JPH0376920B2 - - Google Patents

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JPH0376920B2
JPH0376920B2 JP58145148A JP14514883A JPH0376920B2 JP H0376920 B2 JPH0376920 B2 JP H0376920B2 JP 58145148 A JP58145148 A JP 58145148A JP 14514883 A JP14514883 A JP 14514883A JP H0376920 B2 JPH0376920 B2 JP H0376920B2
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lipase
glycerin
sample
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reagents
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JP58145148A
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JPS5948098A (ja
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Maikeru Rimutei Chaaruzu
Edowaado Babu Buryuusu
Chaaruzu Motsuku Jon
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Eastman Kodak Co
Original Assignee
Eastman Kodak Co
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Publication date
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Publication of JPH0376920B2 publication Critical patent/JPH0376920B2/ja
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    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14Hydrolases (3)
    • C12N9/16Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12N9/20Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205Bacterial isolates
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/44Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving esterase
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12RINDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07Bacillus
    • C12R2001/125Bacillus subtilis ; Hay bacillus; Grass bacillus

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Description

【発明の詳现な説明】 技術分野 本発明はリパヌれの枬定方法に関する。 埓来技術 本発明は血枅及び他の䜓液のような、内原性グ
リセリンをも含む詊料䞭のリパヌれ枬定に特に有
甚である。 グリセリン゚ステルの加氎分解を觊媒するリパ
ヌれは、むンタヌナシペナルナニオンオブバむオ
ケミストリヌInternational Union of
Biochemistryにより酵玠呜名法及ひ分類に基
づいおグリセリン゚ステルヒドラヌれず呌ばれ、
そしお呜名番号E.C.3.1.1.3を䞎えられおいる。 本発明に埓぀お枬定されるリパヌれは他の類䌌
酵玠ずは区別されるものである。これら他の類䌌
酵玠にはカルボン酞゚ステルヒドラヌれ及びアリ
ヌル゚ステルヒドロラヌれがある。カルボン酞゚
ステルヒドラヌれは短鎖脂肪酞のグリセリン゚ス
テルの加氎分解を觊媒し、そしお䞀䟡アルコヌル
の゚ステル及び二塩基酞の゚ステルの加氎分解を
觊媒する。アリヌル゚ステルヒドロラヌれは酢酞
プニルのような゚ステルの加氎分解を觊媒す
る。䞀方リパヌれは長鎖の脂肪酞のグリセリン゚
ステルに特異的であり、そしおグリセリン分子未
端の゚ステルの加氎分解を遞択的に觊媒する。リ
パヌれはこれら油状の氎䞍溶性グリセリン゚ステ
ルの油ず氎ずの界面にのみ䜜甚する。グリセリン
分子は、α䜍ず呌ばれる二぀の末端䜍眮ずβ䜍ず
呌ばれる䞭心䜍眮ずの䞉぀の可胜な゚ステル䜍眮
を有する。 血枅又は他の液䜓䞭のリパヌれの枬定は、皮々
の疟病を蚺断する際に重芁な助けずなる。たずえ
ば血枅䞭のリパヌれ含量の増倧は、急性膵炎、十
二指腞朰瘍及び腞管閉鎖症に芋られる。曎に高レ
ベルのリパヌれは膵臓癌の堎合に芋られる。かく
しお皮々の流䜓䞭のリパヌれのレベルを枬定する
為の胜力は重芁な蚺断手段である。 リパヌれの枬定が倚くの疟病の蚺断に有䟡であ
るにもかかわらず、この酵玠の分析は臚床研究宀
で頻繁に行われおいない。こうした理由ずしおは
次のこずが考えられる。即ち、リパヌれ枬定の公
知方法は比范的時間がかかり、そしお倚くの堎合
に䞍正確で非特異的であるからである。たずえば
最も䞀般的な方法の䞀぀は濁り枬定法である。こ
の方法を実斜する為には䞍溶性゚ステルを乳化す
る。分析すべき詊料をこの濁り゚マルシペンぞ添
加し、そしお詊料䞭のリパヌれによ぀お生じる枅
柄効果を枬定する。この方法に甚いる非垞に䞀般
的な䞍溶性゚ステルはトリオレむンずしおも知ら
れるグリセリントリオレヌトである。これは粟補
しお甚いるか又はオリヌブオむル䞭に存圚するも
のを盎接䜿甚する。しかしながら、この方法は詊
料䞭の小量のリパヌれには比范的感床が悪く、そ
しお高酵玠レベルでは良奜な盎線性を瀺さないこ
ずが知られおいる。曎に前蚘方法は也匏分析芁玠
に適応させるこずができない。 リパヌれ枬定の他の先行技術方法においおは、
脂肪酞゚ステルのリパヌれ觊媒加氎分解の結果遊
離する脂肪酞を枬定する。゚マルシペンの新らし
いバツチを各リパヌれ枬定の為に調補せねばなら
ない。遊離した脂肪酞゚ステルは䞀般に劎働集玄
的な操䜜である滎定により枬定する。この方法は
正確であるが非垞に時間がかかり高く぀く。この
方法も也匏分析芁玠に適応させるこずができな
い。 かくしお、リパヌれ枬定の先行技術方法は、非
垞に耇雑で倚くの堎合に新らしい゚マルシペンの
䜿甚を必芁ずする時間のかかる分析を芁した。 発明の目的 本発明の目的は、リパヌれに特異的で也匏芁玠
に容易に適応させるこずができ、そし安定な成分
を甚いるリパヌれ分析を提䟛するこずである。 発明の構成 本発明は、詊料を二぀のα−゚ステル䜍
の䞀぀に炭玠数個以䞊の長鎖のアルル基を有
し、そしお前蚘長鎖のアルキル基が加氎分解され
る時生成するゞ゚ステルが氎溶性ずなるような二
぀の残りの゚ステル䜍に短鎖のアルキル基を有す
る、グリセリントリ゚ステル油であるリパヌれ基
質ず氎溶性グリセリンゞ゚ステルのグリセ
リぞの加氎分解を觊媒しうる゚ステラヌれ酵玠ず
を含む少なくずも二぀の詊薬ず接觊させ、そしお
グリセリン生成速床を怜出するこずによりリパヌ
れを枬定するこずを特城ずする詊料䞭のリパヌれ
の定量方法にある。 本発明方法は二぀の様匏で実斜するこずができ
る。湿匏分析では二぀の詊薬を、分析すべき液䜓
詊料ず接觊する組成物の圢状で甚いる。也匏様匏
では、液䜓詊料が接觊する支持䜓䞊に詊薬を被芆
する。 前蚘第二番目の様匏においおは也匏分析芁玠は
支持䜓ずリパヌれ枬定の為の詊薬ゟヌンずを含ん
で成り、前蚘支持䜓がその䞊に (a) 二぀のα−゚ステル䜍の䞀぀に少なくずも
個の炭玠原子を含む長鎖のアルキ基を有し、そ
しお残りの゚ステル䜍に短鎖のアルキル基を有
しお前蚘長鎖のアルキル基が加氎分解される堎
合、生成するゞ゚ステルが氎溶性であるグリセ
リントリ゚ステル油であるリパヌれ基質を含ん
で成るゟヌンず、 (b) 氎溶性グリセリンゞ゚ステルのグリセリンぞ
の加氎分解を觊媒しうる゚ステラヌれ酵玠を含
んで成るゟヌンであ぀お、グリセリンの存圚䞋
においお色倉化を生成しうるグリセリン怜出及
び消費詊薬を含むゟヌンずを有するこずを特城
ずする。本発明方法をリパヌれ枬定の間生じる
反応シヌケンスを参照しお説明する。本発明方
法に埓぀た反応のシヌケンスは図匏的に瀺すず
以䞋の通りである。 及び (c) グリセリン生成速床枬定。 前蚘シヌケンスを参照しお、最初の工皋で甚い
る特異的なリパヌれ基質、及び次の工皋で甚いる
゚ステラヌれは本発明にず぀お臚界的である。゚
ステラヌれ基質はグリセリントリ゚ステル油であ
぀お、前蚘グリセリントリ゚ステル油は、二぀の
α゚ステル䜍の䞀぀に少なくずも個の炭玠原子
を含む長鎖のアルキル基を有し、そしお残りの゚
ステル䜍に短鎖のアルキル基を有しお前蚘長鎖の
アルキル基が加氎分解される時、生成するゞ゚ス
テルが氎溶性である。第二の工皋に甚いる゚ステ
ラヌれは、氎溶性グリセリンゞ゚ステルのグリセ
リンぞの加氎分解を觊媒しうる゚ステラヌれ酵玠
である。本発明に有甚な゚ステラヌれ酵玠は氎溶
性グリセリンゞ゚ステルに掻性であるが油状グリ
セリン゚ステルには䞍掻性である。それ故これら
二぀の成分を含む組成物は、゚ステラヌれが油状
リパヌれ基質に䜜甚しお組成物のリパヌれに察す
る感受性を䜎くするずいう心配なしに長期間貯蔵
するこずができる。 奜たしい態様では、リパヌれは、内原性グリセ
リンを含む詊料䞭で怜出される。詊薬組成物に
は、前蚘特異的な基質及び゚ステラヌれ酵玠の他
にグリセリンの存圚䞋で色倉化を生成しうるグリ
セリン怜出及び消費詊薬が含たれる。これら奜た
しい態様に埓぀お、この方法の最終的な工皋は、
グリセリン怜出及び消費詊薬が詊料䞭に存圚する
実質的にすべおの内原性グリセリンを消費した時
点で前蚘詊薬により生成する色倉化の速床を怜出
する工皋である。リパヌれの定量をグリセリンの
怜出に䟝存する反応シヌケンスが内原性グリセリ
ンの存圚䞋においお前述のごずく実斜しうるこず
は特に予想されおいないこずである。 本発明方法を特に血枅を参照しお蚘茉するが本
発明は尿及び髄液のような他の流䜓にも有甚であ
る。 詊薬にはリパヌれの特異的な基質が含たれる。
基質はグリセリントリ゚ステルである。グリセリ
ントリ゚ステルのα䜍のた぀た䞀぀に長鎖のアル
キル基が存圚する。この長鎖のアルキル基は少な
くずも個、奜たしくは〜20個を炭玠原子を有
する。グリセリントリ゚ステルのα䜍の䞀぀に長
鎖を提䟛するこずにより、基質は油ずなりそしお
それ故リパヌれの特異的な基質ずなる。凊理する
べき流䜓に存圚する他の酵玠はこの特異的な基質
を含む反応を觊媒しない。グリセリントリ゚ステ
ルの残りの䜍眮に短鎖のアルキル基が存圚し、そ
の結果長鎖のアルキル基が加氎分解される時生成
するゞ゚ステルは氎溶性ずなる。“可溶性”ずい
う衚珟により、ゞ゚ステルが0.1Nの透明溶液を
生成しうる皋床にたで可溶性であるこずが意味さ
れる。通垞短鎖の基の炭玠数は〜個である。
リパヌれが長鎖の基の加氎分解を觊媒した埌、短
鎖の基は加氎分解されおアシル基を遊離し、それ
ぱステラヌれ酵玠の助けによりグリセリンずな
る。この定矩内の有甚な基質は業界公知の方法に
より容易に調補される。 奜たしい態様ではグリセリントリ゚ステルのα
䜍の長鎖の基の炭玠数は〜20個でありそしお短
鎖の基の炭玠数は〜個である。生成するゞア
セチルグリセリンが第二の反応においお゚ステラ
ヌれ酵玠によりグリセリンぞ䞀局急速に加氎分解
されるのでこれら基質は奜たしい。䞀般に奜たし
い基質は、本明现曞ではオレむルゞアセチン又は
単にODAずも呌ばれる−オレむル−−
ゞアセトむルグリセリンである。他の奜たしい基
質には−ミリストむル−−ゞアセトむル
グリセリン及び−オクタノむル−−ゞア
セトむルグリセリンがある。 䜿甚する基質組成物は単䞀の粟補化合物である
必芁はないが堎合によ぀おは化合物の混合物であ
る。䞀぀の垂販の組成物はむヌストマンコダツク
瀟から入手しうるMyvacet である。この組成
物は賌入したたたか又はたずえばカラムクロマト
グラフむヌによる粟補凊理埌に䜿甚する。 第二の詊薬ぱステラヌれ酵玠である。有甚な
゚ステラヌれは長鎖基の加氎分解から生じる氎溶
性ゞ゚ステルからの二぀の短鎖アルキル基の加氎
分解を觊媒しうる酵玠である。加氎分解したゞ゚
ステルは実質的にリバヌれ掻性がない。この特異
的な基質及びこの特異的な酵玠を甚いるこずによ
り、詊料䞭にリパヌれが存圚しないければグリセ
リンは生成しない。前蚘任意の゚ステラヌれが詊
薬組成物に有甚である。有甚な゚ステラヌれは
“短鎖”゚ステラヌれず呌ばれるこずがあり、そ
しお小麊胚芜及びオレンゞの皮そしお次のような
皮々の埮生物源に芋られる バチルスサブチリスT.B.Higerd及びJ.
SpizizenJ.Bact.114pp.1184−1192、1973参
照、ノカルゞアE.F.Eubanks etalJ.Bact.
120、pp.1133−1143、1974参照、スクレロチナ
フアンヂSclerotina fungusOi and
SatomuraAgr.Biol.Chem.31pp.561−568、
1967参照及びサツカロミセスセレベシ゚
Wheeler and Rose J.General Micrcbiology
74pp.189−192、1973参照 奜たしい態様では、゚ステラヌれは埮生物バチ
ルスサブチルスからのゞアセチナヌれである。 この酵玠はアセチル基の加氎分解を迅速に觊
媒するので“ゞアセチナヌれ”ず呌ばれる。䞀方
この酵玠は他の短鎖アルキル基の加氎分解をも觊
媒しうるがその速床はなかり遅い。䞀぀の特に
奜たしい酵玠はBSゞアセチナヌれATCCNo.31954
である。この酵玠は非垞に特異的であり、非垞に
掻性でありそしお実質的にリパヌれ掻性がないの
で奜たしい。 もう䞀぀の奜たしい態様では詊薬は、前述の特
異的な酵玠及び特異的な基質の他にグリセリン怜
出及び消費詊薬をも含む。これらの詊薬はグリセ
リンの存圚䞋においお色倉化を生成するこずがで
き、かくしおグリセリンの存圚を怜出する。加う
るに、これら詊薬はグリセリンを消費するこずに
より色倉化を生成する。これらの組成物は内原性
グリセリン含有詊料の分析に有甚である。グリセ
リン詊薬は実質的にすべおの内原性グリセリンを
消費し、そしおその埌色倉化を速床を枬定しそし
おリパヌれの存圚量ず関連させる。 倚くのこのようなグリセリン怜出及び消費詊薬
は業界で知られおいる。たずえばグリセリンはア
デノシントリホスプヌトATP及びグリセ
リンキナヌれの存圚䞋においお転化しおα−グリ
セリンホスプヌト呌垯びアデノシンホスプヌ
トADPを生成する。䞀連の反応を経おADP
は色倉化を生成する。即ち還元ニコチンアミドゞ
ヌクレオチドNADHのニコチンアミドゞヌ
クレチドNADぞの転化により色倉化を生成
する。この特別な反応及び同様な反応は米囜特蚱
第3703591号に開瀺されおいる。他のグリセリン
怜出及び消費詊薬にはグリセリンオキシダヌれが
含たれる。この型の詊薬は米囜特蚱第4255519号
に開瀺されおいる。 もう䞀぀の奜たしい態様ではグリセリン怜出及
び消費詊薬にはα−グリセロホスプヌトオキシ
ダヌれα−GPOが含たれる。この型の詊薬
は米囜特蚱第4241178号に開瀺されおいる。この
グリセリン怜出及び消費詊薬にアデノシントリフ
オスプヌトATP、グリセリンキナヌれ、電
子受容䜓たずえば酞玠及びα−GPOが含た
れる。これらの詊薬はグリセリンの存圚䞋におい
お過酞化氎玠を生成し、そしおこの詊薬には堎合
によ぀おは還元染料及びペルオキシダヌれが含た
れる。過酞化氎玠は還元染料及びペルオキシダヌ
れの存圚䞋においお怜出可胜な染料を生成する。
反応シヌケンスに埓぀お、グリセリン及びATP
はグリセリンキナヌれの存圚䞋においお反応しα
−グリセロホスプヌトを生成する。α−グリセ
ロホスプヌト及び電子受容䜓はα−GPOの存
圚䞋においお反応しゞヒドロキシアセトンホスフ
゚ヌト及び怜出可胜な皮を生成する。酞玠が電子
受容䜓の堎合、怜出可胜な皮は過酞化氎玠であ
る。奜たしいグリセリン怜出及び消費詊薬に有甚
な特異的な成分及びそれらの源は業界で知られお
いる。 本発明の芁玠はコリパヌれのような補酵玠を含
むこずができる。コリパヌれの䜿甚により分析粟
床が改良されそしお他の源からの劚害を䜎くする
こずが助けられる。 本発明に係る方法は溶液及び也匏芁玠分析の䞡
方に適甚するこずができる。即ち、前蚘詊薬組成
物を含む溶液を調補し、そしお短に詊料を詊薬組
生物ぞ転化するこずにより詊料䞭のリパヌれを枬
定する。溶液分析においおグリセリン生成速床を
蚈算する䞀方法は、反応の間に数回にわた぀お反
応混合物をサンプリングする。各詊料を凊理しお
反応を停止させる。次いでグリセリン生成速床を
各詊料䞭のグリセリンの量から蚈算する。グリセ
リンの量はクロマトグラフむヌ法のような任意の
公知方法により枬定する。別法ずしおは詊薬組成
物を米囜特蚱第3992158号に蚘茉のような也匏芁
玠を含め、そしお詊料を単に也匏芁玠にスポツト
するこずにより詊料䞭のリパヌれを枬定する。グ
リセリン怜出薬料含有薬局における色生成速床は
次いでグリセリン生成速床ぞ関連させ、それは次
いで詊料䞭のリパヌれ掻性ぞ関連させる。 基質及び酵玠そしお堎合によ぀おは他の詊薬は
芁玠のゟヌンに組み入れる。有甚な芁玠にはたず
えば䞀般に単䞀局の個別のゟヌンに詊薬を含む浞
挬及び解読芁玠があり、そしお前蚘芁玠のゟヌン
は裁眮局である。 本発明方法は、グリセリン怜出及び消費詊薬が
詊料䞭の実質的にすべおの内原性グリセリンを消
費した埌にグリセリン生成速床を枬定する工皋を
含む。通垞内原性グリセリンは迅速に消費され、
そしお詊料が詊薬組成物ず接觊した埌玄〜分
埌のグリセリン生成速床は実質的にリパヌれの存
圚にのみ由来する。非垞に高レベルの内原性グリ
セリンを含む詊料においおはグリセリン怜出詊薬
の怜出限界は接近しおいる。このような詊料は皀
釈するこずが望たしい。 グリセリン怜出呌及び消費詊薬組成物の皮々の
成分の濃床は分析䞋の溶液、即ち血枅皀釈もし
くは未皀釈、又はリパヌれを含む尿のような他
の耇合氎性溶液に䟝存しお広範囲にわた぀お倉化
する。グリセリン怜出及び消費詊薬の量に関する
詳现は、前蚘米囜特蚱第3703591号、同第4255519
号及び同第4241178号のようなこれら詊薬に関す
る文献に芋られる。 也匏芁玠が望たしい堎合、詊薬組成物成分は広
範囲にわたる適甚量で局に存圚する。䞀般に゚ス
テラヌれは100〜5000IUm2、奜たしくは2000〜
5000IUm2の量で存圚する。リパヌれ特異基質
は䞀般に〜20m2、奜たしくは〜15m2
の量で存圚する。 本発明方法は特に也匏芁玠に適する。被怜䜓詊
料を芁玠䞊にスポツトするこずにより油状リパヌ
れ基質の゚マルシペンがその堎で生成する。詊料
䞭のリパヌれ掻性により油状グリセリントリ゚ス
テルリパヌれ基質を氎溶性グリセリンゞ゚ステル
ぞ転化する。次いでグリセリンゞ゚ステルぱマ
ルシペン含有から゚ステラヌれずグリセリン怜出
及び消費詊料ずを含む局䞭ぞ拡散する。゚ステラ
ヌれ局の䜍眮は臚界的ではないが、グリセリン怜
出及び消費詊料はリパヌれ基質局ずは別の局に存
圚しお生成色玠が容易に怜出しうるこずが非垞に
望たしい。ある堎合には、基質含有局をグリセリ
ン怜出局から間隔スペヌサヌ局を甚いお分離
する事が望たしい。れラチンのような芪氎性コロ
むドの間隔局がこの目的に有甚である。 皮々の也匏芁玠型が有甚である。ある態様では
たずえば支持䜓を連続的に、グリセリン怜出及び
消費詊薬含有局、゚ステラヌれ含有局、リパヌれ
基質含有局及び拡散局で被芆する。別の態様で
は、支持䜓を゚ステラヌれ酵玠ずグリセリン怜出
及び消費詊料ずを含む局、れラチン間隔局及びリ
パヌれ基質を含む拡散局で被芆する。 也匏芁玠に有甚な支持䜓は寞法的に安定な支持
䜓で、奜たしくは透明である。有甚な支持䜓は米
囜特蚱第3992158号に蚘茉されおおり、そしお奜
たしい支持䜓はポリ゚チレンテレフタレヌト
である。 グリセリン怜出及び消費詊薬含有局は前蚘米囜
特蚱第4241178号に蚘茉の詊薬を含むこずができ
る。この詊薬組成物はペルオキシダヌれを含み過
酞化氎玠ずロむコ染料ずの反応を觊媒し着色染料
を生成する。米囜特蚱第4241178号に蚘茉の物質
の他に、この局は堎合によ぀おはラテツクスを含
み米囜特蚱第4283491号に蚘茉されおいるように
ペルオキシダヌれを安定化する。 也匏芁玠においおぱステラヌれ含有局は芪氎
性バむンダ、緩衝剀及び界面掻性剀を含むこずが
できる。同様にリパヌれ特異質含有局は芪氎性バ
むンダ、緩衝剀及び非むオン性界面掻性剀を含む
こずができる。基質含有局に甚いる界面掻性剀
は、3M瀟から入手しうるペルフルオロオクタノ
゚ヌトアンモニりム塩であるアニオン性界面掻性
剀FC−143 ずするこずができる。このような芁
玠の応答は、この局に他の界面掻性剀を含む芁玠
ず比范しお改良される。 基質含有局の他の有甚な界面掻性剀は、リパヌ
れ掻性を阻害しない任意の界面掻性剀を含む。有
甚な界面掻性剀にはトラむント−200 、アル
キルアリヌルポリ゚ヌテルスルホネヌトのナトリ
りム塩及びナトリりムコレヌトがある。他の局は
堎合によ぀おは前述のような界面掻性剀ずオクチ
ルプニルポリ゚トキシ゚タノヌルたずえばト
ラむトン−100 のような他の界面掻性剀ず
を含む。トラむトン 界面掻性剀はロヌムアンド
ハヌス瀟から入手するこずができる。界面掻性剀
は局の被芆性を改良しそしおスポツト詊料による
局のぬれを加良するのに十分な量で存圚する。そ
れは通垞玄0.1〜1.0m2である。 有甚な芪氎性バむンダには酵玠掻性に圱響を䞎
えないフむルム圢成性で詊料透過性の物質が含た
れる。有甚な芪氎性バむンダには写真技術におい
お知られおいる芪氎性バむンダが含たれる。特に
有甚なバむンダはたずえばれラチンである。他の
有甚なバむンダには、アクリルアミドのポリマヌ
のような合成ポリマヌが含たれる。前蚘アクリル
アミドポリマヌはたずえばポリ−ブチルアク
リレヌト−コ−−む゜プロピルメタクリルアミ
ドナトリりム塩、ポリアクリルアミド、ポ
リアクリルアミド−コ−−ビニル−−ピロ
リドン及びポリビニルピロリドン以䞋バむン
ダず称すである。バむンダは詊薬を懞濁しそ
しお連続的な均䞀局を圢成するに十分な量で存圚
する。通垞バむンダは、詊薬局に〜15m2の
量で存圚する。 有甚な緩衝剀は37℃においおPHを7.5〜9.5に維
持しうるものである。緩衝剀は倧郚分のリパヌれ
の最適PHであるPH箄8.8に維持しうるものである
こずが奜たしい。有甚な緩衝剀にはトリスヒド
ロキシメチルアミノメタン及びその塩酞塩以
䞋トリス−HClず称す及び−ビス−
ヒドロキシ゚チルグリシン以䞋ビシンず称
すが含たれる。緩衝剀は芁玠に分析すべき詊料
をスポツトする時所望のPHに保持する十分な量で
存圚する。通垞緩衝剀は1.0〜7.5m2の量で存
圚する。 堎合によ぀おはリパヌれ基質を含む拡散局は広
範囲の物質から構成する。奜たしい拡散局は前蚘
米囜特蚱第3992158号に開瀺されおいる。その他
の有甚な拡散局は米囜特蚱第4258001号に蚘茉さ
れおいる。拡散局の組み合せも有甚である。たず
えば米囜特蚱第4258001号の拡散局のような比范
的倧孔を有する拡散局は、党血から血挿を分離拡
散する為には米囜特蚱第3992158号に開瀺の倚く
の局のような比范的小孔を有する局より有甚であ
る。玙又は垃を米囜特蚱第3992158号の拡散
局ず積局しお再び党血から血挿を分離拡散するこ
ずができる。 適切な拡散局には、埮結晶性セルロヌスのよう
な埮結晶性コロむド物質及び小量のバむンダが含
たれる。この拡散局は人間の膵臓のリパヌれに関
しお実質的に䞍掻性であるこずが芋い出された。 前蚘詊薬は業界でよく知られた皮々の芁玠䞭ぞ
組み入れるこずができる。本発明方法に甚いるの
に適する有甚な物質及び芁玠はたずえば、米囜特
蚱第3092456号、同第3418099号、同第3418083号、
同第2893843号、同第2893844号、同第2912309号、
同第3008879号、同第3802842号、同第3798064号、
同第3298739号、同第3915647号、同第3917453号、
同第3933594号及び同第3936357号、に蚘茉されお
いる。 実斜䟋 以䞋の䟋により本発明方法の態様を説明する。
以䞋の䟋においおリパヌれの分析量を参照操䜜か
らの同䞀詊料のリパヌれ量ず頻繁に比范する。参
照操䜜は氎酞化ナトリり10ミリモルを充たした
0.25mlビナレツトを甚いお実斜する。枩床は37℃
に保持する。トリオレむン゚マルゞペンml量を
添加し、そしお背景加氎分解速床即ちリパヌれ
䞍存圚における速床を蚘録した。リパヌれを含
むず思われる詊料をこの゚マルゞペンぞ添加し
た。氎酞化ナトリりムで詊料を連続的に滎定する
こずにより加氎分解の問詊料のPHを8.8に保持し
た。氎酞化ナトリりムの添加速床をチダヌトレコ
ヌダヌで远跡し、そしお、リパヌれ掻性ぞ関連さ
せる氎酞化ナトリりムを添加しお加氎分解によ
り生成した酞を䞭和するので。この分析は“連
続的サンプリング技術による血枅䞭のリパヌれ掻
性枬定の掚奚暙準方法、Tietz et alClin.
Chem.1911、1268〜12751973”に蚘茉され
おいる。 䟋  本発明方法を以䞋の型に埓぀た也匏詊隓芁玠を
調補するこずにより説明した。 拡散−詊薬局 埮結晶性セルロヌス、バむンダ、ODA れラチンスペヌサヌ れラチン、トラむトン −100、れラチン硬
化剀 グリセリン怜出−酵玠局 れラチン、アルカノヌル XC、−ゞ−
−ペンチルプノヌル、染料、プレカヌサヌ1、
ラテツクス2、ATP、MgCl.6H2O、れラチン硬
化剀、ビシン緩衝剀、KCl、ペルオキシダヌれ、
グリセリンキナヌれ、α−GPO、BSゞアセチナ
ヌれ 支持䜓 ポリ゚チレンテレフタレヌト  〔−ゞメトキシ−−ヒドロキシ
プニル−−ビス−ゞメチルアミ
ノプニルむミダゟヌル〕  ポリメタクリレヌト−コ−−アクリルア
ミド−−メチルプロパンスルホン酞−コ−
−アセトアセトキシ゚チル メタクリレヌト 前蚘被芆型におけるゞアセチナヌれは以䞋のご
ずく調補する酵玠である。  材料 卵癜のリゟチヌム、牛の膵臓からのデオキシ
リボニナヌクレアヌれDN−100、牛の膵臓
からのリボニナヌクレアヌれタむプ−
、トリオレむン及びアラビアゎムはミズリ
ヌ州、セントルむスのシグマケミカル瀟から賌
入した。バクト 酵母抜出物はミシガン州、デ
トロむトのゞフコラブスLabsから入手し
た。デアンDe Mann、ラゎツサ
Ragossa及びシダヌペSharpeMRS
肉汁CM 359、酵母抜出物、ラブレムコ
Lab Lemco 粉末−29肉抜出物肉
汁、ペプトン−34及びオキ゜むド
Oxoid寒倩 はカナダのオンタリオ州、
オタワのオキ゜むドカナダ瀟から賌入した。ポ
リグリコヌル−2000 はミンガン州、ミ
ツドランドのダりケミカル瀟から入手した。ゞ
アセチン、グリコヌス及び他の化孊薬品は特に
こずわらない限りニナヌペヌク州、ロチ゚スタ
ヌのむヌストマンオヌガニツクケミカルズから
入手した。  培地 MRS培地  ペプトン−34 10.0 ラブレムコ 粉末−29 8.0 酵母抜出物オキ゜むド 4.0 グルコヌス 20.0 トりむン 80界面掻性剀 1.0ml リン酞氎玠カリりムK2HPO4 2.0 酢酞ナトリりムトリヒドレヌト 5.0 トリアンモニりムシトレヌト 2.0 硫酞マグネシりムヘプタヒドレヌト 0.2 硫酞マンガンテトラヒドレヌト 0.05 寒倩オキ゜むド  20.0 垌硫酞でPHを6.2に合わせた。 ゞアセチン含有MRS培地  前蚘MRS培地 72.25 ゞアセチンフむルタヌ滅菌 2.0ml 塩溶液改質  塩化ナトリりムNaCl 0.6 塩化カルシりムゞヒドレヌト 0.1 硫酞第二鉄ヘプタヒドレヌト 2.8 モリブテン酞ナトリりムゞヒドレヌト 0.1 硫酞亜鉛ヘプタヒドレヌト 0.06 硫酞マンガモノヒドレヌト 1.7 硫酞マグネシりムヘプタヒドレヌト 25.0 出発溶液は0.1N塩酞であ぀た。 酵母抜出培地  硫酞アンモニりム 2.0 リン酞氎玠カリりムK2HPO4 2.0 酵母抜出物バクト 5.0 塩溶液改質 10.0ml PHは垌硫酞で6.9に合せた。 ゞアセチン含有酵母抜出培地  酵母抜出物培地前蚘 9.0 ゞアセチンフむルタヌ滅菌 2.0ml ピルベヌト培地PM  ピルビン酞ナトリりム 10.0 酵母抜出物 5.0 リン酞氎玠カリりムK2HPO4 2.0 塩溶液改質前蚘 10.0ml PHは6N塩酞で4.5に合せた。  操䜜  バチルスサブチルスの単離 40℃においお前蚘ピルベヌト培地における
濃瞮により土壌詊料から培逊物を単離した。
凍結土壌詊料10個を解凍した。各土壌詊料玄
10をピルベヌト培地玄25ml含有125ml容フ
ラスコぞ添加した。振盪せずにフラスを40℃
でむンキナベヌト。培地が濁぀おきた時、
日以内におのおのの0.5mlをピルベヌト培地
10mlを含む詊隓管に移した。振盪せずに40℃
でむンキナベヌトしお数日た぀た埌、各詊隓
管培逊を10に垌釈し、0.25においおピ
ルベヌトに懞濁させたMRS培地及びピルベ
ヌト培地䞊に塗り、次いで24〜48時間むンキ
ナベヌトした。これら培逊物の䞭で単離
ATCCNo.31954を遞択した。  培逊物の維持及び増殖 培逊物をMRS培地䞊に維持した。MRS斜
面を回転振盪機内で40℃においおむンキナベ
ヌトし、そしお毎週移した。 バクテリア培逊物の増殖は前蚘皮々の培逊
培地50mlを250ml容コニカルフラスコ䞭ぞ装
入し、前蚘MRS斜面からの现胞を接皮し、
そしお40℃、200rp偏心距離むンチ
で12時間サむクロサヌムPsycrotherm䞭
でむンキナベヌトするこずにより実斜した。  埮生物现胞の砎壊及び现胞を含たない抜出
物の調補 埮生物现胞を以䞋の操䜜に埓぀たリゟチヌ
ム凊理により砎壊した。PH7.0の0.05Mリン
酞カリりム衝撃液䞭にリゟチヌムmgml、
デオキシリボニナヌクレアヌれ0.1mgml及
びリボニナヌクレアヌれ0.1mgmlを含む厩
壊詊薬を調補した。培地6.6からの兞型的
な现胞のバツチの重量は50であ぀た。この
现胞ペヌストを厩壊詊薬250ml䞭に懞濁させ
17懞濁液、37℃にしそしおその枩床にお
いお30分間150rpで回転する代謝振盪機䞭
でむンキナベヌトした。现胞を含たない抜出
物は冷华遠心分離機を甚いお39000×で10
分間遠心分離するこにより調補した。  酵玠の生産 酵母抜出培地を前述のごずく調補し
た。培地画分各をフアヌレンバツ
ハフラスコ䞭に装入し、そしお、ポリグリコ
ヌル消泡剀滎をおのおのぞ添加した。培地
15画分各50.0mlを250ml容コニカルフラ
スコ䞭ぞ装入した。すべおを30分間オヌトク
レヌブ滅菌した。フラスコを40℃たで冷华し
た時、滅菌ゞアセチンをフアヌレンバツハフ
フラスコ各2.0ml及びコニカルフラスコ
各滎ぞ添加した。 前蚘二぀のコニカルフラスコのおのおの
に、MRS斜面〜日培逊からのバチ
ルスサブチルスATCCNo.31954−癜金耳を接
皮した。フラスコを40℃においお振盪機−む
ンキナベヌタヌを甚いお200rpで12時間む
ンキナベヌトした。 最もよく増殖したフラスコ即ち最も濁぀
たフラスコを甚いお残り12個のフラスコに
接皮した。12個のフラスコのおのおのに接皮
物2.0mlを接皮し、そしお前述のごずくむン
キナベヌトした。次いで前蚘フアヌレンバツ
ハフラスコ個おののおのに個の残りのフ
ラスコの内容物に接皮し、次いで40℃のサむ
クロサヌム䞭で12時間むンキナベヌトした。 各フアヌレンバツハフラスコから画分を
埗、10の垌釈物を調補した。おのおのの
光孊的濃床は660nにおいお読んだ。现胞
は冷华遠心分離機〜℃、9000rpm、15
分間を甚いお遠心分離により集め、次いで
凍結貯蔵した。  酵玠の郚分的粟補 埮生物现胞の厩壊は前蚘リゟチヌム凊理に
より実斜した。厩壊の埌、懞濁液の党䜓積
最初の䜓積を枬定した。懞濁液は枩床が
10℃未満になるたで氷济䞭で撹拌した。次い
で现胞残屑を陀くこずなしに15分間にわた぀
お冷−プロパノヌル−20℃を40
の濃瞮物ぞ添加した。最埌の添加
が終぀た埌混合物を20分間撹拌し、次いで
℃、10000rpmで10分間遠心分離した。ペレ
ツト40プロパノヌル画分からを陀去
し、そしお透明な黄色䞊柄を再び氷济䞭に装
入しそしお撹拌した。再び15分間にわた぀お
冷−プロパノヌルを添加し、−プロパノ
ヌル濃床を60にした。この混合
物を30分間撹拌し、次いで前述のごく遠心分
離した。小さな黄色ペレツト40〜60プロ
パノヌル画分からを集め、ビヌカヌに入れ
そしお45分間撹拌するこずにより冷℃
0.05Mリン酞カリりム緩衝液䞭に懞濁した。
くも぀た懞濁液を℃においお39000×で
10分間遠心分離し透明化した。透明な埮黄色
生成物を凍結貯蔵した。  酵玠枬定 酵玠掻性の枬定はPH−スタツト Stat
蚈枬ラゞオメヌタヌ、コペンハヌゲ
ンにより実斜した。暙準反応混合物は党䜓
積5.0ml䞭に塩化カルシりムマむクロモル
及び皮々の濃床の基質を含んだ。
PHを7.5に合せ、そしお混合物を37℃ず平衡
化した。反応を酵玠添加により開始し、次い
で10.4ミリモル氎酞化ナトリりムの添加によ
りPHを7.5に維持した。ブランク速床を枬定
し、そしお各堎合の加氎分解掻性を氎酞化ナ
トリりム添加の正味盎線速床から蚈算した。
PH7.5においお37℃で分間にマむクロモ
ルの酞の生成NaOH1マむクロモル添加
を觊媒する酵玠量が単䜍であ぀た。 以䞋に皮々の培地を甚いた埮生物の増殖及び゚
ステラヌれの生産を説明する。  酵母抜出物培地 バチルスサブチルスATCCNo.31954埮生物を
以䞋の操䜜に埓぀お(a)酵母抜出物培地(b)ゞアセ
チン含有酵母抜出物培地䞡方ずも前述䞭で
増殖させた。 培地(b)50mlにMRS斜面からバチルス培逊物
−癜金耳を接皮し、そしお40℃、200rpmで12
時間振盪機−むンキナベヌタヌ䞭でむンキナベ
ヌトした。この12時間培逊肉汁mlを甚いお、
培地(a)50ml含有コニカルフラスコ及び培地(b)50
ml含有コニカルフラスコに接皮した。これらフ
ラスコを前述のごずくむンキナベヌトした。 埮生物现胞はSorvall RC−2B冷华遠心分
離機〜℃を甚いお900rpmで20分間遠
心分離するこにより単離した。  MRS培地 培逊物を(c)MRS培地及び(d)ゞアセチン含有
MRS培地で増殖させた以倖はパヌトを反埩
した。 酵玠粟補及び分析は前述のごずく実斜した。
衚に衚にした結果により培地(c)が最もよい党
䜓的な増殖及び酵玠生産を提䟛したこずが瀺さ
れる。 【衚】 物ゞアセ
チン
(c)MRS 8.4 657 78.0
(d)MRSゞア 5.6 371 68.0
セチン
人間の膵臓のリパヌれ范正䜓レベルを甚いお
也匏詊隓芁玠を范正した。范正䜓は人間の膵臓
流䜓をプヌルした人間の血枅詊料ぞ添加するこ
ずにより調補した。埗られた范正䜓は基質ずし
おトリオレむンを甚いた前蚘参照方法により分
析した。芁玠の范正は、芁玠に各范正䜓詊料
10Όをスポツトし、37℃で分間むンキナベ
ヌトしそしお反射蚈を甚いお670nにおける
反射率濃床を読むこずにより実斜した。色生成
速床は詊料䞭の内原性グリセリンがグリセリン
怜出及び消費詊薬ず反応した埌の時点で分間
枬定した。その分間はスポツトの〜分埌
であ぀た。分間にわたる反射濃床の倉化
ΔDR分を、参照方法を甚いお枬定した膵
臓のリパヌれ濃床に察しおプロツト
した。回垰分析により盎線応答を枬定し、傟き
5.4×10-5ΔDR分を埗た。正の傟き
の盎線であ぀たずいう事実により、この方法を
范正するこずができ、そしおそれ故未知量のリ
パヌれ含有詊料を枬定しうるこずが瀺される。 䟋  以䞋の型に埓぀た也匏詊隓芁玠を補造するこず
により本発明方法を説明した。 拡散局 埮結晶性セルロヌス、バむンダ 詊薬局 ODA1、ポリアクリルアミドバむンダ、ト
リス−HCl緩衝剀、トラむトン −100 酵玠局 れラチン、小麊胚芜゚ステラヌれ、tris−HCl
緩衝剀、トラむトン −100 グリセリン−怜出−消費局 れラチン、−ゞ−−ペンチルプノヌ
ル、染料前駆䜓䟋参照、ラテツクス䟋
参照、ATP、MgCl、6H2O、れラチン硬化剀、
ビシン緩衝剀、KCl、ペルオキシダヌれ、グリセ
リンキナヌれ、α−GPO 支持䜓 ポリ゚チレンテレフタレヌト 被芆組成物は、アラビアゎムに
乳化させたODA10容積を有する氎性組成物で
あ぀た。 䟋ず同様にしお芁玠を人間の膵臓リパヌれ范
正䜓を甚いお范正した。傟き1.56×10-5ΔDR
分は盎線回垰デヌタから蚈算した。 䟋  リパヌれ枬定方法におけるコリパヌれの圱響 䞀぀の芁玠がその拡散局に33000Um2のコリ
パヌれベヌリンガヌマンハむムから入手を含
みそしおその詊薬局に曎にラテツクスポリマヌを
含んだ以倖は二぀の也匏詊隓芁玠を実質的に同じ
に補造した。 芁玠の組成及び型は以䞋の通りである 拡散局 二酞化チタン ミバケツトMyvacet基質 シポネヌトDS−10ナトリりムドデシルベンれ
ンスルホネヌト コリパヌれ33000Um2䞀぀の芁玠のみ 䞋塗局 ポリ−む゜プロピルアクリルアミド ゲルパツド れラチン BVSME硬化剀 トラむトン −200 ラテツクスポリマヌ アスコルベヌトオキサゞダヌれ 詊薬局 ゞアセチナヌれ゚ステラヌれ れラチン BVSME アルカノヌルXC界面掻性剀 ラテツクスポリマヌ䞀぀の芁玠のみ α−グリセロホスプヌトオキシダヌれ ペルオキシダヌれ グリセリンキナヌれ ビシン緩衝剀 KCl ゞメドン アデノシントリホスプヌト MgCl2・6H2O −ゞ−−ペチルプノヌルKS−52
溶媒 ロむコ染料 支持䜓 ポリメタリクリレヌト−コ−−アクリル
アミド−−メチルプロパンスルホン酞−コ−
−アセトアセトキシ゚チルメタクリレヌト −ゞメトキシ−−ヒドロキシ
プニル−−ビス−ゞメチルアミノ
プニルむミダゟヌル 范正䜓流䜓は牛の血枅アルブミン䞭に豚の膵臓
リパヌれ〜1790Uを含んだ。 参照分析はPHを倉えたスタツト法であ぀た。 患者の詊料には13〜2700Uの正垞及び異垞
倀のリパヌれが含たれた。 各芁玠に詊料10Όをスポツトし、〜分間む
ンキナベヌトし、そしお反射濃床を540nにお
いお远跡した。范正プロツトにより、本発明芁玠
から埗られた倀ず参照倀ずの間にすぐれた盞間が
あるこずが瀺される。コリパヌれ含有芁玠からラ
ンダムな偏りが陀かれるこずも明らかである。 これらデヌタヌの正確なプロツトも枬定する。
コリパヌれが存圚した時結果は、それ䞍存圚の時
48.8正確なゎヌル内であるのに比べお100正
確なゎヌル内であ぀た。 コリパヌれは、リパヌれに察する分析組成物の
感床を増倧させるこずにより、分析粟床を改良
し、そしお内原性グリセリンのような劚害物から
の偏りを䜎くする。 本発明方法は迅速で簡単なリパヌれ分析を提䟛
する。

Claims (1)

  1. 【特蚱請求の範囲】  詊料を、二぀のα−゚ステル䜍の䞀぀
    に炭玠数個以䞊の長鎖のアルキル基を有し、そ
    しお前蚘長鎖のアルキル基が加氎分解される時生
    成するゞ゚ステルが氎溶性ずなるよう二぀の残り
    の゚ステル䜍に短鎖のアルキル基を有する、グリ
    セリントリ゚ステル油であるリパヌれ基質ず、
    氎溶性グリセリンゞ゚ステルのグリセリン
    ぞの加氎分解を觊媒しうる゚ステラヌれ酵玠ずを
    含む少なくずも二぀の詊薬ず接觊させ、そしおグ
    リセリン生成速床を怜出するこずを特城ずする詊
    料䞭のリパヌれ定量方法。  前蚘二぀の詊薬を組成物の圢で甚いる特蚱請
    求の範囲第項蚘茉のリパヌれ定量方法。  前蚘二぀の詊薬を支持䜓䞊に被芆する特蚱請
    求の範囲第項蚘茉のリパヌれ定量方法。
JP58145148A 1982-08-11 1983-08-10 リパ−れの枬定方法 Granted JPS5948098A (ja)

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EP0101046A1 (en) 1984-02-22
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