JPS5948098A - リパ−ゼの測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明はリパーゼの測定方法に関する。

従来技術 本発明は血清及び餞の体液のような、内反性グリセリン
をも含む試料中のり）９−ゼ測定に特に有用である。

グリセリンエステルの加水分解を触媒するリパーゼハ、
インターナシ、ナルユニオンメブノＪイｙ＋ケミストリ
ー（Ｉｎｔｅｒｎｎ口ｏｎｎｌ　ＴＪｎｌｏｎ　　ｎｆ
Ｂｌｏｃｈｅｍ！＊ｔｒｙ　）　１７こより酵素命名法
及び分４”、（＋に、１づいてグリセリンエステルヒド
ロ”ｙ−Ｗ　ト呼１ｄ’れ、ぞして命名番号ＩＣ，Ｃ，
３，］、１．ニー１．を力えられている。

本発明に従って測定されるリパーゼは仙の類似酵素とは
区別されるものである。とれら仙の類似酵素にはカルボ
ン酸エステルヒドロラービ及びアリールエステルヒドロ
ラーゼがある。カッｌヂン酸エステルヒドロラーゼＩｄ
、短鎖脂肪酸のグリセリンエステルの加水分解を触媒し
、そして−価アルコールのエステル及び二塩基酸のエス
テルの加水分解を触媒する。アリールエステルヒドロラ
ーゼハ酢酸フェニルのようなエステルの加水分解を触媒
する。一方リパーゼは長鎖の脂肪酸のグリセリンエステ
ルに特異的であシ、そしてグリセリン分子末端のエステ
ルの加水分解を選択的に触媒する。す／や一ゼはこれら
油状の水不溶性グリセリンエステルの油と水との界面に
のみ作用する。グリセリン分子は、α位と呼ばれる二つ
の末端位置とβ位と呼ばれる中心位１ｕとの三つの可能
なエステル位置を有する。

血清又は他の体液中のリパーゼの測定は、種々の疾病を
診断する際に重要な助けとなる。たとえば血清中のリパ
ーゼ合歓の増大は、急性膵炎、十二指腸潰瘍及び腸管閉
鎖症に見られる。更に高レベルのり・９−ゼは膵臓癌の
場合に見られる。かくして種々の流体中のソノ９−ゼの
レベルを測定する為の能力は重要な診断手段である。

リパーゼの測定が多くの疾病の診断に有価であるにもか
かわらず、この酵素の分析は臨床研究室で頻繁に行われ
でいない。こうした理由としては次のことが考えられる
。即ち、す・Ｐ−ゼ測定の公知方法は比較的時間がかか
シ、−そ１．て多くの（０合に不正確で非ｌＬケ異的で
あるからであるうた。！：乏−ｔＪ最も一般的な方法の
一つは濁り測定法であろうとの方法を実施する為には不
溶性エステルを乳化する。分析すべき試料をとのｆＱ　
Ｄエマルシ、ンヘ添加し、そして試料中のり、・ぞ−ゼ
によって生じる清澄効果を測定する。この方法に用いる
非常に一般的な不溶性エステルはトリオレインとしても
知られるグリセリントリオレートである。とれ１．を精
製して用いるか５１はオリーブメイル中に存在するもの
を１α接使用する。し７かしながら、との方法ｔｅｌ試
料中の小１偶のリパーゼには比較的感度が悪く、−そ−
して高酵素し一定ルで＆Ｊ良好な直線性を示ジないこと
が知られている。更に前記方法←ｊ、乾式分析Ｏ！素に
適応させることができない。

リパーゼ測定のイｔｂの先行技術方法においては、脂肪
酸エステルのリノ！−ゼ触媒加水分〜〒の結果遊離する
脂肪酸を測定する。工１ルションの轡ら１７いパッチを
各＋）Ａ−ゼ測定の為に調製せねばならない。遊離した
脂肪酸エステルは一般に労働集約的な操作である滴定に
よυ測定する。この方法は正る′ｌであるが非常に時ｌ
５ｉ１がかがシ高くつく。この方法も乾式分析要素に適
応させることができない。

かくして、リパーゼ測定の先行技術方法は、非常に複雑
で多くの場合に新らしいエマルシ、／の使用を必９シと
する＃間のかかる分析を双した０発明の目的 本発明の目的は、リパーゼに特異的で乾式要素に容易に
適応させることができ、そして安定な成分を用いるり・
や−ゼ分析を提供することである。

発明の構成 本発明は、試、１」を（：）二つのα−エステル位の一
つに炭素数８個以上の長鎖のアルキル基を有し、そして
前記長鎖のアルキル基が加水分解される時生成するジエ
ステルが水溶性となるような二つの残シのエステル位に
短鎖のアルキル基を有する、グリセリントリエステル油
であるリパーゼ基質と（ｉｉ）水溶性グリセリンジエス
テルのグリセリンへの加水分解を触媒しうるエステラー
ゼ酵素とを含む少なくとも二つの試薬と接触させ、そし
てグリセリン生成速度を検出することによりリノぞ−ゼ
を測定することを特徴とする試料中の１ルＰ−ゼの定負
１方法にある。

本発明方法ｄ、二つの様式で実施′することができる。

湿式分析では二つの試薬を、分析すべき液体試料と接触
する組成物の形状で用いる。乾式様式では、液体試料が
接触する支持体止に試薬を被覆する。

前記第二番目の様式においては乾式分析ｇ素は支持体と
す・ヤーゼ測定の為の試薬ゾーンとを含んで成シ、前記
支持体がその土に （−）　　二つのα−エステル位の一つに少なくとも８
個の炭素７１Ｆ、子を含む長軸のアルキル茫鴫イ１１１
そして残シのエステル位に短鎖のアルキノトノ１１・Ｇ
治して前記長鎖のアル、キル基７５す１１水分即Ｃさｊ
する１ハ合、生成するジエステルが水溶性であるグリセ
リントリエステル油であるり・や−−＋−′基ａを含ん
で成るゾーンと、 （ｂ）　　水溶性グリセリンジエステルのグリセリンへ
の加水分解を触媒しうるエステラーゼ酵素を含。

んで成るゾーンであって、グリセリンの存在下において
色変化を生成しうるグリセリン検出及び消費試薬を含む
ゾーンとを有することを特徴きする。

本発明方法をリノ！−ゼ測定の間生じる反応シーケンス
を参照して説明する。本発明方法に従った反応のシーケ
ンスは図式的に示すと以下の通シである。

１ ａ）　　Ｃ０Ｃ−長鎖　　　　　　Ｃ−０ＨＣ−Ｏ−短
鎖　　　　　　Ｃ−ＯＨ及び（ｃ）　　グリセリン生成
速を川１ｐ１　宇。

前記シーケンスを参照して、最初の工程で用いる１１“
ｑ異的なリパーゼ塾和、及０次の工程でＪｌｉいるエス
テラーゼは本発明にとって臨界的である。エステラーゼ
基＊ｔよグリセリントリエステル油であって、前記グリ
セリントリエステル油は、二つのαエステル位の一つに
少なくとも８個の炭素原イを含む長鎖のアルキル基、を
有ｔ、、そして残シのエステル位に短鎖のアルキル基を
有して前記長鎖のアルキル基が加水分解される時、生成
するジエステルが水溶性である。第二の工作に用いるエ
ステラーゼは、水溶性グリセリンジエステルのグリセリ
ンへの加水分解を触媒しうるエステラーゼ１′？′素で
ある。本発明に有用なエステラーゼ酵素は水溶性グリセ
リンジエステルに活性であるが油状グリセリンエステル
には不活性である。それ故これら二つの成分を含む組成
物は、エステラーゼが油状リノヤーゼ基質に作用して組
成物のりｉｆ−ゼに対する感受性を低くするという心配
なしに長期間貯蔵することができる。

好ましい態様では、リパーゼは、内原性グリセリンを含
む試料中で検出される。試薬組成物には、前記特異的な
基質・及びエステラーゼ酵素の他にグリセリンの存在下
で色変化を生成しうるグリセリン検出及び消費試薬が含
まれる。これら好ましい態様に従って、この方法の最終
的な工程は、グリセリン検出及び消費試薬が試料中に存
在する実質的にすべての内原性グリセリンを消費した時
点で前記試薬によシ生成する色変化の速度を検出する工
程である。リパーゼの定量をグリセリンの検出に依存す
る反応シーケンスが内原性グリセリンの存在下において
前述のごと〈実施しうろことは特に予想されないことで
ある。

本発明方法を特に血清を参照して記載するが本発明は尿
及び髄液のような他の流体にも有用である。

試薬にはリパーゼの特異的な基ａが含まれる。

基質はグリセリントリエステルである。グリセリントリ
エステルのα位のたった一つに長鎖のアルキル基が存在
する。この長鎖のアルキル基は少なくとも８個、好まし
くは８〜２０個の炭素原子を有する。グリセリントリエ
ステルのα位の一つに長鎖を提供することによシ、基ａ
は油となシそしてそれ酸リパーゼの特異的な糸質となる
。ＭＬ理ずべき流体に存在する他の酵素はとの特異的な
基ａを含む反応を触媒しない。グリセリントリエステル
の残シの位的に短鎖のアルキル基が存在ｔ／、その結果
長鎖のアルキル基が加水分解される時生成するジエステ
ルは水溶性となる。°゛可溶件”という表現によシ、ジ
エステルが０．ＩＮの透明溶液を生成しうる稈度にまで
可溶性であることが意味される。通常短鎖の基の炭素数
＆′：ｔ　］〜４個である。

リパーゼが長鎖の基の加水分解を触媒した後、短鎖の７
％しｔ加水分解されてアシルａ４を遊離し、それはエス
テラーゼ酵素の助けによ、リグリ七リンとなる。この定
義内の有用な基＊　ｉＪ、　？界公知の方法により容易
に調製される。

好ましい態様ではグリセリントリエステルのα位の長鎖
の基の炭素数＆：１．８〜２０個であり−ｔ　ｌ、−て
短鎖の基の炭素ａは１〜２個であるう生成−１ノ）ジア
セチルグリセリンが第二の反応においてエステラーゼ酵
素によシグリセリンへ一層急速に加水分解されるのでこ
れら基質は好ましい。一般に好ましい基質は、本明細書
ではオレイルジアセチン又は単に０１）Ａとも呼ばれる
１−オレイル−２，３−ジアセトイルグリセリンである
。他の好ましい２Ｎ質には１−ミリストイル−２，３−
ジアセトイルグリセリン及び１−オクタノイル−２，３
−ジアセトイルグリセリンがある。

使用する糸質組成物は単一の１’Ｒ１製化合物である必
要はないが場合によっては化合物の混合物である。一つ
の市販の組成物はイーストマンコダック社から入手しう
るＭｙ・・・・、■である。この組成物は購入したまま
か又はたとえばカラムクロマトグラフィーによる精製処
理後に使用する。

第二の試薬はエステラーゼ酵素である。有用なエステラ
ーゼは長鎖基の加水分解から生じる水溶性ジエステルか
らの二つの短鎖アルキル基の加水分解を触媒しうる酵素
である。加水分解したジエステルは実質的にリパーゼ活
性がない。この特異的な基質及びとの／１ヶ異的な酵素
を用いることによシ、試料中にり・Ｐ−ゼが存在しなｈ
＝）れはグリセリンは生成しない。前ｎ１シ任扁のエス
テラーゼが試薬組成物に４１用である。イ〕用なエステ
ラーゼＱ」１短鎖”エステラーゼと叶Ｃ」れることかあ
り、イして小麦胚芽及びメレ／ジの皮そシ１，１次のよ
う〃種々の微生物源に見られる： バチルヌザブチリス（′ｌ’、ｎ、ＨＩｇｅｒｄ及びＪ
。

５ｐｌｙｉｙ、ｅｎ、　Ｊ、ＢＲｃｔ、＋　１］４＋ｐ
ｐ、Ｊ１８４−１］’１２＋１９７３参照）、ノカルジ
ア（Ｅ、ＦＪ二ｕｈ１１ｎｋ＋＋　ｒａｔａｌ、　Ｊ、
Ｂｎｃｔ、、１２０．ｐｐ、１］３３−１１４３＋１９
７４参照）。

ｐｐ、５６１−５６８　、１９６７参照）ツクひリーッ
ヵロミ＋スセレ４シエ（Ｗｈｅｅ］ｅｒ　１１ｎｄ　Ｊ
ｔｎｑｅ、、Ｊ、Ｇｊ＋ｎｐｒｎ１Ｍｌ　ｃｒｎｂｌｏ
ｌｎｇｙ、　７４＋　ｐｐ、　１８９−１！＋７．　Ｉ
！＋７３参照）。

・好ましい態様では、ニス７ラーセｊ　ｔＪ微生ｆｌｙ
ηパブルスザプテルスからのジアセブーブービである。

（この酵素ｔ」、アセチル基の加水分１ｑ子を迅速に触
媒するので”ジアセチナーゼと吋−はれる。−カミの酵
素は他の短鎖アルキル基の加水分解をも触媒しうるがそ
の速度はかなシ遅い。）一つの特に好ましい酵素はＢＳ
ジアセチナーゼＡＴＣＣＡ　３１９５４である。この酵
素は非常に特異的であシ、非常に活性でありそして実質
的にリパーゼ活性がないので好ましい。

もう一つの好ましい態様では試薬は、前述の特異的な酵
素及び特異的な基質の他にグリセリン検出及び消費試薬
をも含む。これらの試薬はグリセリンの存在下において
色変化を生成するととができ、かくしてグリセリンの存
在を検出する。加うるに、これら試薬はグリセリンを消
費することによυ色変化を生成する。これらの組成物は
内反性グリセリン含有試料の分析に有用である。グリセ
リン試薬は実質的にすべての内反性グリセリンを消費し
、そしてその後色変化の速度を測定しそしてリパーゼの
存在址と関連させる。

多くのこのようなグリセリン検出及び消費試薬は栗界で
知られている。たとえはグリセリンはアデノシントリホ
スフェ−）　（ＡＴＰ）及びグリセリンキナーゼの存在
下において転化してα−グリセリンホスフェート及びア
デノシンホスファート（Ａ１．）Ｐ）を生成Ｊる。一連
の反応を経てＡＩ）Ｐは色変化を生成する。即ち還元ニ
コチンアミドジヌクレメチド（ＮＡＤＨ）のニコチンア
ミドジヌクレｆヂド（ＮＡＤ）への転化によシ色変化を
生成する。この特別な反応及び他の同様な反応ｄ米国／
ｌ′ｆ訂第３．７０３５９１号に開示されている。他の
グリセリン検出及び消費試薬にはグリセリンオキシダー
−ビが含まれる。この型の試薬は米国特許第４，２５５
，５１９号に開示さｉｌでいる。

もう一つの好ましい？、す様ではグリセリン検出及び消
費試薬に一１α−グリセロホスフェ−トメキシダーゼ（
α−ＧＰＯ）が含まれる。との型つ試薬ｄ、米国特許第
４，２４１，１７８号に開示されている。このグリセリ
ン検出及び消費試薬にはアデノシントリホスフエー）　
（ＡＴＰ）　、グリセリンキナーゼ、電子受容体（た七
えば酸素）及びα−ｔ＝ｐｏが含まれる。これらの試薬
はグリセリンの存在下において過酸化水素を生成し、そ
してこの試薬には場合によりては還元染料及びペルオキ
シダーゼが含まれる。過酸化水素は還元染料及びペルオ
キシダーゼの存在下において検出可能な染料を生成する
。

反応シーケンスに従って、グリセリン及びＡＴＰはグリ
セリンキナーゼの存在下において反応しα−グリセロホ
スフェートを生成する。α−グリセロホスフェート及び
電子受容体はα−ＧＰＯの存在下において反応しジヒド
ロキシアセトンホスフェート及び検出可能な種を生成す
る。酸素が電子受容体の場合、検出可能な種は過酸化水
素である。好ましいグリセリン検出及び消費試薬に鳴用
な特異的な成分及びそれらの源は業界で知られている。

本発明の要素はコリＪＪ’−ゼのような補酵素を含むこ
とができる。コリ・卆−ゼの使用により分析精度が改良
されそしてｆｌｏの源からの妨害を低くすることが助け
られる。

本発明に係る方法は溶液及び乾式要素分析の両方に適用
するととができる。即ち、前記試薬組成物を含む溶液を
調製し、そして単に試料を試薬組成物へ添加することに
よシ試料中のリパーゼを測定する。溶液分析においてグ
リセリン生成速度を計算する一方法Ｖよ、反応の間に数
回にわたって反応混合物をザンゾリングする。各試料を
処理し−Ｃ反応を停止させる。次いでグリセリン生成速
１及を各試料中のグリセリンの蝦から計算する。グリセ
リンの量はクロマトグラフィー法のような任意の公知方
法によシ測定する。別法としては試薬組成物を米国特許
第３，９９２，１５８号に記載のような乾式要素に含め
、そして試料を甲に乾式卵重に７７１？ツトすることに
よシ試料中のり＆／　Ｐ　−−を測定する。

グリセリン検出試薬含有試薬層における色生成速度は次
いでグリ士すン生成速ＩＷへ関連で−げ、−そノ１は次
いで試料中の＋）　ノ９−ゼ油件へ関連さぜる。

基質及び酵素そして場合によってはｆｌ！２の試薬ｔｉ
ｔ要素のゾーンに紹み入れる。有用な要素にｔ」、たと
えば一般に」ｊ一層の個別のゾーンに試薬を含む浸漬及
び解読要素があり、そして前記要素のゾーンは載Ｉｎ層
である。

本発明方法は、グリセリン検出及び消費試薬が試料中の
実質的にすべての内反、性グリセリンを消費した後にグ
リセリン生成速度を測定する工程を含む。通゛帛内反性
グリセリンは迅速に消費され、そして試料が試薬組成物
と接触した後約２〜６分後のグリセリン生成速度は実質
的にす・や−ゼの存在にのみ由来する。非常に＾レベル
の内原性グリセリンを含む試料においてｔよグリセリン
検出試薬の検出限界は接近している。この、しうな試料
は稀釈することが望ましい。

グリセリン検出及び消費試薬組成物の種々の成分の濃度
は分析下の溶液、即ち血ｒＮ　（Ｋａ釈もしくは未稀釈
）、又はリノ！−ゼを含む尿のような曲の複合水性溶液
に依存して広範囲にわたって変化する。グリセリン検出
及び消費試薬の曖に関する詳細は、前記米国特許第３．
７０３．５９１号、同第４，２５５，５１．９号及び同
第４，２４１，１７８号のようなこれら試薬に関する文
献に見られる。

乾式要素が望ましい場合、試薬組成物成分は広範囲にわ
たる適用はで１−に存在する。一般にエステラーゼは１
００〜５０００■Ｕ／ｍ２、好ましくは２　（ｌ　ＯＯ
〜５０００　Ｈ）７ｍ２の獣で存在する。リパーゼ特異
基質しｊ、一般に１〜２（１ｇ／ｎｎ　　、好ましくは
５〜１５１／ｍ２の桁で存在する。

本発明方法は特に乾式要素に適する。被検体試料を要素
上にスポットすることによシ油状り・Ｐ−ゼ基質のエマ
ルションがその場で生成する。試料中のソノ９−ゼ活性
によシ油状グリセリンＩリエステルリ・ぞ−ゼ基質を水
溶性グリセリンジエステルへ転化する。次いでグリセリ
ンジエステルｔｒｉエマルション含有層からエステラー
ゼとグリセリン検出及び消費試薬とを含む層中へ拡散す
る。エステラーゼ層の位置は臨界的ではないが、グリセ
リン検出及び消費試薬はリパーゼ茫ｙＩ層とは別の層に
存在して生成色素が容易に検出しうろことが非常に望ま
しい。ある場合には、基η含有層４グリセリン検出層か
ら間隔（スぜ−ザー）Ｎ４を用いて分離する事が望まし
い。ゼラチンの」、うな親水性コロイドの間隔層がこの
目的に有用である。

種々の乾式要素型が有用である。ある態様ではたとえは
支持体を連続的に、グリセリン検出及び消費試薬含有層
、エステラーゼ含有層、す・Ｐ−ビ基質含有層及び拡散
層で被覆する。別の態様では、支持体をエステラーゼ酵
素とグリセリン検出及び消費試薬とを含む層、ゼラチン
間隔層及びソノ９−ゼ基質を含む拡散層で被覆する。

乾式要素に有用な支持体は寸法的に安定な支持体で、好
ましくは透明である。有用な支持体は米国特許第３．９
９２，１５８号に記載されておシ、ぞして好ましい支持
体はＩす（エチレンテレフタレート）である。

グリセリン検出及び消費試薬含有層は前記米国特許第４
，２４１．１７８号に記載の試薬を含むことができる。

この試薬組成物は被ルオキシダーゼを含み過酸化水素と
ロイコ染料との反応を触媒し着色染料を生成する。米国
特許第４，２４１，１７８号に記載の物質の他に、との
層は場合によってはラテックスを含み米国特許第４，２
８３，４９１号に記載されているように４ルオキシダー
ゼを安定化する。

乾式要素においてはエステラーゼ含有層は親水性バイン
ダ、緩衝剤及び界面活性剤を含むことができる。同様に
リパーゼ特異基質含有層は親水性バインダ、緩衝剤及び
非イオン性界面活性剤を含むことができる。基質含有層
に用いる界面活性剤は、３Ｍ社から入手しうるイルフル
オロメクタノエートアンモニウム塩であるアニオン性界
面活性剤ＦＣ−１４３■とすることができる。このよう
庁要素の応答は、この層に他の打面活性剤を含む聾素と
比較して改良される。

基質含有層の他の有用、な界面活性剤は、す／Ｐ　−ゼ
活性を阻害しない任意のｒｆ面活性剤を含む。市川な界
面活性剤にはトライトンＸ−２００■、アルキルアリー
ル号？リエーテルス四・ホネートのすトリウム塩及びプ
トリウムコレートがある。他のｒｉｉ　ｈ場合によって
は前述のような昇「０１活性剤と１クブルフェニル、Ｊ
？リエトキシエタノール（たとオ幻トライトンＸ−１０
０■）のような曲の界面活性剤とを含む。トライトン■
ｒｆ面活ゼ１゛剤ｉ１．　ｎ−１，丁ンドハース社から
入手するととができる。界面活ｔ゛１”削は層の被覆性
を改良しそしてスポット試料による層のぬれを加良する
のに十分なｍｌでｒｒ在する。−それは通常的０．１〜
１．　Ｑ　、＋７／７Ｍ２である。

有用な親水性バインダには酵素活性に影響を与えないフ
ィルム形成性で試料透過性の物質が含まれる。有用な親
水性バインダには写真技術において知られている親水性
バインダが含まれる。特に有用なバインダはたとえばゼ
ラチンであるＯ池の有用なバインダには、アクリルアミ
ドのポリマーのような合成ポリマーが含まれる。前記ア
クリルアミドポリマーはたとえばポリ（ｎ−プチルアク
リレートーコー〇−イソプロピルメタクリルアミド）ナ
トリウム塩、ハ？す（アクリルアミド）、７ｆ！す（ア
クリルアミド−ツーｎ−ビニル−２−ピロリドン）及び
ポリビニルピロリドン（以下）ぐインダＡと称す）であ
る。・ぐインダは試薬を懸濁しそして連続的な均一層を
形成するに十分な址で存在する。通常バインダは、試薬
層に２〜１５１／／ｍ’の量で存在する。

有用な緩衝剤は３７℃においてＰｌｌを７．５〜９．５
に維持しうるものである。緩衝剤は大部分のり）Ｊ？−
ゼの最適−１である一１約８．８に保持しうるものであ
ることが好ましい。有用な緩衝剤にはトリス（ヒドロキ
シメチル）アミツメクン及びその塩酸塩（以下トリス−
ＨＣｌと称す）及びＮ、’Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエ
チル）グリシン（以下ビシンと称す）が含まれる。緩衝
剤は曹累に分析すべき試料なス、！？ツトする時所望の
１・１１に保持゛〕るに十分な剣で存在する。通常緩衝
剤１ｔＪ−１，０〜７．５７１７ｍ２のｈｌで存在する
。

場合によっｒ　＆、Ｉ：リノや−ゼ基ｆｆ、ｌｊ、を３
む拡散層は広範囲の物質から構成する。好ましい拡散層
は前記米国／ＰＩ許第３，９９２，１５８号に開示され
ている。その曲の有用な拡散層は米国特Ｗｒ　ｒ汀４．
２Ｆｉ８．　（１１１１号にパ［′。

載されている。拡散層の組み合せも有用である。

たとえば米国特許第４，２ＦｉＲ，００１号の拡散層の
ような比較的大孔を有する拡散＠０、全血からＩ（ｎ　
漿苓分離〕汰散する為には米国特Ｗ「第３．９９２．　
］’！’ｉ８号に開示の多くの層のような比較的小孔を
治する層より有用である。ｐ紙又は炉布を米国特ｄ′［
第：１，９９２，１５８号の拡散層とｆｎ層して再び全
π１１かも血漿を分〜（ｆ拡散することができる。

適切な拡散層には、微結晶性セルロースのような微結晶
性コロイド物質及び小蝦のバインダが含まれる。この拡
散層は人間の膵臓のり・ぐ−ゼに関して実質的に不活性
であることが見い出された。

前記試薬は業界でよく知られた種々の要素中へ組み入れ
ることができる。本発明方法に用いるのに適する有用な
物質及び要素はたとえば、米国特許第：３，０９２，４
５６号、同第３，４１８，０９９号、同第３．４１８，
０８３号、同第２，８９３，８４３号、同第２，８９３
，８４４号、同第２，９１２．３０９号、同第３　、０
０８　、８７９号、同第３，８０２，８４２号、同第３
　、７９８　、０６４号、同第３．２９８．７３９号、
同第３，９１５，６４７号、同第３．９１７，４５３号
、同第３，９３３，５９４号及び同第３　、９３６　、
３５７号。

に記載されている。

実施例 以下の例によυ本発明方法の態様を説明する。

以下の列においてＩ）　ノ４−ゼの分析量を参照操作か
らの同一試料のリパーゼ穢と頻繁に比較する。参照操作
は水酸化ナトリウム１０ミリモルを充たした０、２５７
Ｉ７ビユレツトを用いて実施する。温度は３７℃に保持
する。トリオレインエマルジョン５ゴ敏を添加し、そし
て背景加水分解速度（即ちリパーゼ不存在における速度
）を記録した。＋）Ａ−ゼを含むと思われる試料をこの
エマルジョンへ添加した。水酸化プ用すウムで試オ゛１
を連続的に滴定することによシ加水分解の間に旧のＰｌ
ｌを８８に保持した。水酸化ナトリウムの添加速度をチ
ャートレコーダーで追跡し、そして、リパーゼ活性へ関
連させる（水酸化ナト、リウムを添加して加水分解によ
り生成した酸を中和するので）。この分析は１連続的ザ
ンプリング技術による血清中のり・や−ゼ活性測定の推
奨標準方法、Ｔ（ｅｔｚ　ｅｔ　ａｔ、・ＣＩ　Ｉｎ、
ｃｈｅｍ、　、　１９／１１．１２（３Ｂ〜４２７５（
１９７３）”に記載されている。

例１ 本発明方法を以下の型に従った乾式試験非単を調製する
ことにより説明した。

ｌ！１．１？金山 拡散−試薬層： 微結晶性セルロース、バインダＡ、ＯＤＡゼラチンスペ
ーサー： ゼラチン、トライトン■Ｘ−１００．ゼラチン硬ｆＥ／
ｊ１１グリセリン検出−酵素層： ゼラチン、アルカノ−Ｊ）ＸＣ，２，４−ジーｎ−ぺ２
軌フエノール。

染料、プレカーサー１．ラテックス２．ＡＴＰ、ＭｇＣ
１・６Ｈ２０，ゼラチン硬化剤、ピシン緩衝剤、　ＫＣ
ｌ。

被ルオキシダービ、グリセリンキナーゼ、α−ＧＰ０゜
８８　　ジアセチナーゼ 支持体、 ポリ（エチレンテレフタンート） ＋　　　［２（３，５−ジメトキシ−４−ヒト５キシフ
：ｔちル）−４，５−ビス（４−ジメテルアミノフェち
ル）イミメゾｉル〕２　　　ポリ（メタクリレ−十−ｒ
−２−アクリルアミド−２−メブスグーυｔ／スル示ン
酸−二一２−アセトアセトキシエチルメタクリレート）
前記被覆型におけるジアセチナーゼは以下のごとく調製
する酵素である。

Ａ、＠料 卵白のりゾテーム、牛の膵臓からのブ゛オキシリポニュ
ークレアーゼ（ＤＮ−１００）、牛のＨｔ臓からのリブ
ニューフレアーゼＡ（タイプ１−Ａ）、トリオレイン及
びアラビアゴムｄ、ミズリー州、セン１ルイスのジグ−
ケミカル、社から購入した。パクト（す酵母抽出物はミ
シガン州、デトロイトのシフコラプス（、Ｌａｂｓ）か
ら入手した。デマン（ｒ）ｅＭｉｒ＋ｎ）、ラゴッサ（
Ｒａｇｏｓｓａ）及びシャ４　（８）ＩＡｒｐｅ　）（
ＭＲ８）自前（ＣＭ　３５９）、酵母抽出物、ラブレノ
・コ■（Ｌａｂ　Ｌｅｍｃｏ”））粉末（’Ｌ’−２９
）　＜内袖出物肉汁）、イブトン（Ｌ−３４）及びメキ
ソイｌ’（Ｏｘｎｌｄ）寒天■■はカププのメンタリメ
州、オ〃ワのメキソイドカナダ社から購入した。ポリグ
リフール（Ｐ−２０００）（！ｊ）はミシガン州、ミツ
ｌ゛ランドのダウケミカル社から入手し７だ。シア七ヂ
ン、グルコース及び他の化学薬品は特にととわらない限
りニューヨーク州、ロチ、スターのイーストマンメーが
ニウクケミカルズから入手した。

Ｂ、培地 ＭＲ８培地　　　　　　　　／ｌ ペプトン（Ｌ−３４）　　　　　　　　　　　　１０．
０１１ラブレムコ■　粉末（Ｌ−２９）　　　　　　　
　　　　　　　８．０　ｇ酵母抽出物（オキソイド）　
　　　　　　　　　　　　４．ｏｇグルコース　　　　
　　　　　　　　　、：２ｏ、ｏｙトウイン０８０界面
活性剤　　　　　　　　　１．０　ｍｌリン酸水素カリ
ウム　　　　　　　　　　　２．０ｇ（Ｋ２ＨＰＯ４） 酢酸ナトリウムトリヒトレート　　　　　５．０ｇトリ
アンモニウムシトレー）　　　　　　　　２．０．１ｉ
＋硫酸マグネシウムへブタヒドレー）　　　　０．２１
９硫ｍマンガンテトラヒトレート０．０５．９寒天（オ
キソイド■■）　　　　　　　　２ｏ、ｏ９希硫酸でＰ
［Ｉを６．２に合わせた。

ジアセチン含有ＭＲ８培地　　　　　／ｌ前記ＭＲ８培
地　　　　　　　　　　　　７２．２５　ｇジアセチン
（フィルター滅菌）　　　　　　　　　２．０　ｍｌ塩
溶液Ｃ（改質）　　　　　／〆 塩化ナトリウム（ＮＲＣ／、）　　　　　　　　　　（
１，６ｇ塩化カルシウノ、ジヒドレート　　　　　　　
　　　　０．１ｇ硫酸第二鉄へブタヒドレ−）　　　　
　　　　　２．８＃モリブデン酸ナトリウムジヒドレー
ト　　　　　　０．１ｇ硫酸亜鉛へブタヒドレー）　　
　　　　　　０．０６　ｇ硫酸マンガンモノヒドレー）
　　　　　　　　　　　１．７ｇ硫酸マグネシウムへプ
タヒ、トレード２５．０ｇ＊出発溶液は０．ＩＮ塩酸で
あった。

酵母抽出物培地　　　　　　　／ｌ 硫酸アンモニウム　　　　　　　　　　　２．ＯＪ７リ
ン酸水素カリウム　　　　　　　　　　　２．０ｇ（Ｋ
２ＨＰＯ４） 酵母抽出物（パクト）　　　　　　　　　　　５．０．
！？塩溶液Ｃ（改質）　　　　　　　　　　　１０．０
ｍ／ＰＨは希硫酸で６．９に合せた。

酵母抽出物培地（前記）　　　　　　　　　９．０９ジ
アセチン（フィルターＨ菌）　　　　　　　　　２．　
Ｏｍ／ピルベート培地（ＰＭ）　　　　／ｌ ピルビン酸ナトリウム　　　　　　　　１０．（１酵母
抽出物　　　　　　　　　　　　　　５．０ｇリン酸水
素カリウム　　　　　　　　　　　２．０ｇ（Ｋ２ＨＰ
Ｏ４） 塩溶液Ｃ（改質）　　　　　　　　　　　１０．０ｍＡ
！（前記） ＰＨは６Ｎ塩酸で４．５に合せた。

Ｃ０操作 ４０℃において前記ピルベート培地における濃縮によシ
土壌試料から培養物を単離した。凍結土壌試料１０個を
解凍した。各土壌試料的１０ｇをピルベート培地的２５
ｍ／含有１２５ｍ／！容フラスコへ添加した。振盪せず
にフラスコを４０℃でインキュベートした。培地が濁っ
てきた時、３日以内におのおののＱ、　５　ｍｌをピル
ベート培地１０ｍ１を含む試験管へ移した。振盪せずに
４０℃でインキ−ベートして数日たった後、各試験管培
養物を１／１０に希釈し、０，２５チにおいてピルベー
トに懸濁させたＭＲ８培地及びぎルペート培地−ヒに塗
り、次いで２４〜４８時間インキ、−ベートした。これ
ら培養物の中で単離ＡＴＣＣＡ　３１９５４を選択した
。

培養物をＭＲ８培地上に維持した。ＭＲ８斜面を回転振
盪後円で４０しにおいてイン・ヤユペー　トリ、そして
毎週移した。

バクテリア培養物の増殖は前記種々の培養培地５０　ｍ
Ｎ：　２５０　ｍｌ容コニカルフラスコ中へ装入［２、
前記ＭＲ８斜面からの細胞を接種し、そして４０℃。

２００　ｒｐ＋ｎ　（偏心距離２イングー）で１２時間
・リイクロザーム（ＰＩ！ｙｃｒｏｔｈｅｒｍ）中でイ
〃１．−！−ｆすることにより実施し７たっ 物の調製 微生物細胞を以下の操作に従ったリゾブ″−ノ・処理に
よシ破壊した。、、１１７．０の０．　＋１５　Ｍリン
酸カリウム緩衝液中にリゾチーム１　ｍｙ　／ｍｌ　、
テ′オヤシリ？ニーークレアーゼｏ、　１ｍｙ／ｍＩ及
びリヂニ、−りレアーゼ０．１　ｍ９　／　ｍｌを含む
崩壊試薬を調製した。

培地６，６１からの典型的な細胞のパッチの重紙は５０
ｇであった。この細胞ペーストを崩壊試薬２５０ｍ／中
に懸濁させ（１７チ懸濁液）、３７℃にしそしてその温
度において３０分間１５０　ｒｐｍで回転する代謝振盪
機中でインキュベートした。

細胞を含まない抽出物は冷却遠心分離機を用いて３９０
００）ｌで１０分間遠心分離することにょシ調製した。

酵母抽出物培地７１を前述のごとく調製した。

培地１５両分（各１１　）ヲファーレンパッハフラスコ
中に装入し、そして、テリグリコール消泡剤１滴をおの
おのへ添加した。培地１５両分（各５０．０ｍ１）を２
５０ｍ１容コニカルフラスコ中へ装入した。

すべてを３０分間オートクレーブ滅滅菌した。フラスコ
を４０℃まで冷却した時、滅菌ジアセチンヲファーレン
パッハフラスコ（各２．０　ｍｌ　）　及０：コニカル
フラスコ（各５滴）へ添加した。

前記二つのコニカルフラスコのおのおのに、ＪＶＩＲ８
斜而（２〜３日培養）からの・ぐブルスサプチルスＡＴ
ＣＣＡ　３１９５４−白金耳を接種した。フラスコを４
０−℃において］辰ｊ！＋４１Ｘ埼−イン片、ベーター
を丹桟）で２０　Ｏｒｐｍで１２時間イン片ユペートし
た。

最もよく増殖したフラスコ（即ち最も濁ったフラスコ）
を用いて残り１２個のフラスコに接（φした。１２個の
フラスコのおのおのに接種物２．□　ｔｄを接種し、そ
して前述Ｑごとくインキ、−ｅ−１・した。次いで前記
ファーレンパッハフラスコ６個のおのおのに２個の残り
のフラスコの内容物を接種し、次いで４０℃のサイクロ
ザーノ＼中で１２時間インキ−−Ｊ−）Ｌだ。

各ファーレンツぐツバフラスコから両分を得、１／１０
の希釈物を調製した。おのおのの光学的濃度は６６０　
ｎｍにおいて読んだ。細胞は冷却遠心分離機（０〜４℃
、９０００ｒｐｍ、１５分間）を用いて遠心分離によシ
集め、次いて凍結貯蔵し７た。

５、酵素の部分的精製 微生物細胞の崩壊は前記リゾチーム処理にょシ実施した
。崩壊の後、懸濁液の全体積（最初の体積）８−測定し
た。懸濁液は温度が１０℃未満になるまで水浴中で撹拌
した。次いで細胞残層を除くコトナしに１５分間にわた
って冷ｎ−ゾロパノー／ｌ／　（−２０℃）を４０　％
　（Ｖ／Ｖ）の濃縮物へ添加した。最後の添加が終わっ
た後混合物を２０分間攪拌し、次いで５℃、　１０００
０　ｒｐｍで１ｏ分間遠心分離した。ベレッ）（４０％
ゾロノやノール両分から）を除去し、そして透明な黄色
上澄を再び水浴中に装入しそして攪拌した。再び１５分
間にわたって冷ｎ−ゾロ／４’ノールを添加し、ｎ−プ
ロ／ｆノール濃度を６０％（Ｖ／Ｖ）にした。との混合
物を３０分間攪拌し、次いで前述のごとく遠心分離した
。小さな黄色ベレット（４０〜６ｏチプロパノ一ル画分
から）を集め、ビーカーに入れそして４５分間撹拌する
ことによシ冷（５℃）０．０５Ｍリン酸カリウム緩衝液
中に懸濁した。くもった懸濁液を５℃において３９００
０ＸＦで１ｏ分間遠心分離し透明化した。透明な微黄色
生成物を凍結貯蔵した。

６、酵素測定 酵素活性の測定は、Ｈ−スクット■（Ｓｔｉｔ■）開側
（ラジオメーター、コベンハーダン）ニヨυ実施した。

標準反応混合物は全体ｆ？ｔ５．　Ｏｍｌ中に塩化カル
シウム５マイクロモル（１ｍ八り）及び種々の濃度の基
質を含んだ。ＰＩＩを７．５に合せ、そして混合物を３
７℃で平衡化した。反応を酵素添加により開始し、次い
で１Ｏ１４ミリモル水酸化ナトリウムの添加によりｐｌ
　＋を７．５に維持した。ブランク速度を測定し、そし
て各揚台の加水分解活性を水酸化ナトリウム添加の正味
直線速度から計Ｊ’Ｆ　Ｌ−た。

Ｐｌ（７，５において３７℃で１分間に１マイクロモル
の酸の生成（Ｎａ０ｒ目マイクロモル添加）を触媒する
酵累量が１単位であった。

以下に種々の培地を用いた微生物の増殖及びエステラー
ゼの生産を説明する。

下の操作に従って（、）酵母抽出物培地（ｈ）ジアセチ
ン含有酵母抽出物培地（両方とも前述）中で増殖させた
。

培地（ｂ）　５０　ｍｌ　Ｋ　Ｍｇ８斜而から・々チル
ス培倭物−白金耳を接種し、そして４０℃＋　２０　Ｏ
ｒｐｍで１２時間振盪機−インキュペーター中でインキ
ュベートした。この１２時間培養肉汁２ｍｌを用いて、
培地（ａ）　５　ｏ　ｍｌ含有コニカルフラスコ及び培
地（ｈ）５０ｍｌ含有コニカルフラスコに接種した。こ
れらフラスコを前述のごとくインキュベートした。

微生物細胞は５ｏｒｖａｌｌ■ＲＣ−２Ｂ冷却遠心分離
機（０〜４℃）を用いて９０００ｒｐｍで２０分間遠心
分離することによシ単離した。

Ｂ、　　Ｍｇ８培地 培養物を（ｃ）　Ｍｇ８培地及び（ｄ）ジアセチン含有
ＭＲ３培地で増殖させた以外はｉ４−　）　Ａを反復し
た。

酵素精製及び分析は前述のごと〈実施しだ。表１に表に
した結果によシ培地（ｃ）が最もよい全体的な増殖及び
酵素生産を提供したことが示される。

以下余白 表１ 活　　性 細胞増殖　　　　酵素生産 （、）酵母抽出物　　　４．４　　　９９　　　２２．
４（ｂ）酵母抽出物　　　８．８　　５５５　　　６３
．０＋　ジアセチン （ｃ）Ｍｇ８　　　　　　　８．４　　　６５７　　　
　７８．０（ｄ）　Ｍｇ８　　＋ジアセチン　　　５．
６　　　　３７１　　　　　　６８．（１人間の膵臓の
リパーゼ較正体６レベルを用いて乾式試験要素を較正し
た。較正体ｔよ人間の膵臓流体をプールした人間の血消
試第１へ添加することによ＃）調製した。得られた較正
体ｄ、光ガとし又トリオレインを用いた前記参照方法に
ょシ分析した。

彎素の較正は、要素に各較正体試料１０μｌをスポット
し、３７℃で７ｆＪ間インキュベートしそして反対側を
用いｉ６７０ｎｍにおける反射率＃度を読むことによシ
実施した。色生成速度１ｌ−Ｌ試料中の内原性グリセリ
ンがグリセリン検出及び消費試薬と反応した後の時点で
１分間測定した。その１分間はス、ポットの５〜６分後
であった。１分間にわたる反射濃度の変化（ΔＤ　Ｒ１
０）を、参照方法を用いて測定した膵臓のり・平−ゼ濃
度（Ｕ／ｌ）に対してプロットした。回帰分析にょシ直
線応答を測定し、傾き５．４　Ｘ　１０−５ΔＤＲ／ｆ
ＪＩＵ／ＩＩを得た・正の傾きの直線であったという事
実にょシ、この方法を較正することができ、そしてそれ
故未知量のリノｊ−ゼ含有試料を測定しうろことが示さ
れる。

例２ 以下の型に従った乾式試験要素を製造することによシ本
発明方法を説明した。

以下余白 拡散層： 微結晶性セルロース、バイ：／ｆｋ 試薬層： ＯＤＡ　　、　月？リ　（アクリルアミド）バインダ、
トリス−ＴｉＣＺ。

緩衝剤、トライトン■Ｘ−１（１０ ｒｊｙ素層： ゼジチン、小麦胚芽エステラービ、　ｔｒｌｓ−１１ｃ
ｔ緩衝剤、トライトン■Ｘ−ＪＯＯ グリセリン−検出−消費層： ゼラブツ、２，４−ジー具−−？ングルフェノール、染
ｒ１前翳ス１；（例１参照）、ラテックス（し１１１参
１ｉＱ　、　　ＡＴｐ　。

Ｍｇ　ＣＺ　・６　ｆ　＋　７　（１、ｌ−′ラテン硬
化剤、　＋：ン＞１Ｑ１ｑ削、　＋＜ｃ、（、。

被ルメキシダー１？、グリ＋リンＡ゛ノー−−１：”　
、　ｔで−ｊ；Ｐａ支持体： ポリ（エチレン）デレフタレー　１ 被覆組成物は、７チ（Ｗ／■）アラビアゴムに乳化させ
たｏＤＡ１ｏ６積％を有する水性組成物であった。

１＋ｌＪ　１と同様にして要素を人間の膵臓ソノ５−ゼ
較正体を用いて較正した。傾き１．５６Ｘ１０’Δｒ）
Ｒ／分／Ｕ／ｌは直線回帰データから計算した。

例３　リパーゼ測定方法におけるコＩ）　ｉ９−ゼの影
響 一つの要素がその拡散層に３３．（１００１）７ｍ２の
コリｚ４−ゼ（ペーリンガーマンハイムカラ入手）ヲ含
みそしてその試薬層に更にラテックスポリマーを含んだ
以外は二つの乾式試験要素を実ａ的に同じに製造した。

要素の組成及び型は以下の通シである；拡散ｌ崎： 二酸化チタン ミパケット（Ｍｙｖａｅｅｔ）　（基質）シ９−）ＤＳ
−１０（＋）！ｊウムドデシルベンゼンスルホネート）
コリ□−＋ｆ−３３，０００Ｕ／ｍ２　（一つの皆素の
み）下塗層： ポリ（ｎ−イン１０ビルアクリルアミド）グルノやラド
。

一ピラチン ＢＶＳＭＦＥ　（硬化剤） トライトン　Ｘ−２００ ラテックスポリマー アスコルペートオギシダーゼ 試薬層： ジアセチナーゼ（エステラーゼ） ゼラチン ＶＳＭＥ アルカノールＸＣ（界面活性剤） ＊ラテックスポリマー（一つの要素のみ）α−グリセロ
ホスフェートオキシダーゼ被ルメキシダーゼ グリセリンキナーゼ ビシン（緩衝剤） Ｃｔ ジメドン アデノシントリホスフェート ＭｇＣｌ２・６１１２０ ２．４−ジー　ローインチルフェノ−＃（ＫＳ−５２溶
媒）＊＊ロイコ染料 支持体 ＊ポリ（メタクリレート−ブー２−アクリルアミド−２
−メチルゾロパンスルホン酸−コー２−アセトアセトキ
シエチルメタクリレート）＊＊２（３，５−ジメトキシ
−４−ヒドロキシフエニル）−４，５−ビス（４−ジメ
チルアミノフェニル）イミダゾール 較正体流体は牛の血清アルブミン中に豚の膵′臓すノ！
−ゼ（）〜１７９０Ｕ／／を含んだ。

参照分析はｐＨ￥１−変えたスタット法であった。

患者の試料には１３〜２７００Ｕ／Ｊの正常及び異常値
のリパーゼが含まれ九〇 各要素に試料１０μｌをスチットし、〜５分間インキー
ベートし、そして反射濃度を５４０　ｎｍにおいて追跡
した。較正プロットにより、本発明要素から得られた値
と参照値との間にすぐれた相関があることが示される。

コリ・ｅ−ビ含有要素力・らランダムな偏りが除かれる
ことも明らかである。

これらデーターの正確なプロットも測定する。

コリＡ−ゼが存在した暁結果は、それが不存在の時４８
．Ｅｌ正確なゴール内であるのに比べて１００チ正確な
ゴール内であった。０ コリパーゼｔ：Ｉ：　、　リノソーゼに対−３る分析組
成物σ〕感＋＆を増大させるととにより、分析精度を改
良し、そして内厚性グリセリンのような妨害物からの偏
シを低くする。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、試料を、（ｉ）二つのα−エステル位の一つに炭素
   数８個以上の長鎖のアルキル基を有し、そして前記長鎖
   のアルキル基が加水分解される時生成するジエステルが
   水溶性となるよう二つの残シのエステル位に短鎖のアル
   キル基を有する、グリセリントリエステル油であるジノ
   ４−ゼ基質と、（ｉｉ）水溶性グリセリンジエステルの
   グリセリンへの加水分解を触媒しうるエステラーゼ酵素
   とを含む少なくとも二つの試薬と接触させ、そしてグリ
   セリン生成速度を検出することを特徴とする試料中のり
   ・母−ゼ定葉方法。 ２、前記二つの試薬を組成物の形で用いる特許請求の範
   囲第１項記載のＩＪ　／４’−ゼ定量方法。 ３、前記二つの試薬を支持体上に被覆する特許請求の範
   囲第１項記載のリパーゼ定量方法。 以下余白