CS212752B2 - Způsob stanovení celkového cholesterolu nebo vázaného cholesterolu - Google Patents

Description

Vynález se týká způsobu stanovení cholesterolu, a to jak celkového, tak vázaného.

Cholesterol se vyskytuje v biologickém materiálu, například v séru apod. 'částečně ve volné formě a částečně ve vázané formě jako ester. Ke stanovení vázaného cholesterolu nebo celkového cholesterolu je zapotřebí nejprve uvolnit cholesterol, který se vyskytuje ve vázané formě. Toto uvolňování se dosud provádělo zmýdelněním za alkalických podmínek, například alkoholickým roztokem hydroxidu draselného. Po zmýdelnění je pak možno uvolněný cholesterol stanovit některý ze známých způsobů, buď chemicky, nebo· enzymaticky. Chemické stanovení je možno provádět například způsobem podle Liebermanna a Burcharda, enzymatické stanovení se provádí pomocí oxidázy cholesterolu, dehydrogenázy cholesterolu nebo dehydrázy cholesterolu. Protože jednotlivě estery cholesterolu a volný cholesterol mají při provádění chemického stanovení různé koeficienty extínkce, je nutné převést estery cholesterolu alkalickou hydrolýzou na volný cholesterol.

V každém, případě je zmýdelnění vázaného cholesterolu za alkalických podmínek rušivým a na čas náročným stupněm postupu. Mimoto může docházet při použití re3 akčních složek k odbourání cholesterolu. K zábraně tohoto odbourání, které pak mění výsledky stanovení, je nutno hydrolýzu provádět za poměrně velmi mírných podmínek, což dále prodlužuje čas, kterého je zapotřebí k provádění celého stanovení.

Zvláště nevýhodné je uvolnění cholesterolu za alkalických podmínek v tom případě, že se stanovení cholesterolu má provádět jinak velmi výhodným enzymatickým způsobem. Protože v silně alkalickém prostředí dochází k inaktivaci enzymu, je. zapotřebí změnit pH hydrolyzátu přidáváním kyseliny na hodnotu 5 až 8, aby bylo možno· provést enzymatické stanovení. To dále zvyšuje časové nároky na stanovení cholesterolu.

Vynález si klade za cíl navrhnout způsob stanovení celkového cholesterolu nebo vázaného· cholesterolu, který je zbaven svrchu uvedených nevýhod.

Předmětem vynálezu je tedy způsob stanovení celkového cholesterolu nebo vázaného cholesterolu uvolněním vázaného cholesterolu s následným stanovením takto uvolněného cholesterolu známým způsobem, vyznačující se tím, že se vázaný cholesterol uvolní cholesterolesterázou mikrobiálního původu.

Bylo zjištěno, že při použití cholesterolesterázy dochází k rychlému a kvantitativní212752 mu zmýdelnění vázaného cholesterolu. Tento· postup je zvláště výhodný v tom případě, že se následné stanovení uvolněného cholesterolu provádí enzymatickým způsobem, například cholesteroloxidázou nebo cholesteroldehydrázou. V tomto případě umožňuje způsob podle vynálezu přesné stanovení cholesterolu pouze enzymatickými metodami, což znamená významné zlepšení diagnostiky, protože takto upravený způsob je možno snadno provádět automaticky.

Je známo, že slinivka břišní, játra a Nocardia restrictus obsahují cholesterolesterázu. Nebylo však známo·, že tento enzym lze užít k rychlému a úplnému zmýdelnění esterů cholesterolu ke kvantitativnímu stanovení, protože dosažení skupiny nebylo kvantitativní, nýbrž činilo maximálně 80 % vázaného cholesterolu [Biochemica et Biophysica Acta 270 (1972) 156 až 166], Dále vázaný cholesterol je v biologickém materiálu ve formě esterů s velmi různými kyselinami. Pro upotřebení v rámci analytického způsobu je důležité, aby všechny vyskytující se estery byly kvantitativně štěpeny přibližně stejně rychle. Vzhledem k známým vlastnostem těchto enzymů je překvapující, že cholesterolesterázy způsobují kvantitavní štěpení všech celkově se vyskytujících esterů cholesterolu v průběhu velmi krátké doby. To je překvapující také proto, že je známo, že u známých cholesterolesteráz dochází k podstatným rozdílům v účinnosti vzhledem k různým esterům cholesterolu.

Při provádění způsobu podle vynálezu je zvláště vhodné užití cholesterolesteráz z mikroorganismů. Tyto enzymy mají daleko větší rychlost štěpení a vyšší účinnost oproti cholesterolesterázám jiného původu.

Dále bylo zjištěno, že různé mikroorganismy obsahují zvláště účinné cholesterolesterázy a z tohoto důvodu jsou vhodné k použití při provádění způsobu podle vynálezu bez izolace a čištění, To má kromě snadné dostupnosti také tu výhodu, že při vynechání izolačních stupňů pro cholesteroesterázu je možno dosáhnout toho, že se ze směsi cholesterolesteráz nevyloučí některé enzymy specifické pro různé typy esterů cholesterolu. Při vyloučení těchto typů esteráz je totiž obtížné dosáhnout kvantitativního štěpení a stanovení všech typů esterů vázaného cholesterolu,

Mimoto je čištění cholesterolesteráz vázaných na lipoidní membrány velmi pracné a výsledkem jsou preparáty, které jsou drahé a z toho důvodu nevhodné pro běžnou diagnostiku ve velkých sériích.

Zvlášť dobrých výsledků je možno dosáhnou při provádění způsobu podle vynálezu při použití cholesterolesterázy za mikroorganismu Candida rugosa (označovaného také cylindraceaj ATCG 14830 nebo WS 90031 a ze Spec. Aspergillus WS 90030. Oba tyto mikroorganismy je možno· užít jako takové nebo po sušení z acetonové emulze. Je také možné užít obohaceného přípravku cholesterolesterázy z těchto mikroorganismů, což má tu zvláštní výhodu, že tohoto obohacení je možno velmi snadno dosáhnout. Svrchu uvedený mikroorganismus Candida rugosa je možno vyrobit v technickém měřítku a tento postup je velmi snadno proveditelný. Zvláště vhohný je přípravek, který je v podstatě sušenou acetonovou emulzí, stabilizovanou laktózou. Podobných příznivých výsledků je možno dosáhnout při pužití následujících mikroorganismů:

Actinomyces aureoverticullium	WS	90002
Actinomyces cyaneofuscatus	WS	90003
Actinomyces griseomycini	WS	90004
Actinomyces longisporus-fl.	WS	90005
Actinomyces malachiticus	WS	90006
Actinomyces roseolus	WS	90007
Actinomyces toxytricini	WS	90008
Actinomyces variabilis	WS	90009
Streptomyces spec.	WS	90010
Streptomyces autotrpphicus	WS	90011
Streptomyces canescens	WS	90012
Streptomyces chartreusis	WS	90013
Streptomyces michiganensis	WS	90014
Streptomyces murinus	WS	90015
Streptomyces hachijoensis	WS	90016
Streptomyces caelestes	WS	90017
Streptomyces tendae	WS	90018
Nocardia rubra	WS	90019
Candida mycoderma	WS	90020
Candida albicans	WS	90021
Candida albicans	WS	90022
Candida albicans	WS	90023
Candida spec.	WS	90024
Cunninghamella elegans	WS	90025
Mucor mucedo	WS	90026
Rhizopus spec.	WS	90027
Peniciillium spec.	WS	90028
Aspergillus spec.	WS	90029

Kromě výhodných cholesterolesteráz mikrobiologického původu je také možno při provádění způsobu podle vynálezu užít cholesterolesteráz jiného původu.

Jak již bylo uvedeno, spočívá nejdůležitěijší výhoda způsobu podle vynálezu v tom, že způsob umožňuje stanovení cholesterolu, které je prováděno výlučně enzymatickým způsobem. Zvláště důležité je to, že při .použití přípravků cholesterolesterázy z mikroorganismů doohází k rychlému a kvantitativnímu uvolnění cholesterolu z jeho esterů. Při použití svrchu uvedených mikroorganismů je možno přímým přidáním těchto mikroorganismů ve velmi malém množství použít hodnot pH a teplot, které se pak použijí při enzymatickém stanovení cholesterolu, takže je možno dosáhnout v několika minutách kvantitativního uvolnění cholesterolu. Při tom bylo zjištěno, že použití běžných stabilizačních činidel na podkladě uhlohydrátů, tak jak se užívají pro podobné preparáty mikroorganismů, neruší průběh enzymatického provádění stanovení cholesterolu.

Jak již bylo uvedeno, je možno užít při provádění způsobu podle vynálezu také izolovaného· a obohaceného přípravku cholesterolesterázy, s výhodou mikrobiálního původu. Tento přípravek je možno obohatit například tak, že se vychází ze suspenze mikroorganismu v acetonu nebo ze suspenze jiného biologického materiálu v acetonu, a tato suspenze se podrobí dialýze, působením slabě zásaditého aniontoměniče nebo frakcionaci síranem amonným. Tímto způsobem se snadno dosáhne 20 až 30násobného obohacení cholesterolesterázy. Jako slabě zásaditého aniontoměniče je možno· užít uhlohydrátu, pozměněného diethylaminoethanolovými skupinami. Při frakcionaci síranem amonným se izolují zejména frakce získané při použití 1,8 až 2,4 molárního roztoku síranu amonného. Takto získané enzymatické frakce se pak s výhodou chromatografují na svrchu uvedené iontoměniče.

Zvláště příznivých výsledků je možno dosáhnout při provádění způsobu podle vynálezu pomocí mikroorganismů, které je možno pěstovat v živném prostředí s obsahem cholesterolu ve formě esteru. Je možno postupovat tak, že se ester cholesterolu nebo směs těchto esterů užije jako jediný zdroj uhlohydrátů v průběhu pěstování mikroorganismu, nebo se užije ještě dalších uhlohydráitů. Zvláště výhodné je použití mikroorganismů, které je možno pěstovat vícestupňovým způsobem, přičemž v prvním stupni se užije vhodného uhlohydrátu, například glycerinu, a v druhém stuipni esteru cholesterolu; tento způsob je popsán například v NSR vykládacích spisech číslo 2 224 133 a 2 307 518.

Cholesterol-esteráza z Candida rugosa ATCC 14830, které se s výhodou užívá při provádění způsobu podle vynálezu, je velmi stálá ve slabě kyselém prostředí při pH 5 až 6,5. Optimální pH pro činnost tohoto enzymu je 7,5. Při použití enzymu je možno získat velmi dobrý průběh katalytické reakce při poměrně vysokém obsahu solí v reakčním· prostředí. Postup se s výhodou provádí při koncentraci pufru 0,2 až 0,8 M, zvláště 0,4 až 0,6 M. Roztok má přitom pH

4,5 až 7,5, s výhodou 5 až 6,5. Očinnosit oholesteroesterázy je možno zvýšit přísadou povrchově aktivních látek, zvláště výhodný je přídavek hydroxypolyethoxydodekanu.

Jak již bylo uvedeno, je výhodné provádět způsob podle vynálezu výlučně enzymatickým způsobem, to znamená, že následné stanovení cholesterolu se provádí rovněž enzymaticky, s výhodou za použití cholesterooxidázy. Je však možno užít také cholesterodehydrázy nebo cholesterodehydrogenázy.

Stanovení choiesteroloxidázou je popsáno například v NSR vykládacím spisu číslo 2 224 132. Tento způsob je možno s výhodou kombinovat se způsobem podle vynálezu. Zásadně se při provádění tohoto způsobu měří spotřeba kyslíku, tvorba peroxidu vo6 díku nebo tvorba cholestenonu.

Měření spotřeby kyslíku je možno provádět například plynovou chromatografií, polaromsiricky nebo polarizačním způsobem. Tyto· způsoby stanovení jsou samy o sobě známy. Vytvořený peroxid vodíku je možno stanovit Utrácí, potenciometricky, polarograificky nebo kolorimetricky i enzymaticky. Výhodné je enzymatické stanovení při použití katalázy nebo peroxidázy, zvláště stanovení katalázou za přítomnosti /S-diketonů, jako cetylacetonu, nižších alkoholů a pufrů s obsahem amonných iontů, nebo stanovení peroxidázou za přítomnosti chromogenů, jako 2,2‘-aminobenzthiozolinsulfonové kyseliny. Cholestenon se stanoví pomocí ketolátek, například použitím 2,4-dinitrofenylhydrazinu nebo fotometricky při 240 nm.

V případě, že se enzymatické stanovení celkového nebo vázaného chloesterolu provádí pomocí cholesteroloxidázy, užije se s výhodou tohoto enzymu, vyrobeného Nocardia erytbropolis ATCC 17895, Nocardia erythropolis ATCC 4277, Nocardia formica ATCC 14811 nebo Proactinomyces erythropolis NCIB 9158.

Reakční činidlo ke stanovení cholesterolu se tedy skládá z cholesterolesterázy a reakčního systému ke stanovení volného cholesterolu. Reakční činidlo tohoto typu se skládá s výhodou z cholesterolesterázy mikrobiologického původu, cholesteroloxidázy, systému ke stanovení peroxidu vodíku nebo systému ke stanovení cholestenonu. Zvláště výhodné je reakční činidlo, v němž má cholesteirolesteráza původ mikrobiální a je odvozena od některého ze svrchu uvedených mikroorganismů, zejména ve formě prášku získaného z acetonové suspenze, nebo ve formě takto získané bílkovinné frakce s cholesterolesterázovou účinností.

Ve zvláště výhodném provedení způsobu podle vynálezu se reakční činidlo skládá z cholesteroloxidázy, preparátu cholesterolesterázy z jednoho ze svrchu uvedených mikroorganismů, z katalázy, acetylacetonu, methanolu a pufru s obsahem amonných iontů, a to· jednotlivě, nebo ve směsi. Podle dalšího výhodného provedení vynálezu se činidlo skládá z cholesteroloxidázy, preparátu některého ze svrchu uvedených mikroorganismů s cholesterolesterázovou účinností, z peroxidázy, chromogenu a pufru, a to jednotlivě, nebo ve směsi. Jako chrornogenu se s výhodou užije kyseliny 2,2‘-aminobenzthiazolinsulfonovs.

Podle dalšího výhodného provedení podle vynálezu se činidlo skládá z cholesteroloxidázy, přípravku cholesteroloxidázy z některého ze svrchu uvedených mikroorganismů a z hydrazinového derivátu, schopného reagovat s ketoskuípinami za vzniku hydrazolu, a popřípadě z pufru. Jako derivát hydr,azinu se s výhodou užije 2,4-dinitrofenylhydrazln.

Svrchu uvedené výhodné složení činidel může s výhodou ještě zahrnovat jako další příměsi vhodné rozpouštědla, stabilizátory a/nebo povrchově aktivní látky. Všechny tyto možné přísady jsou odborníkům známy pro použití v systémech ke stanovení peroxidu vodíku nebo dholestenonu.

S výhodou obsahují svrchu uvedená reakční činidla podstatné složky v následujících poměrech:

1) 13 až 150 jednotek cholesteroloxidázy, 0,05 až 0,5 mg cholesterolesterázy mikrobiálního původu, 2 X 10⁴ až 5 X 10⁵ jednotek katalázy, 0,05 až 0,2 ml acetylacetonu a 2 až 10 ml methanolu ve 100 ml pufru s obsahem amonných iontů při pH 5 až 7 a popřípadě 0,02 až 0,3 ml povrchově aktivního činidla, s výhodou hydroxypolyethoxydodekanu.

2) 3 až 40 jednotek cholesteroloxidázy, 0,05 až 0,5 mg cholesterolesterázy mikrobiálního původu a 2 X 10² až 1 X 104 jednotek peroxidázy, 50 až 200 mg kyseliny 2,2‘-aminobenzthiiazolinsulfonové a popřípadě 0,05 až 0,5 ml povrchově aktivního činidla, s výhodou hydroxypolyethoxydodekanu ve 100 ml pufru o pH 6 až 8.

3) 0,1 až 1 jednotku cholesteroloxidázy, 0,05 až 0,5 mg cholesterolesterázy mikrobiálního původu, 1 až 5 ml 1 ml roztoku 2,4-dlnltrofenylhydrazinu a popřípadě 0,005 až 0,1 ml povrchově aktivního činidla v 10 ml pufru o pH 6 až 8.

4) 2 až 100 jednotek cholesteroloxidázy, 0,05 až 0,5 mg 'Cholesterolesterázy mikrobiálního původu a popřípadě 0,1 až 2,0 ml povrchově aktivního· činidla ( s výhodou hydroxypolyethoxydodekanu) v 50 ml pufru o pH 5 až 9, s výhodou v 0,5 m pufru s obsahem fosforečnanu sodného o pH 7,5.

Při použití způsobu podle vynálezu je možno dosáhnout výjimečně rychlého a úplného zmýdelnění vázaného cholesterolu. Lze například dosáhnout pomocí cholesterooxidázy kvantitativního štěpení vázaného cholesterolu v průběhu 1 až 3 minut při přidání Candida rugosa ATCC 14830 nebo Aspergillus sp. WS 90030 ve formě sušené acetonové suspenze v množství 0,1 až 0,3 mg.

Vynález bude osvětlen následujícími příklady.

Příklad 1

Obsah volného cholesterolu v séru se stanoví způsobem podle příkladu 1 NSR vykládacího spisu 2 224132 jako 83 mg °/o (63 miligramů ve 100 ml). Ke stanovení vázaného cholesterolu se užije srovnávacího vzorku séra, na který se působí 30 minut alkoholickým roztokem hydroxidu draselného při teplotě 70 °C. Po neutralizaci a opakovaném měření volného cholesterolu se získá celkové množství 181 mg°/o cholesterolu, z čehož vyplývá, že vzorek původně obsahoval 118 mg cholesterolu na 100 ml vzorku ve vázané formě.

Postup se opakuje s nezpracovaným vzorkem, avšak na počátku stanovení se přidá ke vzorku 0,3 mg (vztaženo na bílkovinu} Candida rugosa ATCC 14830 ve formě sušené acetonové suspenze. Po 3 minutách se polarografickým stanovením zjistí množství 183 mg°/o celkového cholesterolu.

Příklad 2

Ke zvýšení aktivity cholesterolesterázy se rozpustí acetonová suspenze Candida rugosa ATCC 14830 po usušení v pufru s fosforečnanem draselným při pH 6,0 a pak se dialyzuje proti témuž pufru. Po odstranění lalktózy, která se užije jako stabilizační činidlo, se získá specifická aktivita cholesterolesterázy 0,3 'jednotky/mg bílkoviny v dialyzovaném roztoku.

Takto získaný roztok se smísí s iontoměničem na bázi dextranu, který byl modifikován diethylaminoethanolovýml skupinami. Iontoměnič se oddělí a vymývá se 0,2 M fosforečnanovým pufrem o pH 6,10. Aktivita cholesterolesterázy v eluátu je 1,2 jednotky/mg.

Takto získaný roztok se podrobí frakcionaci síranem amonným. Bílkovinná frakce, která se vysráží mezi 1,8 až 2,4 M síranu amonného, se oddělí. Tímto způsobem se získá .specifická účinnost cholesterolesterázy 2,5 jednotek/mg.

Získaný produkt se znovu rozpustí ve fosforečnanovéim pufru o pH 6,0, dialyzuje se proti témuž pufru tak dlouho, až se zbaví solí, a pak se nechá projít sloupcem naplněným týmž iontoměničem, který byl užit svrchu. Eluce se provádí 0,2 M fosforečnanovým pufrem o pH 6,0. Ve frakci, která obsahuje cholesterolesterázu, se získá specifická účinnost tohoto enzymu 7 jednotek/ /mg bílkoviny.

Takto získaný obohacený preparát cholesterolesterázy se užije při provádění stanovení cholesterolu způsobem podle příkladu 1. Užité množství je však 0,001 mg, vztaženo na bílkovinu. Výsledky odpovídají výsledkům z příkladu 1.

Cholesterolesteráza z Candida rugosa se dále čistí běžnými způsoby pro čištění enzymu. Místo· svrchu uvedeného stupně pro obohacení tohoto přípravku je možno užít i jiných postupů pro čištění, například srážení nebo frakcionaci pomocí polyethyleniminu, frakcionaci organickými rozpouštědly nebo solemi, chromatografií na molekulárních sítech nebo na slabých aniontoměnlčích se skupinami odlišnými od skupin diethylaminoethanolových, srážení protaminsulfátem apod.

Příklad 3

K 0,5 ml séra, popřípadě cholesterolového standardu se přidá 1,0 ml 0,5 M pufru s obsahem fosforečnanu draselného o pH 7,5 s obsahem 0,4 °/o hydroxypolyethoxydodeka212752

10 nu a 2,5 jednotek cholesterolesterázy podle příkladu 2. Tato reakční směs se inkubujje 40 minut při teplo-tě 37 °C. Pak se přidá 0,25 mililitru tohoto roztoku ke 3 ml cholesterolového- činidla, které obsahuje 2 díly kyseliny octové, 3 díly anhydridu kyseliny octové a 1 díl kyseliny sírové. (Liebermann-Burchardtovo Reakgents.)

Při použití srovnávacího standardu byly získány u typických vzorků hodnoty přibližně 170 mg% celkového cholesterolu. Srovnávací stanovení při zmýdelnění esterů cholesterolu alkoholickým roztokem hydroxidu draselného poskytovalo hodnoty 165 mg%. Přikládá

0,02 ml séra se smísí s 10 ml 0,5 M pufru s obsahem fosforečnanu draselného, který obsahuje 0,4 % hydroxypolyethoxydodekanu, a s 0,2 jednotkami cholesterolesterázy podle příkladu 2. Reakční roztok se inkubuje 60 minut při teplotě 37 °C. Pak se odečte extinkce (Ei) při 240 nm na vhodném spektrálním fotometru a provede se reakce s 0,1 jednotky steroldehydrázy z Brevihacterium sterolicum. Po 15 minutách se znovu měří extinkce (Ez). Koncentrace vytvořeného Δ⁴-choleisterononu a tím i cholesterolu se získá z rozdílu mezi prvním a druhým odečtením s ohledem na molární extinkční koeficient pro A⁴-cholesteronon při 240 nm. Měřením typického vzorku se získá hodnota 183 mgi% celkového cholesterolu.

Srovnávací stanovení pomocí cholesteroloxidázy z Nocardia erythropolis místo pomocí steroldehydrázy poskytuje hodnotu 181 mg% celkového cholesterolu.

Příklad 5 g středního fosforečnanu amonného se rozipustí ve 100 ml vody a pH tohoto roztoku se nastaví 85% kyselinou fosforečnou na 7,0. Pak se přidá 10⁵ jednotek katalázy. Takto získaným roztokem se doplní na 100 mililitrů směs 0,2 ml acetylacetonu, 10 ml methanolu a 0,1 g hydroxypolyéthoxydodekanu. K tomuto roztoku se přidá 2,5 jednotek cholesterolesterázy z Rhizopus spec. (WS 90027).

5,0 ml takto získaného roztoku se smísí s 0,02 ml séra, popřípadě 0,2 ml standardního roztoku cholesterolu s obsahem 200 mg% cholesterolu. Alikvotní části zkoušek séra nebo standardního roztoku cholesterolu se smísí s 0,1 jednotkou cholesteroloxidázy a vzorky se inkubují při teplotě 37 °C 60 minut. Pak se vytvořené zabarvení měří fotometrieky při 405 nm proti slepé zkoušce.

Obsah cholesterolu v séru byl stanoven při použití standardu jako 154 mg% celkového cholesterolu. Při kontrolním stanovení pomocí cholesterolesterázy z Candida rugosa ATCC 14830 místo cholesterolesterázy z Rhizopus spec. (WS 90027) poskytovalo stejné výsledky.

Claims (3)

1. pSedmEi vynalezu

   1. Způsob stanovení celkového cholesterolu nebo vázaného cholesterolu uvolněním vázaného cholesterolu s následným stanovením takto uvolněného cholesterolu známým způsobem, vyznačující se tím, že se vázaný cholesterol uvolní cholesterolesterázou mikrobiálního původu.
2. 2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se vázaný cholesterol uvolní cholesterolesterázou z Candida rugosa ATCC 14830.
3. 3. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se vázaný cholesterol uvolní cholesterolesterázou z

   Actinomyces aureovertlcillium Actinomyces cyaneofuscatus Actinomyces grlseomycini Actinomyces longisporus-fl. Actinomyces malachiticus

   WS 90002 WS 90003 WS 90004 WS 90005 MS 90006 severografia, n. p., závod 7, Most