CS212752B2 - Způsob stanovení celkového cholesterolu nebo vázaného cholesterolu - Google Patents
Způsob stanovení celkového cholesterolu nebo vázaného cholesterolu Download PDFInfo
- Publication number
- CS212752B2 CS212752B2 CS224374A CS224374A CS212752B2 CS 212752 B2 CS212752 B2 CS 212752B2 CS 224374 A CS224374 A CS 224374A CS 224374 A CS224374 A CS 224374A CS 212752 B2 CS212752 B2 CS 212752B2
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- cholesterol
- esterase
- bound
- actinomyces
- assay
- Prior art date
Links
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 title claims description 123
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 title claims description 60
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 30
- 108010055297 Sterol Esterase Proteins 0.000 claims description 41
- 102000000019 Sterol Esterase Human genes 0.000 claims description 41
- 241000222175 Diutina rugosa Species 0.000 claims description 9
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims description 8
- 241000186046 Actinomyces Species 0.000 claims description 4
- 241000936751 Streptomyces cyaneofuscatus Species 0.000 claims description 2
- 241000946855 Streptomyces malachiticus Species 0.000 claims description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 18
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 108010089254 Cholesterol oxidase Proteins 0.000 description 14
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 11
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 11
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 10
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 10
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 150000001840 cholesterol esters Chemical class 0.000 description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 8
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 8
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 7
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 7
- YRKCREAYFQTBPV-UHFFFAOYSA-N acetylacetone Chemical compound CC(=O)CC(C)=O YRKCREAYFQTBPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 238000007127 saponification reaction Methods 0.000 description 6
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 6
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 5
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 5
- 241000187654 Nocardia Species 0.000 description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 5
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 5
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 5
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 5
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 5
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 238000008620 Cholesterol Assay Methods 0.000 description 4
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 4
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 4
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- RQNOFUZGXHSHOT-UHFFFAOYSA-N 1-(diethylamino)ethanol Chemical group CCN(CC)C(C)O RQNOFUZGXHSHOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 3
- 241000222122 Candida albicans Species 0.000 description 3
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 3
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 241000235527 Rhizopus Species 0.000 description 3
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 3
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 description 3
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 3
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 3
- 229940095731 candida albicans Drugs 0.000 description 3
- GGCLNOIGPMGLDB-GYKMGIIDSA-N cholest-5-en-3-one Chemical compound C1C=C2CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 GGCLNOIGPMGLDB-GYKMGIIDSA-N 0.000 description 3
- NYOXRYYXRWJDKP-UHFFFAOYSA-N cholestenone Natural products C1CC2=CC(=O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(C)CCCC(C)C)C1(C)CC2 NYOXRYYXRWJDKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 3
- HORQAOAYAYGIBM-UHFFFAOYSA-N 2,4-dinitrophenylhydrazine Chemical compound NNC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O HORQAOAYAYGIBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 2
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 2
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 238000007824 enzymatic assay Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 2
- 230000036284 oxygen consumption Effects 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- IEDKVDCIEARIIU-UHFFFAOYSA-N 2-Nonadecanone Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(C)=O IEDKVDCIEARIIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000589220 Acetobacter Species 0.000 description 1
- 239000004254 Ammonium phosphate Substances 0.000 description 1
- 241000228257 Aspergillus sp. Species 0.000 description 1
- 241000235556 Cunninghamella elegans Species 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 241001251094 Formica Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 241001149951 Mucor mucedo Species 0.000 description 1
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 1
- 102000007327 Protamines Human genes 0.000 description 1
- 108010007568 Protamines Proteins 0.000 description 1
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical class C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000187563 Rhodococcus ruber Species 0.000 description 1
- 241000520747 Streptomyces canescens Species 0.000 description 1
- 241000187130 Streptomyces chartreusis Species 0.000 description 1
- 241000936713 Streptomyces griseomycini Species 0.000 description 1
- 241000936729 Streptomyces hachijoensis Species 0.000 description 1
- 241000946864 Streptomyces michiganensis Species 0.000 description 1
- 241001468239 Streptomyces murinus Species 0.000 description 1
- 241000946794 Streptomyces roseolus Species 0.000 description 1
- 241000187179 Streptomyces tendae Species 0.000 description 1
- 241000946767 Streptomyces toxytricini Species 0.000 description 1
- 241000946738 Streptomyces variabilis Species 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 238000005904 alkaline hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000148 ammonium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019289 ammonium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 108010023417 cholesterol dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 210000003918 fraction a Anatomy 0.000 description 1
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 150000002429 hydrazines Chemical class 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 238000005375 photometry Methods 0.000 description 1
- 230000010287 polarization Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 229950008679 protamine sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000011309 routine diagnosis Methods 0.000 description 1
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 108010085346 steroid delta-isomerase Proteins 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
Vynález se týká způsobu stanovení cholesterolu, a to jak celkového, tak vázaného.
Cholesterol se vyskytuje v biologickém materiálu, například v séru apod. 'částečně ve volné formě a částečně ve vázané formě jako ester. Ke stanovení vázaného cholesterolu nebo celkového cholesterolu je zapotřebí nejprve uvolnit cholesterol, který se vyskytuje ve vázané formě. Toto uvolňování se dosud provádělo zmýdelněním za alkalických podmínek, například alkoholickým roztokem hydroxidu draselného. Po zmýdelnění je pak možno uvolněný cholesterol stanovit některý ze známých způsobů, buď chemicky, nebo· enzymaticky. Chemické stanovení je možno provádět například způsobem podle Liebermanna a Burcharda, enzymatické stanovení se provádí pomocí oxidázy cholesterolu, dehydrogenázy cholesterolu nebo dehydrázy cholesterolu. Protože jednotlivě estery cholesterolu a volný cholesterol mají při provádění chemického stanovení různé koeficienty extínkce, je nutné převést estery cholesterolu alkalickou hydrolýzou na volný cholesterol.
V každém, případě je zmýdelnění vázaného cholesterolu za alkalických podmínek rušivým a na čas náročným stupněm postupu. Mimoto může docházet při použití re3 akčních složek k odbourání cholesterolu. K zábraně tohoto odbourání, které pak mění výsledky stanovení, je nutno hydrolýzu provádět za poměrně velmi mírných podmínek, což dále prodlužuje čas, kterého je zapotřebí k provádění celého stanovení.
Zvláště nevýhodné je uvolnění cholesterolu za alkalických podmínek v tom případě, že se stanovení cholesterolu má provádět jinak velmi výhodným enzymatickým způsobem. Protože v silně alkalickém prostředí dochází k inaktivaci enzymu, je. zapotřebí změnit pH hydrolyzátu přidáváním kyseliny na hodnotu 5 až 8, aby bylo možno· provést enzymatické stanovení. To dále zvyšuje časové nároky na stanovení cholesterolu.
Vynález si klade za cíl navrhnout způsob stanovení celkového cholesterolu nebo vázaného· cholesterolu, který je zbaven svrchu uvedených nevýhod.
Předmětem vynálezu je tedy způsob stanovení celkového cholesterolu nebo vázaného cholesterolu uvolněním vázaného cholesterolu s následným stanovením takto uvolněného cholesterolu známým způsobem, vyznačující se tím, že se vázaný cholesterol uvolní cholesterolesterázou mikrobiálního původu.
Bylo zjištěno, že při použití cholesterolesterázy dochází k rychlému a kvantitativní212752 mu zmýdelnění vázaného cholesterolu. Tento· postup je zvláště výhodný v tom případě, že se následné stanovení uvolněného cholesterolu provádí enzymatickým způsobem, například cholesteroloxidázou nebo cholesteroldehydrázou. V tomto případě umožňuje způsob podle vynálezu přesné stanovení cholesterolu pouze enzymatickými metodami, což znamená významné zlepšení diagnostiky, protože takto upravený způsob je možno snadno provádět automaticky.
Je známo, že slinivka břišní, játra a Nocardia restrictus obsahují cholesterolesterázu. Nebylo však známo·, že tento enzym lze užít k rychlému a úplnému zmýdelnění esterů cholesterolu ke kvantitativnímu stanovení, protože dosažení skupiny nebylo kvantitativní, nýbrž činilo maximálně 80 % vázaného cholesterolu [Biochemica et Biophysica Acta 270 (1972) 156 až 166], Dále vázaný cholesterol je v biologickém materiálu ve formě esterů s velmi různými kyselinami. Pro upotřebení v rámci analytického způsobu je důležité, aby všechny vyskytující se estery byly kvantitativně štěpeny přibližně stejně rychle. Vzhledem k známým vlastnostem těchto enzymů je překvapující, že cholesterolesterázy způsobují kvantitavní štěpení všech celkově se vyskytujících esterů cholesterolu v průběhu velmi krátké doby. To je překvapující také proto, že je známo, že u známých cholesterolesteráz dochází k podstatným rozdílům v účinnosti vzhledem k různým esterům cholesterolu.
Při provádění způsobu podle vynálezu je zvláště vhodné užití cholesterolesteráz z mikroorganismů. Tyto enzymy mají daleko větší rychlost štěpení a vyšší účinnost oproti cholesterolesterázám jiného původu.
Dále bylo zjištěno, že různé mikroorganismy obsahují zvláště účinné cholesterolesterázy a z tohoto důvodu jsou vhodné k použití při provádění způsobu podle vynálezu bez izolace a čištění, To má kromě snadné dostupnosti také tu výhodu, že při vynechání izolačních stupňů pro cholesteroesterázu je možno dosáhnout toho, že se ze směsi cholesterolesteráz nevyloučí některé enzymy specifické pro různé typy esterů cholesterolu. Při vyloučení těchto typů esteráz je totiž obtížné dosáhnout kvantitativního štěpení a stanovení všech typů esterů vázaného cholesterolu,
Mimoto je čištění cholesterolesteráz vázaných na lipoidní membrány velmi pracné a výsledkem jsou preparáty, které jsou drahé a z toho důvodu nevhodné pro běžnou diagnostiku ve velkých sériích.
Zvlášť dobrých výsledků je možno dosáhnou při provádění způsobu podle vynálezu při použití cholesterolesterázy za mikroorganismu Candida rugosa (označovaného také cylindraceaj ATCG 14830 nebo WS 90031 a ze Spec. Aspergillus WS 90030. Oba tyto mikroorganismy je možno· užít jako takové nebo po sušení z acetonové emulze. Je také možné užít obohaceného přípravku cholesterolesterázy z těchto mikroorganismů, což má tu zvláštní výhodu, že tohoto obohacení je možno velmi snadno dosáhnout. Svrchu uvedený mikroorganismus Candida rugosa je možno vyrobit v technickém měřítku a tento postup je velmi snadno proveditelný. Zvláště vhohný je přípravek, který je v podstatě sušenou acetonovou emulzí, stabilizovanou laktózou. Podobných příznivých výsledků je možno dosáhnout při pužití následujících mikroorganismů:
| Actinomyces aureoverticullium | WS | 90002 |
| Actinomyces cyaneofuscatus | WS | 90003 |
| Actinomyces griseomycini | WS | 90004 |
| Actinomyces longisporus-fl. | WS | 90005 |
| Actinomyces malachiticus | WS | 90006 |
| Actinomyces roseolus | WS | 90007 |
| Actinomyces toxytricini | WS | 90008 |
| Actinomyces variabilis | WS | 90009 |
| Streptomyces spec. | WS | 90010 |
| Streptomyces autotrpphicus | WS | 90011 |
| Streptomyces canescens | WS | 90012 |
| Streptomyces chartreusis | WS | 90013 |
| Streptomyces michiganensis | WS | 90014 |
| Streptomyces murinus | WS | 90015 |
| Streptomyces hachijoensis | WS | 90016 |
| Streptomyces caelestes | WS | 90017 |
| Streptomyces tendae | WS | 90018 |
| Nocardia rubra | WS | 90019 |
| Candida mycoderma | WS | 90020 |
| Candida albicans | WS | 90021 |
| Candida albicans | WS | 90022 |
| Candida albicans | WS | 90023 |
| Candida spec. | WS | 90024 |
| Cunninghamella elegans | WS | 90025 |
| Mucor mucedo | WS | 90026 |
| Rhizopus spec. | WS | 90027 |
| Peniciillium spec. | WS | 90028 |
| Aspergillus spec. | WS | 90029 |
Kromě výhodných cholesterolesteráz mikrobiologického původu je také možno při provádění způsobu podle vynálezu užít cholesterolesteráz jiného původu.
Jak již bylo uvedeno, spočívá nejdůležitěijší výhoda způsobu podle vynálezu v tom, že způsob umožňuje stanovení cholesterolu, které je prováděno výlučně enzymatickým způsobem. Zvláště důležité je to, že při .použití přípravků cholesterolesterázy z mikroorganismů doohází k rychlému a kvantitativnímu uvolnění cholesterolu z jeho esterů. Při použití svrchu uvedených mikroorganismů je možno přímým přidáním těchto mikroorganismů ve velmi malém množství použít hodnot pH a teplot, které se pak použijí při enzymatickém stanovení cholesterolu, takže je možno dosáhnout v několika minutách kvantitativního uvolnění cholesterolu. Při tom bylo zjištěno, že použití běžných stabilizačních činidel na podkladě uhlohydrátů, tak jak se užívají pro podobné preparáty mikroorganismů, neruší průběh enzymatického provádění stanovení cholesterolu.
Jak již bylo uvedeno, je možno užít při provádění způsobu podle vynálezu také izolovaného· a obohaceného přípravku cholesterolesterázy, s výhodou mikrobiálního původu. Tento přípravek je možno obohatit například tak, že se vychází ze suspenze mikroorganismu v acetonu nebo ze suspenze jiného biologického materiálu v acetonu, a tato suspenze se podrobí dialýze, působením slabě zásaditého aniontoměniče nebo frakcionaci síranem amonným. Tímto způsobem se snadno dosáhne 20 až 30násobného obohacení cholesterolesterázy. Jako slabě zásaditého aniontoměniče je možno· užít uhlohydrátu, pozměněného diethylaminoethanolovými skupinami. Při frakcionaci síranem amonným se izolují zejména frakce získané při použití 1,8 až 2,4 molárního roztoku síranu amonného. Takto získané enzymatické frakce se pak s výhodou chromatografují na svrchu uvedené iontoměniče.
Zvláště příznivých výsledků je možno dosáhnout při provádění způsobu podle vynálezu pomocí mikroorganismů, které je možno pěstovat v živném prostředí s obsahem cholesterolu ve formě esteru. Je možno postupovat tak, že se ester cholesterolu nebo směs těchto esterů užije jako jediný zdroj uhlohydrátů v průběhu pěstování mikroorganismu, nebo se užije ještě dalších uhlohydráitů. Zvláště výhodné je použití mikroorganismů, které je možno pěstovat vícestupňovým způsobem, přičemž v prvním stupni se užije vhodného uhlohydrátu, například glycerinu, a v druhém stuipni esteru cholesterolu; tento způsob je popsán například v NSR vykládacích spisech číslo 2 224 133 a 2 307 518.
Cholesterol-esteráza z Candida rugosa ATCC 14830, které se s výhodou užívá při provádění způsobu podle vynálezu, je velmi stálá ve slabě kyselém prostředí při pH 5 až 6,5. Optimální pH pro činnost tohoto enzymu je 7,5. Při použití enzymu je možno získat velmi dobrý průběh katalytické reakce při poměrně vysokém obsahu solí v reakčním· prostředí. Postup se s výhodou provádí při koncentraci pufru 0,2 až 0,8 M, zvláště 0,4 až 0,6 M. Roztok má přitom pH
4,5 až 7,5, s výhodou 5 až 6,5. Očinnosit oholesteroesterázy je možno zvýšit přísadou povrchově aktivních látek, zvláště výhodný je přídavek hydroxypolyethoxydodekanu.
Jak již bylo uvedeno, je výhodné provádět způsob podle vynálezu výlučně enzymatickým způsobem, to znamená, že následné stanovení cholesterolu se provádí rovněž enzymaticky, s výhodou za použití cholesterooxidázy. Je však možno užít také cholesterodehydrázy nebo cholesterodehydrogenázy.
Stanovení choiesteroloxidázou je popsáno například v NSR vykládacím spisu číslo 2 224 132. Tento způsob je možno s výhodou kombinovat se způsobem podle vynálezu. Zásadně se při provádění tohoto způsobu měří spotřeba kyslíku, tvorba peroxidu vo6 díku nebo tvorba cholestenonu.
Měření spotřeby kyslíku je možno provádět například plynovou chromatografií, polaromsiricky nebo polarizačním způsobem. Tyto· způsoby stanovení jsou samy o sobě známy. Vytvořený peroxid vodíku je možno stanovit Utrácí, potenciometricky, polarograificky nebo kolorimetricky i enzymaticky. Výhodné je enzymatické stanovení při použití katalázy nebo peroxidázy, zvláště stanovení katalázou za přítomnosti /S-diketonů, jako cetylacetonu, nižších alkoholů a pufrů s obsahem amonných iontů, nebo stanovení peroxidázou za přítomnosti chromogenů, jako 2,2‘-aminobenzthiozolinsulfonové kyseliny. Cholestenon se stanoví pomocí ketolátek, například použitím 2,4-dinitrofenylhydrazinu nebo fotometricky při 240 nm.
V případě, že se enzymatické stanovení celkového nebo vázaného chloesterolu provádí pomocí cholesteroloxidázy, užije se s výhodou tohoto enzymu, vyrobeného Nocardia erytbropolis ATCC 17895, Nocardia erythropolis ATCC 4277, Nocardia formica ATCC 14811 nebo Proactinomyces erythropolis NCIB 9158.
Reakční činidlo ke stanovení cholesterolu se tedy skládá z cholesterolesterázy a reakčního systému ke stanovení volného cholesterolu. Reakční činidlo tohoto typu se skládá s výhodou z cholesterolesterázy mikrobiologického původu, cholesteroloxidázy, systému ke stanovení peroxidu vodíku nebo systému ke stanovení cholestenonu. Zvláště výhodné je reakční činidlo, v němž má cholesteirolesteráza původ mikrobiální a je odvozena od některého ze svrchu uvedených mikroorganismů, zejména ve formě prášku získaného z acetonové suspenze, nebo ve formě takto získané bílkovinné frakce s cholesterolesterázovou účinností.
Ve zvláště výhodném provedení způsobu podle vynálezu se reakční činidlo skládá z cholesteroloxidázy, preparátu cholesterolesterázy z jednoho ze svrchu uvedených mikroorganismů, z katalázy, acetylacetonu, methanolu a pufru s obsahem amonných iontů, a to· jednotlivě, nebo ve směsi. Podle dalšího výhodného provedení vynálezu se činidlo skládá z cholesteroloxidázy, preparátu některého ze svrchu uvedených mikroorganismů s cholesterolesterázovou účinností, z peroxidázy, chromogenu a pufru, a to jednotlivě, nebo ve směsi. Jako chrornogenu se s výhodou užije kyseliny 2,2‘-aminobenzthiazolinsulfonovs.
Podle dalšího výhodného provedení podle vynálezu se činidlo skládá z cholesteroloxidázy, přípravku cholesteroloxidázy z některého ze svrchu uvedených mikroorganismů a z hydrazinového derivátu, schopného reagovat s ketoskuípinami za vzniku hydrazolu, a popřípadě z pufru. Jako derivát hydr,azinu se s výhodou užije 2,4-dinitrofenylhydrazln.
Svrchu uvedené výhodné složení činidel může s výhodou ještě zahrnovat jako další příměsi vhodné rozpouštědla, stabilizátory a/nebo povrchově aktivní látky. Všechny tyto možné přísady jsou odborníkům známy pro použití v systémech ke stanovení peroxidu vodíku nebo dholestenonu.
S výhodou obsahují svrchu uvedená reakční činidla podstatné složky v následujících poměrech:
1) 13 až 150 jednotek cholesteroloxidázy, 0,05 až 0,5 mg cholesterolesterázy mikrobiálního původu, 2 X 104 až 5 X 105 jednotek katalázy, 0,05 až 0,2 ml acetylacetonu a 2 až 10 ml methanolu ve 100 ml pufru s obsahem amonných iontů při pH 5 až 7 a popřípadě 0,02 až 0,3 ml povrchově aktivního činidla, s výhodou hydroxypolyethoxydodekanu.
2) 3 až 40 jednotek cholesteroloxidázy, 0,05 až 0,5 mg cholesterolesterázy mikrobiálního původu a 2 X 102 až 1 X 104 jednotek peroxidázy, 50 až 200 mg kyseliny 2,2‘-aminobenzthiiazolinsulfonové a popřípadě 0,05 až 0,5 ml povrchově aktivního činidla, s výhodou hydroxypolyethoxydodekanu ve 100 ml pufru o pH 6 až 8.
3) 0,1 až 1 jednotku cholesteroloxidázy, 0,05 až 0,5 mg cholesterolesterázy mikrobiálního původu, 1 až 5 ml 1 ml roztoku 2,4-dlnltrofenylhydrazinu a popřípadě 0,005 až 0,1 ml povrchově aktivního činidla v 10 ml pufru o pH 6 až 8.
4) 2 až 100 jednotek cholesteroloxidázy, 0,05 až 0,5 mg 'Cholesterolesterázy mikrobiálního původu a popřípadě 0,1 až 2,0 ml povrchově aktivního· činidla ( s výhodou hydroxypolyethoxydodekanu) v 50 ml pufru o pH 5 až 9, s výhodou v 0,5 m pufru s obsahem fosforečnanu sodného o pH 7,5.
Při použití způsobu podle vynálezu je možno dosáhnout výjimečně rychlého a úplného zmýdelnění vázaného cholesterolu. Lze například dosáhnout pomocí cholesterooxidázy kvantitativního štěpení vázaného cholesterolu v průběhu 1 až 3 minut při přidání Candida rugosa ATCC 14830 nebo Aspergillus sp. WS 90030 ve formě sušené acetonové suspenze v množství 0,1 až 0,3 mg.
Vynález bude osvětlen následujícími příklady.
Příklad 1
Obsah volného cholesterolu v séru se stanoví způsobem podle příkladu 1 NSR vykládacího spisu 2 224132 jako 83 mg °/o (63 miligramů ve 100 ml). Ke stanovení vázaného cholesterolu se užije srovnávacího vzorku séra, na který se působí 30 minut alkoholickým roztokem hydroxidu draselného při teplotě 70 °C. Po neutralizaci a opakovaném měření volného cholesterolu se získá celkové množství 181 mg°/o cholesterolu, z čehož vyplývá, že vzorek původně obsahoval 118 mg cholesterolu na 100 ml vzorku ve vázané formě.
Postup se opakuje s nezpracovaným vzorkem, avšak na počátku stanovení se přidá ke vzorku 0,3 mg (vztaženo na bílkovinu} Candida rugosa ATCC 14830 ve formě sušené acetonové suspenze. Po 3 minutách se polarografickým stanovením zjistí množství 183 mg°/o celkového cholesterolu.
Příklad 2
Ke zvýšení aktivity cholesterolesterázy se rozpustí acetonová suspenze Candida rugosa ATCC 14830 po usušení v pufru s fosforečnanem draselným při pH 6,0 a pak se dialyzuje proti témuž pufru. Po odstranění lalktózy, která se užije jako stabilizační činidlo, se získá specifická aktivita cholesterolesterázy 0,3 'jednotky/mg bílkoviny v dialyzovaném roztoku.
Takto získaný roztok se smísí s iontoměničem na bázi dextranu, který byl modifikován diethylaminoethanolovýml skupinami. Iontoměnič se oddělí a vymývá se 0,2 M fosforečnanovým pufrem o pH 6,10. Aktivita cholesterolesterázy v eluátu je 1,2 jednotky/mg.
Takto získaný roztok se podrobí frakcionaci síranem amonným. Bílkovinná frakce, která se vysráží mezi 1,8 až 2,4 M síranu amonného, se oddělí. Tímto způsobem se získá .specifická účinnost cholesterolesterázy 2,5 jednotek/mg.
Získaný produkt se znovu rozpustí ve fosforečnanovéim pufru o pH 6,0, dialyzuje se proti témuž pufru tak dlouho, až se zbaví solí, a pak se nechá projít sloupcem naplněným týmž iontoměničem, který byl užit svrchu. Eluce se provádí 0,2 M fosforečnanovým pufrem o pH 6,0. Ve frakci, která obsahuje cholesterolesterázu, se získá specifická účinnost tohoto enzymu 7 jednotek/ /mg bílkoviny.
Takto získaný obohacený preparát cholesterolesterázy se užije při provádění stanovení cholesterolu způsobem podle příkladu 1. Užité množství je však 0,001 mg, vztaženo na bílkovinu. Výsledky odpovídají výsledkům z příkladu 1.
Cholesterolesteráza z Candida rugosa se dále čistí běžnými způsoby pro čištění enzymu. Místo· svrchu uvedeného stupně pro obohacení tohoto přípravku je možno užít i jiných postupů pro čištění, například srážení nebo frakcionaci pomocí polyethyleniminu, frakcionaci organickými rozpouštědly nebo solemi, chromatografií na molekulárních sítech nebo na slabých aniontoměnlčích se skupinami odlišnými od skupin diethylaminoethanolových, srážení protaminsulfátem apod.
Příklad 3
K 0,5 ml séra, popřípadě cholesterolového standardu se přidá 1,0 ml 0,5 M pufru s obsahem fosforečnanu draselného o pH 7,5 s obsahem 0,4 °/o hydroxypolyethoxydodeka212752
10 nu a 2,5 jednotek cholesterolesterázy podle příkladu 2. Tato reakční směs se inkubujje 40 minut při teplo-tě 37 °C. Pak se přidá 0,25 mililitru tohoto roztoku ke 3 ml cholesterolového- činidla, které obsahuje 2 díly kyseliny octové, 3 díly anhydridu kyseliny octové a 1 díl kyseliny sírové. (Liebermann-Burchardtovo Reakgents.)
Při použití srovnávacího standardu byly získány u typických vzorků hodnoty přibližně 170 mg% celkového cholesterolu. Srovnávací stanovení při zmýdelnění esterů cholesterolu alkoholickým roztokem hydroxidu draselného poskytovalo hodnoty 165 mg%. Přikládá
0,02 ml séra se smísí s 10 ml 0,5 M pufru s obsahem fosforečnanu draselného, který obsahuje 0,4 % hydroxypolyethoxydodekanu, a s 0,2 jednotkami cholesterolesterázy podle příkladu 2. Reakční roztok se inkubuje 60 minut při teplotě 37 °C. Pak se odečte extinkce (Ei) při 240 nm na vhodném spektrálním fotometru a provede se reakce s 0,1 jednotky steroldehydrázy z Brevihacterium sterolicum. Po 15 minutách se znovu měří extinkce (Ez). Koncentrace vytvořeného Δ4-choleisterononu a tím i cholesterolu se získá z rozdílu mezi prvním a druhým odečtením s ohledem na molární extinkční koeficient pro A4-cholesteronon při 240 nm. Měřením typického vzorku se získá hodnota 183 mgi% celkového cholesterolu.
Srovnávací stanovení pomocí cholesteroloxidázy z Nocardia erythropolis místo pomocí steroldehydrázy poskytuje hodnotu 181 mg% celkového cholesterolu.
Příklad 5 g středního fosforečnanu amonného se rozipustí ve 100 ml vody a pH tohoto roztoku se nastaví 85% kyselinou fosforečnou na 7,0. Pak se přidá 105 jednotek katalázy. Takto získaným roztokem se doplní na 100 mililitrů směs 0,2 ml acetylacetonu, 10 ml methanolu a 0,1 g hydroxypolyéthoxydodekanu. K tomuto roztoku se přidá 2,5 jednotek cholesterolesterázy z Rhizopus spec. (WS 90027).
5,0 ml takto získaného roztoku se smísí s 0,02 ml séra, popřípadě 0,2 ml standardního roztoku cholesterolu s obsahem 200 mg% cholesterolu. Alikvotní části zkoušek séra nebo standardního roztoku cholesterolu se smísí s 0,1 jednotkou cholesteroloxidázy a vzorky se inkubují při teplotě 37 °C 60 minut. Pak se vytvořené zabarvení měří fotometrieky při 405 nm proti slepé zkoušce.
Obsah cholesterolu v séru byl stanoven při použití standardu jako 154 mg% celkového cholesterolu. Při kontrolním stanovení pomocí cholesterolesterázy z Candida rugosa ATCC 14830 místo cholesterolesterázy z Rhizopus spec. (WS 90027) poskytovalo stejné výsledky.
Claims (3)
- pSedmEi vynalezu1. Způsob stanovení celkového cholesterolu nebo vázaného cholesterolu uvolněním vázaného cholesterolu s následným stanovením takto uvolněného cholesterolu známým způsobem, vyznačující se tím, že se vázaný cholesterol uvolní cholesterolesterázou mikrobiálního původu.
- 2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se vázaný cholesterol uvolní cholesterolesterázou z Candida rugosa ATCC 14830.
- 3. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se vázaný cholesterol uvolní cholesterolesterázou zActinomyces aureovertlcillium Actinomyces cyaneofuscatus Actinomyces grlseomycini Actinomyces longisporus-fl. Actinomyces malachiticusWS 90002 WS 90003 WS 90004 WS 90005 MS 90006 severografia, n. p., závod 7, Most
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS78443A CS212753B2 (cs) | 1973-03-28 | 1978-01-23 | Reakční činidlo ke stanovení cholesterolu |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE2316637A DE2316637A1 (de) | 1973-03-28 | 1973-04-03 | Verfahren zur bestimmung von cholesterin |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS212752B2 true CS212752B2 (cs) | 1982-03-26 |
Family
ID=5876875
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS224374A CS212752B2 (cs) | 1973-03-28 | 1974-03-28 | Způsob stanovení celkového cholesterolu nebo vázaného cholesterolu |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CS (1) | CS212752B2 (cs) |
-
1974
- 1974-03-28 CS CS224374A patent/CS212752B2/cs unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US3925164A (en) | Method for the determination of cholesterol | |
| Shimizu et al. | Enzymatic microdetermination of serum free fatty acids | |
| Moellering et al. | Determination of citrate with citrate lyase | |
| US4378429A (en) | Enzymatic method and stabilized solutions for determining total cholesterol in human serum | |
| US3862009A (en) | Determination of triglycerides | |
| US4259440A (en) | Hydrolysis and assay of triglycerides | |
| CA1054907A (en) | Method and composition for blood serum cholesterol analysis | |
| SU664536A3 (ru) | Реактив дл определени холестерина | |
| CS212729B2 (en) | Method of determining glycerol ester and fatty acid contents in aqueous media,and an enzymatic agent for carrying out the method | |
| EP0010296B1 (en) | Test composition for the determination of triglycerides and its use | |
| EP0012446B1 (en) | Acidic uricase, its production and its use for the determination of uric acid | |
| Kobashi et al. | A novel type of aryl sulfotransferase obtained from an anaerobic bacterium of human intestine | |
| US4181575A (en) | Composition and method for the determination of cholesterol | |
| EP0024578B1 (en) | Method of stabilizing an enzyme solution for use in total cholesterol determination, stabilized solution and test kit therefor | |
| US4338395A (en) | Method for the analysis of triglycerides | |
| US4186052A (en) | NADH Peroxidase for hydrogen peroxide determination | |
| US4999289A (en) | Lipase, its production and use for assay of triglycerides | |
| US4309502A (en) | Enzymatic assay for glycerol and triglycerides and a reagent for use therein | |
| JPS5948098A (ja) | リパ−ゼの測定方法 | |
| JPS6134800B2 (cs) | ||
| Bigelis et al. | Yeast alpha-isopropylmalate isomerase. Factors affecting stability and enzyme activity. | |
| US4409326A (en) | Stabilized enzymatic solutions and method for determining total cholesterol in human serum | |
| EP0089210B1 (en) | Reagent for assaying cholinsterase | |
| EP0044432B1 (en) | Stabilized enzymatic solutions and method for determining total cholesterol in human serum | |
| CS212752B2 (cs) | Způsob stanovení celkového cholesterolu nebo vázaného cholesterolu |