesteroliesteraaseja erottamatta ja niitä puhdistamatta. Tällä on erittäin yksinkertaisen saatavuuden lisäksi myös se etu, että jättämällä pois kolesteroliesteraasien jokainen erottaminen ja rikastaminen vältetään vaara , että käytännössä tavallisesti esiintyvään useairpien erilaisten kolesteroliestereiden suhteen spesifisten kolesterolieste-raasien seokseen olisi kohdistettava sellaiset erottamistoimerpiteet, jotka vaikeuttaisivat kaiken sitoutuneen kolesterolin kvantitatiivista to-- teamista.

Tämän lisäksi on otettava huomioon, että tavallisesti lipoi-dikalvoihin sitoutuneiden kolesteroliesteraasien puhdistaminen on monimutkaista ja johtaa tämän johdosta sellaiseen valmisteeseen, joka hintansa johdosta soveltuu huonommin tavanomaiseen diagnostiikkaan minkäänlaista entsyymipuhdistusta tarvitsevaan mikro-organismi-preparaattiin verrattuna.

Erittäin edullisia tuloksia on saatu keksinnön mukaista menetelmää sovellettaessa käytettäessä kolesteroliesteraasia, joka on saatu Candida rugosa (nimitetään myös nimellä Cylindracea) ATCC 14830 vast. WS 90031 ja Aspergillus spec. WS 90030 kannoista. Nämä “ 57783 molemmat mikro-organismit voidaan lisätä suoraan sellaisinaan tai liuotetussa muodossa, esim. asetonikuivajauheena, keksinnön puitteissa. Luonnollisesti on myös mahdollista käyttää näistä mikro-organismeista saatua rikastettua kolesteroliesteraasipreparaattia, jolloin erikoisetuna on se, että määrätty rikas tus voidaan aikaansaada erittäin yksinkertaisesti. Mainittu Candida rugosa muodostaa suurteknisessä mittakaavassa valmistetun mikro-organismin, jota pidetään kaupan. Käyttökelpoinen kaupallinen muoto on esim. laktoosin avulla stabiloitu asetonikuivajauhe, joka on osoittautunut edulliseksi keksinnön tarkoituksiin käytettäväksi. Saman kaltaisia edullisia ominaisuuksia on todettu seuraavilla kannoilla:

Actinomyces aureoverticillium WS 90002

Actinomyces cyaneofuscatus WS 90003

Actinomyces griseomycini WS 90004

Actinomyces longisporus-fl. WS 90005

Actinomyces malachiticus WS 90006

Actinomyces roseolus WS 90007

Actinomyces toxytricini WS 90008

Actinomyces variabilis WS 90009

Streptomyces spec. WS 90010

Streptomyces autotropicus WS 90011

Streptomyces canescens WS 90012

Streptomyces chartreusis WS 90013

Streptomyces michiganensis WS 90014

Streptomyces murinus WS 90015

Streptomyces hachijoensis WS 90016

Streptomyces caelestes WS 90017

Streptomyces tendae WS 90018

Nocardia rubra WS 90019

Candida mycoderma WS 90020

Candida albicans WS 90021

Candida albicans WS 90022

Candida albicans WS 90023

Candida spec. WS 90024

Cunninghamella elegans WS 90025

Mueor mucedo WS 90026

Rhizopus spec. WS 90027

Penicillium spec. WS 90028

Aspergillus spec. WS 90029 5 57783

Mikrobiologista alkuperää olevien edullisempien kolestero-liesteraasien ohella voidaan kuitenkin myös käyttää useissa tapauksissa muualta peräisin olevia kolesteroliesteraaseja.

Kuten edellä mainittiin, on esillä olevan keksinnön mukaisen menetelmän eräs tärkeä etu se, että tulee mahdolliseksi suorittaa täys-entsymaattinen kolesterolin kokonaismääräys. Tällöin on merkityksellistä se, että käytettäessä mikro-organismeista saatuja edullisimpia kolesteroliesteraasipreparaatteja, tulee kolesterolin nopea ja kvantitatiivinen vapautuminen estereistään mahdolliseksi. Erikoisesti käytettäessä edellä mainittuja edullisimpia mikro-organismeja, on mahdollista lisäämällä niitä suoraan erittäin vähäisessä määrässä» ja säilyttäen pH-arvo- ja lämpötilaolosuhteet sellaisina kuin ne ovat toivottavat seuraavassa entsymaattisessa kolesterolimääräyksessä, aikaansaada muutamien minuuttien kuluessa kolesterolin kvantitatiivinen vapautuminen. Tällöin on todettu, etteivät muut hiilihydraatti-perusteiset stabiloimisaineet, joita on käytetty tällaisten mikro-organismien yhteydessä, häiritse kolesterolin määritystä tällaisen täysentsymaattisen menetelmän puitteissa.

Kuten jo mainittiin, voidaan keksinnön mukaisessa menetelmässä käyttää myös erotettua ja rikastettua kolesteroliesteraasia, joka on saatu mikro-organismeista. Sopiva rikastus voidaan aikaansaada lähdettäessä mikro-organismin tai sen kaltaisen biologisen materiaalin asetonikuivajauheesta ja tähän kohdistetaan dialyysikäsittely heikosti emäksisellä anioninvaihtajalla ja ammo-niumsulfaattifraktioiminen. Tällöin voidaan helposti suorittaa ko-lestroliesteraasin 20- ja aina 30-kertainen rikastaminen. Heikosti emäksisenä anioninvaihtajana on erittäin sopivaksi todettu dietyyli-aminoetanoliryhmillä modifioitu hiilihydraattiperusteinen preparaatti. Ammoniumsulfaattifraktioinnissa otetaan talteen edullisesti fraktio välillä 1,8 ja 2,¾ moolia ammoniumsulfaattia. Täten saatu entsyymifraktio kromatografoidaan tämän jälkeen edullisesti mainittua ioninvaihtomateriaalia käyttäen.

Erittäin edullisia tuloksia on aikaansaatu keksinnön puitteissa käyttämällä sellaisia mikro-organismeja, jotka on viljelty käyttäen kolesteroliesteripitoista elatusväliainetta. Tällöin voidaan kolesteroliesteri tai kolesteroliesteriseos lisätä ainoaksi hiilen lähtöaineeksi viljelyn aikana tai käyttää sitä yhdessä jonkin muun hiilen lähtöaineen kanssa. Erittäin edullista on käyttää sellaisia mikro-organismeja, jotka on saatu useampivaiheisen viljelymenetelmän avulla, jolloin ne viljellään ensimmäisessä vaiheessa käyt- 6 57783 täen sopivaa hiiltä luovuttavaa ainetta, kuten glyseriiniä, ja toisessa vaiheessa käyttäen kolesteroliesteriä. Eräs sopiva viljelymenetelmä on kuvattu esim. saksalaisissa hakemusjulkaisuissa n:ot 2 224 133 ja 2 307 518.

Keksinnön mukaisesti edullisesti käytetyllä Candida rugosa ATCC 14830-kannasta saadulla kolesteroliesteraasilla on heikosti happamalla alueella, välillä pH 5 ja 6,5» erittäin hyvä stabiilisuus. Entsyymin optimaalinen pH-arvo on 7»5· Entsyymin erikoislaatuisuus on siinä, että katalyyttisen reaktion erittäin hyvä kulku tapahtuu reaktioväliaineen suhteellisen suuressa suolapitoisuudessa. Tämän johdosta työskennellään edullisesti 0,2-0,8-m, erikoisesti 0,4-0,6-m puskuriliuoksessa. pH-arvo voi olla alueella välillä 4,5 ja 7,5 ja on edullisesti edellä mainitulla alueella välillä pH 5-6,5· Koleste-riiniesteraasin tehokkuuttanostetaan edullisesti lisäämällä pinta-ak-tiivisia aineita. Erittäin edullinen on hydroksipolyetoksidodekaani-lisäys.

Kuten edellä mainittiin, toteutetaan keksinnön mukainen menetelmä erittäin edullisesti täysentsymaattisesti, so. seuraava kolesterolimääritys tapahtuu myös entsymaattisesti käyttäen edullisesti kolesterolioksidaasia. Kuitenkin voidaan myös käyttää koles-terolidehydraasia tai kolesterolidehydrogenaasia.

Kolesterolioksidaasin avulla tapahtuva määritys on kuvattu esimerkiksi saksalaisessa hakemusjulkaisussa n:o 2 224 132. Siinä kuvattu menetelmä voidaan yhdistää edullisesti keksinnön mukaisen menetelmän kanssa. Periaatteessa voidaan tällöin mitata hapen kulutus, ^Og-muodostus tai kolestenonin muodostuminen.

Hapen kulutus voidaan mitata esim. kromatograafisesti, po-larometrisesti tai polarisaatiomenetelmällä. Nämä määräysmenetelmät ovat sinänsä tunnettuja. Muodostunut vetyperoksidi voidaan määrätä titraamalla potenticmetrisesti, polarograafisesti ja kolorimetrisesti sekä entsymaattisesti. Entsymaattinen määräys on edullisin käyttäen katalaasia tai peroksidaasia, erikoisesti määräys katalaasin avulla β-diketonien, kuten asetyyliasetonin, alempien alkohblien ja ammonium-ioni-pitoisen puskurin läsnäollessa, tai käyttäen määräystä peroksi-daasin avulla kromogeenin, kuten 2,2’-aminobentstiatsoliinisulfoni-hapon, läsnäollessa. Kolestenoni määrätään ketoreagenssien avulla käyttäen esim. 2,4-dinitrofenyylihydratsiinia, tai fotometrisesti arvossa 240 nm.

Siinä tapauksessa, että suoritetaan täysentsymaattinen kokonaiskolesterolin tai sitoutuneen kolesterolin määritys kolestero- 7 57783 lioksidaasin avulla, käytetään edullisesti sellaista, joka on saatu esim. kannoista Nocardia erythropolis ATCC 17895 5 Nocardia erythro-polis ATCC 4277* Nocardia formica ATCC 14811 tai Practinomyces erythropolis NCIB 9158.

Keksinnön eräs toinen kohde on reagenssi kolesterolin määrittämiseksi, joka koostuu kolesteroliesteraasista, ja reagenssistä vapaan kolesterolin määrittämiseksi. Tällaisen reagenssin muodostaa edullisesti mikrobiologista alkuperää oleva kolesteroliesteraasi, kolesterolioksidaasi, järjestelmä ^Ojin määräämiseksi tai järjestelmä kolestenonin määräämiseksi. Aivan erikoisen edullinen on tällöin ' reagenssi, jossa käytetään kolesteroliesteraasina sellaista, joka on saatu jostain edellä mainitusta mikro-organismista erikoisesti asetonikuivajauheen muodossa, tai siitä saatua proteiinifraktiota, jolla on kolesteroliesteraasiaktiivisuus.

Eräässä erikoisessa ja edullisessa toteuttamismuodossa muodostetaan tällainen reagenssi kolesterolioksidaasista, kolestero-liesteraasipreparaatista, joka on saatu jostain edellä mainitusta mikro-organismista, katalaasista, asetyyliasetonista, metanolista ja ammonium-ioneja sisältävästä puskurista, joita käytetään joko erikseen tai seoksena. Erään toisen edullisen toteuttamismuodon mukaisesti muodostetaan reagenssi kolesterolioksidaasista, jostain mainitusta kolesteroliesteraasiaktiivisuuden omaavan mikro-organismin muodostamasta preparaatista, peroksidaasista, kromogeenista ja puskurista joko erikseen tai seoksena. Kromogeenina käytetään edullisesti 2,2'-aminobentstiatsoliinisulfonihappoa.

Erään toisen edullisen toteuttamismuodon mukaisesti muodostetaan keksinnön mukainen reagenssi kolesterolioksidaasista, jonkin mainitun mikro-organismin kolesteroliesteraasipreparaatista ja ketoryhmän kanssa hydratsonia muodostaen reagoivasta hydratsiinijoh-^ dannaisesta sekä sopivassa tapauksessa puskurista. Hydratsiinijoh dannaisena voidaan käyttää edullisesti 2,4-dinitrofenyylihydratsiinia.

Edellä mainitut edulliset reagenssiyhdistelmät voivat sisältää esitettyjen pakollisten aineosien lisäksi myös tavanomaisia liuottimia, stabiloimisaineita ja/tai pinta-aktiivisia aineita. Kaikki nämä lisäaineet ovat asiantuntijalle tunnettuja ja tavanomaisia vetyperoksidin vast, kolestenonin määräysjärjestelmissä.

Edellä mainitut reagenssiyhdistelmät sisältävät edullisesti pääaineosiaan seuraavissa määräsuhteissa: 1. 13-150 U kolesterolioksidaasia, 0,05-0,5 mg mikro-orga- nismi-kolesteroliesteraasia, 2 x 10^ - 5 x 10^ U katalaasia, 0,05-0,2 8 57783 ml asetyyliasetonia ja 2-10 ml metanolia 100 ml:ssa ammoniumpitoista puskuria, pH 5-7, sekä sopivassa tapauksessa 0,02-0,3 ml pinta-aktiivista ainetta, edulliseksi hydroksipolyetoksidodekaania.

2. 3-40 U kolesterolioksidaasia, 0,05-0,5 mg mikro-organismi- kolesteroliesteraasia, sekä 2 x 10^ - 1 x 10^ U peroksidäasia, 50-200 mg 2,2’-aminobentstiatsoliinisulfonihappoa, sekä sopivassa tapauksessa 0,05-0,5 ml pinta-aktiivista ainetta, edullisesti hydroksipolyetoksidodekaania, 100 ml:ssa puskuria, pH 6-8.

3· 0,1-1 U kolesterolioksidaasi*, 0,05-0,5 mg mikro-orga- nismi-kolesteroliesteraasia, 1-5 ml 1-mimo. 2,4-dinitrofenyyli-hydratsiiniliuosta sekä sopivassa tapauksessa 0,005-0,1 ml pinta-aktiivista ainetta 10 ml:ssa puskuria, pH 6-8.

4. 2-100 U kolesterolioksidaasia, 0,05-0,5 mg mikro-organis- mikolesteroliesteraasia, sekä sopivassa tapauksessa 0,1-2,0 ml pinta- -aktiivista ainetta (edullisesti hydroksipolyetoksidodekaania) 50 ml: ssa puskuria, pH 5-9, edullisesti 0,5-m natriumfosfaattipuskuria, pH 7,5.

Keksinnön mukaista menetelmää ja reagenssia käytettäessä voidaan suorittaa erittäin nopea ja täydellinen sitoutuneen koles-teriinin saippuoiminen. Esimerkiksi kolesterolimäärlt.yksen olosuhteissa kolesterolioksidaasia keksinnön mukaisesti käytettäessä aikaansaadaan sitoutuneen kolesterolin kvantitatiivinen lohkeaminen 1-3 minuutin kuluessa lisättäessä Candida rugosa ATCC 14830- tai Aspergillus sp. WS 90030-asetonikuivajauhetta määrässä välillä 0,1 ja 0,3 mg.

Seuraavat esimerkit kuvaavat edelleen keksintöä.

Esimerkki 1

Seerumista määritettiin käyttäen saksalaisen hakemus julkaisun n:o 2 224 132 esimerkissä 1 kuvattua menetelmää vapaa kolesterolipitoisuus 63 mg#:ksi (63 mg 100 ml:ssa). Sitoutuneen kolesterolin määrittämiseksi käsiteltiin seerumin vertailunäytettä 30 minuuttia alkoholipitoisella kalilipeällä lämpötilassa 70°C. Neutraloimisen ja läsnäolevan kolesterolin uuden mittauksen jälkeen saatiin kolesterolin kokonaispitoisuudeksi l8l mg#. Tästä ilmenee, että 118 mg ko-lesterolia/100 ml esiintyi sidotussa muodossa.

Menetelmä toistettiin käyttäen käsittelemätöntä seerumia; kuitenkin määrityksen alussa lisättiin 0,3 mg (proteiinista laskettuna) Candida rugosa ATCC 14830-asetonikuivajauhetta kaupan olevassa muodossa. 3 minuutin kuluttua saatiin polarograafisen määräyksen perusteella kokonaiskolesterolipitoisuudeksi 183 mg#.

9 57783

Esimerkki 2

Kolesteroliesteraasiaktiivisuuden suurentamiseksi liuotettiin kaupan olevaa Candida rugosa ATCC 14830-asetonikuivajauhetta kaliumfosfaattipuskuriin, pH 6,0, ja dialysoitiin samaa puskuria käyttäen. Stabiloimisaineena käytetyn laktoosin poistamisen jälkeen oli spesifinen kolesteroliesteraasiaktiivisuus 0,3 U/mg proteiinia dialysoidussa liuoksessa.

Täten saatua liuosta sekoitettiin dietyyliaminoetanoli-ryhmillä modifioidun dekstraaniperusteisen ioninvaihtajan kanssa, ioninvaihtaja erotettiin ja elutoiminen suoritettiin 0,2-m fosfaat-~ tipuskurilla, pH 6,0. Eluaatin spesifinen kolesteroliesteraasiak- tiivisuus oli 1,2 U/mg.

Täten saatu liuos fraktioitiin ammoniumsulfaattimenete1-^ mällä. Välillä 1,8 ja 2,4-ammoniumsulfaattia saadut proteiinifraktiot erotettiin. Spesifisen kolesteroliesteraasiaktiivisuuden arvo oli 2,5 U/mg.

Saatu tuote liuotettiin uudelleen fosfaattipuskuriin, pH 6,0, dialysoitiin samaa puskuria käyttäen suolavapaaksi ja käsiteltiin sitten kromatograafisesti patsaassa, joka oli täytetty samalla anioninvaih-tajalla kuin edellä on esitetty. Eluutio tapahtui jälleen 0,2-m fosfaattipuskurilla, pH 6,0. Siinä fraktiossa, jossa esiintyi koles-teroliesteriaktiivisuus, spesifisen aktiivisuuden arvo oli 7 U/mg proteiinia.

Täten saatua rikastettua kolesteroliesteraasipreparaattia käsiteltiin esimerkissä 1 kuvatulla tavalla kolesteroiimäärityksessä. Lisätty määrä oli kuitenkin ainoastaan 0,001 mg proteiinista laskettuna. Tulos vastasi esimerkissä 1 saatua tulosta.

Candida rugosasta saatu kolesteroliesteraasi voidaan puhdistaa tavanomaisilla entsyymin hienopuhdistusmenetelmillä. Edellä mainittujen rikastusvaiheiden sijasta voidaan käyttää myös muita biokemiallisia puhdistustoimenpiteitä, kuten esim. saostamista tai fraktioimista polyetyleeni-imiinin avulla tai orgaanisten liuottimien tai suolan muodostuksen avulla, kromatografiaa käyttäen mole-kyyliseuloja tai heikkoja anioninvaihtajia, joissa on muita funktionaalisia ryhmiä kuin dietyyliaminoetanoliryhmiä, protamiinisulfaatti-saostusta jne.

Esimerkki 3 0,5 ml:an seerumia vast, kolesteroli -standardia lisätään 1,0 ml 0,05-m kaliumfosfaattipuskuria, pH 7,5, joka sisältää 0,M % hydroksipolyetoksidodekaania ja 2,5 U kolesteroliesteraasia, esi- 10 57783 merkin 2 mukaisesti. Tätä reaktioseosta haudotaan 40 minuuttia lämpötilassa 37°C. Tämän jälkeen lisätään 0,25 ml tätä liuosta 3 ml:an kolesterolireagenssia, joka sisältää 2 osaa etikkahappoa, 3 osaa etikkahappoanhydridia ja 1 osan rikkihappoa (Liebermann-Burchard-reagenssi).

Käyttäen vertailusuureena vakiotulosta saatiin tavanomaisesta näytteestä kokonaiskolesterolimääräksi 170 mg#. Vertailu-määritys saippuoimalla kolesteroliesteri alkoholipitoisella kalili-peällä antoi tulokseksi 165 mg#.

Esimerkki 4 0,02 ml:an seerumia lisätään 10 ml 0,5-m kaliumfosfaatti-puskuria, joka sisältää 0,4 # hydroksipolyetoksidodekaania, ja 0,2 U kolesteroliesteraasia esimerkin 2 mukaisesti. Reaktioliuosta haudotaan 60 min. lämpötilassa 37°C. Tämän jälkeen määrätään ekstinktio (E-^) aaltopituudella 240 nm sopivassa spektraali fotometri as s a ja reaktio aloitetaan Brevibacterium sterolicum-kannasta saadun 0,1 U steriinidehydraasin kanssa. 15 minuutin kuluttua määritetään ekstinktio (E2) uudelleen. Muodostuneen Δ^-kolestenonin väkevyys ja täten kolesterolimäärä saadaan ensimmäisen ja toisen määräyksen välisestä 4 . . ...

erosta ottaen huomioon Δ -kolestenonin molaansen ekstmktiokertoimen arvo aaltopituudella 240 nm. Tyypillisen näytteen kokonaiskoleste-roliarvoksi saatiin 183 mg#.

Vertailumääritys käyttäen kolesterolioksidaasia (saatu kannasta Nocardia erythropolis) sterolidehydraasien sijasta antoi kokonaiskolesterolimääräksi 181 mg#.

Esimerkki 5 ~ 10 g diammoniumvetyfosfaattia liuotetaan 100 ml:an vettä ja tämä säädetään pH-arvoon 7,0 85 #:n fosforihapon avulla. Sitten lisätään 10^ U katalaasia. Täten saatua liuosta lisätään seokseen, jossa on 0,2 ml asetyyliasetonia, 10 ml metanolia ja 0,1 g hydroksipolyetoksidodekaania, 100 m::n tilavuuteen saakka. Tähän liuokseen lisätään 2,5 U kolesteroliesteraasia, joka on saatu kannasta Rhizopus spec. (WS 90027)· 5,0 ml täten saatua liuosta sekoitetaan 0,02 ml:n kanssa seerumia, vast. 0,02 ml:n kanssa sellaista kolesteroli -standradi-liuosta, joka sisältää 200 mg# kolesterolia.. Yhtä suuriin tilavuus-ifiääriin seerumipitoista sekä kolesterolistandardipitoista näytettä lisätään kumpaankin 0,1 U kolesterolioksidaasia ja haudotaan 60 min lämpötilassa 37°C. Tämän jälkeen muodostunut väriaine mitataan arvossa 405 nm fotometrisesti ottaen huomioon näytteen alkuarvo.

11 57783

Seerumipitoisen näytteen kolesterolipitoisuus oli, käytettäessä standardia vertailukohteena, 154 mg% kokonaiskolesterolia. Vertailumääritys sellaista kolesteroliestereraasia käytettäessä, joka oli saatu kannasta Candida rugosa ATCC 14830 kolesterolies-teraasin sijasta, joka oli saatu kannasta Rhizopus spec. (WS 90027), antoi saman arvon.

Esimerkki 6

Keksinnön mukaiseen menetelmään soveltuvien mikro-organismi-kolesteroliesteraasien aktiivisuus määritettiin, tulokset ovat ^ taulukossa 1.

Taulukko 1.

N: o Kanta WS ΔΕ/h 1 Actinomyces aureoverticillium 90 002 0,600 2 Actinomyces griseomycini 90 004 0,600 3 Streptomyces spec. 90 010 0,064 4 Streptomyces autotrophicus 90 011 0,500 5 Streptomyces caelestes 90 017 0,600 6 Streptomyces tendae 90 018 0,550 7 Candida mycoderma 90 020 0,080 8 Candida albicans 90 021 0,082 9 Candida albicans 90 022 0,050 10 Candida albicans 90 023 0,080 11 Candida spec. 90 024 0,070 12 Mucor mucedo 90 026 0,150 13 Rhizopus spec. 90 027 0,130 14 Penicillium spec. 90 028 0,130 15 Aspergillus spec. 90 029 0,130 16 Candida rugosa 90 031 0,020 ΔΕ saadaan seuraavan inkubaatiotestin avulla: 3,00 ml kaliumfosfaattipuskuri 0,5 M; pH 7,5 (0,33 ml Thesit ad 100 ml), kuplitetaan C^-kaasulla 0,05 ml kolesterolioleaatti (konsentraatiossa 10 mg/ml) 0,1 ml raakauutetta (konsentroituna 1:10 biomassasta) inkuboidaan 5~17 tuntia 25°C:ssa aloitus: lisäämällä 0,07 ml kolesterolioksidaasia

Claims (3)

57783 12

1. Förfarande för bestämning av totalkolesterol eller bunden kolesterol genom frigörning av bunden kolesterol och därpä följande bestämning av frigjord kolesterol enligt kända metoder, k ä n n e -tecknat av att bunden kolesterol frigöres med hjälp av kolesterolesteras utvunnen ur mikroorganismer. 2. ' Förfarande enligt patentkravet 1, kännetecknat av att en kolesterolesteras ur Candida rugosa ATCC 14830, Rhizopus spec. WS 90027 eller Aspergillus spec. WS 90030 användes.

1. Menetelmä kokonaiskolesterolin tai sitoutuneen kolesterolin määrittämiseksi vapauttamalla sitoutunut kolesteroli ja määrittämällä tämän jälkeen vapautunut kolesteroli tunnetuilla menetelmillä, tunnettu siitä, että sitoutunut kolesteroli vapautetaan mikro-organismista saadun kolesteroliesteraasin avulla.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään sellaista kolesteroliesteraasia, joka on saatu kannasta Candida rugosa ATCC 14830, Rhizopus spec. WS 90027 tai Aspergillus spec. WS 90030.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään sellaista kolesteroliesteraasia, joka on saatu jostain kannasta: Actinomyces aureoverticillium WS 90002 Actinomyces griseomycini WS 90004 Streptomyces spec. WS 90010 Streptomyces autotrophicus WS 90011 Streptomyces caelestes WS 90017 Streptomyces tendae WS 90018 Candida mycoderma WS 90020 Candida albicans WS 90021 Candida albicans WS 90022 Candida albicans WS 90023 Candida spec. WS 90024 Mucor mucedo WS 90026 Penicillium spec. WS 90028 Aspergillus spec. WS 90029

4. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään sellaisesta mikro-organismista saatua kolesteroliesteraasia, joka on viljelty käyttäen kolesteroliesteripi-toista ravintoainetta.

5. Reagenssi patenttivaatimuksen 1 mukaisen menetelmän suorittamiseksi, tunnettu siitä, että sen muodostaa mikro-organismeista saatu kolesteroliesteraasi ja ennestään tunnettu, vapaan kolesterolin määrittämiseksi tarkoitettu järjestelmä.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen reagenssi, tunnettu siitä, että sen muodostaa mikrobiologista alkuperää oleva kolesteroliesteraasi, kolesterolioksidaasi, järjestelmä HgC^n määräämiseksi tai järjestelmä kolestenonin määrittämiseksi. 13 57783

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen reagenssi, tunnettu siitä, että se sisältää mikro-organismista saatua patenttivaatimuksen 2 tai 3 mukaista kolesteroliesteraasia.

8. Patenttivaatimuksen 5 mukainen reagenssi, tunnettu siitä, että sen muodostaa kolesteroli-oksidaasi, patenttivaatimuksen 2 tai 3 mukainen mikro-organismista saatu kolesteroliesteraasi, katalaasi, asetyyliasetoni, metanoli ja ammoniumionipitoinen puskuri.

9· Patenttivaatimuksen 7 mukainen reagenssi, tunnettu siitä, että se sisältää peroksidaasia, kromogeenia ja puskuria järjestelmänä HjC^in määräämiseksi.

10. Patenttivaatimuksen 7 mukainen reagenssi, tunnettu siitä, että se sisältää järjestelmänä kolestenonin määrittämiseksi ketoryhmien kanssa hydratsonia muodostaen reagoivaa hydratsiinijohdannaista.

11. Jonkin patenttivaatimuksen 5”1.0 mukainen reagenssi, tunnettu siitä, että se sisältää pinta-aktiivista ainetta.

3. Förfarande enligt patentkravet 1, kännetecknat _ av att kolesterolesteras utvunnen ur: Actinomyces aureoverticillium WS 90002 Actinomyces griseomycini WS 90004 Streptomyces spec. WS 90010 Streptomyces autotrophicus WS 90011 Streptomyces caelestes WS 90017 Streptomyces tendae WS 90018 Candida mycudivrma WS 90020 Candida albicans WS 90021 Candida albicans WS 90022 Candida albicans WS 90023