JP2008306942A - リパーゼ測定用乾式分析要素 - Google Patents
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Abstract
【課題】膵リパーゼへの選択性が高い膵リパーゼ測定用乾式分析要素において、多検体相関を向上させた膵リパーゼ測定用乾式分析要素を提供すること。
【解決手段】炭素数12から22の長鎖アルキル脂肪酸のジグリセリドまたはトリグリセリド、モノグリセリドリパーゼ、及びグリセリン測定試薬を含有する少なくとも1つ以上の展開層及び/または試薬層を含む、体液中の膵リパーゼ測定用乾式分析要素において、前記展開層及び/または試薬層が、2種類以上のアニオン界面活性剤を含み、かつそのうちの少なくとも1種類がアルキルフェニルスルホン酸塩であることを特徴とする、体液中の膵リパーゼ測定用乾式分析要素。
【選択図】なし
【解決手段】炭素数12から22の長鎖アルキル脂肪酸のジグリセリドまたはトリグリセリド、モノグリセリドリパーゼ、及びグリセリン測定試薬を含有する少なくとも1つ以上の展開層及び/または試薬層を含む、体液中の膵リパーゼ測定用乾式分析要素において、前記展開層及び/または試薬層が、2種類以上のアニオン界面活性剤を含み、かつそのうちの少なくとも1種類がアルキルフェニルスルホン酸塩であることを特徴とする、体液中の膵リパーゼ測定用乾式分析要素。
【選択図】なし
Description
本発明は、液体試料、特に、ヒトおよび動物の血清、血漿中のリパーゼ活性、特に、膵リパーゼ活性を測定するための、簡便で精度の高い乾式分析要素に関するものである。本発明の乾式分析要素は、特にヒトおよびイヌの膵疾患診断に有用である。
膵疾患の診断に有用な膵リパーゼ分析は、膵リパーゼが油水界面で作用することから、水中に基質がミセル状に分散された状態で測定されることが多い。界面活性剤などにより可溶化した基質やアルキル鎖長の短い脂肪酸のグリセリドでは、リポプロテインリパーゼ等の非膵リパーゼやエステラーゼが反応することがあるからである。したがって、膵リパーゼ乾式分析要素を開発する際、重要な技術的ポイントは膵リパーゼに特異的な長鎖脂肪酸のグリセリド基質を膵リパーゼ特異的な状態で組み込むことと考えられる。
リパーゼを分析する乾式分析要素は、大きく2つに分類され、第一は、トリグリセリドを基質としグリセリン、過酸化水素を経て色素に変換する方法を用いるものであり、最初に開示された方法は、α位のエステル位の一つに炭素数8個以上の長鎖のアルキル基を有し、他の2つのエステルは短鎖のアルキル基を有するトリグリセリドを基質に用い、検体中のリパーゼにより生成した水溶性の1,2ジアセチルグリセリドをアセチナーゼというエステラーゼでグリセリンに変換し、グリセリンを色素に変換する多層乾式分析要素である(特開昭59-48098号公報)。この方法は、高精度で簡易なリパーゼ測定法であるが、膵リパーゼに対する選択性が高くなく膵疾患の診断には注意が必要であることが報告されている〔Clin. Chem., 37/3, 447-451 (1991) 〕。
また、トリオレインのような、炭素数14〜20の長鎖脂肪酸を有するトリグリセリドを基質に用いたトリグリセリドを基質とし、モノグリセリドリパーゼ、グリセリン測定試薬を含むドライケミストリー用膵リパーゼ分析試薬(特開平4-316500号公報)、さらに、この方法を応用し、精度が高い多層分析要素を作製し、さらに、微粒子を組み込むことでリパーゼの反応性を高めることを期した方法は特開2002-125699号公報に記載されている。これらトリオレインを用いる方法は膵リパーゼに特異性は高いが、脂溶性が高い基質を組み込むためアラビアゴム等の保護コロイドを用い、超音波処理による水系乳化分散を行っており(特開平4-316500号公報の実施例)、基質の分散の再現性や粒度分布の均一性を保つことが要求され、製造が困難であると考えられる。
例えば、特開平4-316500号公報では次のように記載されている。“トリオレインのような3つのエステル位全てに長鎖脂肪酸を有するトリグリセリドは乳化しにくい性質を持つため、ドライ試薬作製時に界面活性剤や保護コロイドの存在下でトリオレインを攪拌、超音波等の物理的な剪断力により均一に乳化分散した溶液として添加してもドライ状態にすると分散媒である水が無くなるために乳化物は凝集、合一し展開層表面に付着し、油水界面の表面積が極端に減少する。測定時に、このドライ試薬にリパーゼを含む検体(液体)を作用させても物理的な剪断力がないため、トリオレインは凝集、合一したまま元の分散状態には戻らない。リパーゼは油水界面が反応場であるため、油水界面の表面積の減少が反応速度を低下させる原因と考えられる。”
第2は、色素放出基質である1,2−O−ジラウリルーrac−グリセロ−3−グリタル酸・レゾルフィンエステルを用いる乾式分析要素である(特開平9-154598号公報)。この方法は、膵リパーゼ特異性が高く、かつ、グリセリン発色系が不要であるため、好ましい方法である。しかしながら、乾式分析要素に組み込まれた基質が極めて分解しやすく、低pHのリパーゼ基質含有層と高pHの他の試薬層を分離する試みをなされたものの実用化には至っていない。また、ここで、基質溶解に好ましいとされるエーテル系溶剤は、環境負荷が大きく環境考慮設計が求められる今日において、製造適性に深刻な問題がある。また、この基質が比較的高価なことも、実用化するのに問題となる。
上記の通り、現在に至っても、商品化されているリパーゼ分析用乾式分析要素は、膵リパーゼ特異性の高くない、特開昭59-48098号公報に記載の製品だけであり、市場から、膵疾患診断において、より信頼性の高い乾式分析要素が求められている。
Clin. Chem., 37/3, 447-451 (1991)
特開昭59-48098号公報
特開平4-316500号公報
特開2002-125699号公報
特開平9-154598号公報
本発明の目的は、膵リパーゼへの選択性が高い膵リパーゼ分析乾式分析要素において、多検体相関を向上させた膵リパーゼ分析乾式分析要素を提供することである。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、基質としての長鎖脂肪酸のグリセリド(好ましくはトリグリセリド)、モノグリセリドリパーゼ、及びグリセリン測定試薬を含む乾式分析要素において、2種以上のアニオン界面活性剤を含めることによって、多検体相関を向上させた膵リパーゼ分析乾式分析要素を提供できることを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明によれば、炭素数12から22の長鎖アルキル脂肪酸のジグリセリドまたはトリグリセリド、モノグリセリドリパーゼ、及びグリセリン測定試薬を含有する少なくとも1つ以上の展開層及び/または試薬層を含む、体液中の膵リパーゼ測定用乾式分析要素において、前記展開層及び/または試薬層が、2種類以上のアニオン界面活性剤を含み、かつそのうちの少なくとも1種類がアルキルアリールスルホン酸塩であることを特徴とする、体液中の膵リパーゼ測定用乾式分析要素が提供される。
好ましくは、アルキルアリールスルホン酸塩は、アルキルベンゼンスルホン酸塩である。
好ましくは、アルキルベンゼンスルホン酸塩は、アルキル基の鎖長が炭素数10〜14であるアルキルベンゼンスルホン酸塩である。
好ましくは、アルキルベンゼンスルホン酸塩は、直鎖ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム塩である。
好ましくは、アルキルアリールスルホン酸塩の添加量は0.1〜10g/m2である。
好ましくは、アルキルベンゼンスルホン酸塩は、アルキル基の鎖長が炭素数10〜14であるアルキルベンゼンスルホン酸塩である。
好ましくは、アルキルベンゼンスルホン酸塩は、直鎖ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム塩である。
好ましくは、アルキルアリールスルホン酸塩の添加量は0.1〜10g/m2である。
好ましくは、トリグリセリドはトリオレインである。
好ましくは、モノグリセリドリパーゼはジグリセリド及びトリグリセリドに実質的に作用しないモノグリセリドリパーゼであり、さらに好ましいのはバチルス・ステアロサーモフィラスH-165由来のモノグリセリドリパーゼである。
好ましくは、グリセリン測定試薬は、グリセロキナーゼとグリセロリン酸オキシダーゼと発色試薬から構成される。
好ましくは、モノグリセリドリパーゼはジグリセリド及びトリグリセリドに実質的に作用しないモノグリセリドリパーゼであり、さらに好ましいのはバチルス・ステアロサーモフィラスH-165由来のモノグリセリドリパーゼである。
好ましくは、グリセリン測定試薬は、グリセロキナーゼとグリセロリン酸オキシダーゼと発色試薬から構成される。
好ましくは、乾式分析要素の構成は、水不透過性支持体、試薬層および展開層からなる。
好ましくは、展開層は、布または多孔質膜からなるものである。
好ましくは、多孔質膜は、ポリビニルスルホンもしくはアセチルセルロースからなる多孔質膜、または微小ビーズから形成する多孔質膜である。
好ましくは、モノグリセリドリパーゼの添加量は8000U/m2から1000U/m2である。
好ましくは、展開層は、布または多孔質膜からなるものである。
好ましくは、多孔質膜は、ポリビニルスルホンもしくはアセチルセルロースからなる多孔質膜、または微小ビーズから形成する多孔質膜である。
好ましくは、モノグリセリドリパーゼの添加量は8000U/m2から1000U/m2である。
好ましくは、本発明の乾式分析要素は、低級アルコールまたはアセトンに溶解したジグリセリドまたはトリグリセリドを展開層または試薬層に添加して乾燥する工程を含む方法によって製造される。
好ましくは、ジグリセリドまたはトリグリセリドの乾燥方法は温風乾燥である。
好ましくは、ジグリセリドまたはトリグリセリドは、メタノール、エタノール、プロピルアルコールまたはアセトンに溶解されている。
好ましくは、ジグリセリドまたはトリグリセリドの乾燥方法は温風乾燥である。
好ましくは、ジグリセリドまたはトリグリセリドは、メタノール、エタノール、プロピルアルコールまたはアセトンに溶解されている。
本発明の別の側面によれば、上記した本発明の乾式分析要素に体液を適用して、該体液中の膵リパーゼを測定する方法が提供される。
好ましくは、体液はイヌ血液である。
好ましくは、体液はイヌ血液である。
トリオレインを基質とする膵リパーゼ測定用乾式分析要素を作製することにより膵リパーゼ特異的な分析が可能になったものの、多検体相関の相関係数は向上しなかった。原因を解析したところ、検体によって、コリパーゼによる膵リパーゼの活性化が不十分なことが原因であった。本発明では、直鎖ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムなどのアニオン界面活性剤を添加することで、高価なコリパーゼの添加量を増やすことなく、検体の膵リパーゼを活性化できることが見出した。その結果、本発明の膵リパーゼ測定用乾式分析要素を用いた分析では、多検体相関の相関係数が大きく向上した。
本発明の体液中の膵リパーゼ測定用乾式分析要素は、炭素数12から22の長鎖アルキル脂肪酸のジグリセリドまたはトリグリセリド、モノグリセリドリパーゼ、及びグリセリン測定試薬を含有する少なくとも1つ以上の展開層及び/または試薬層を含む、体液中の膵リパーゼ測定用乾式分析要素であって、前記展開層及び/または試薬層が、2種類以上のアニオン界面活性剤を含み、かつそのうちの少なくとも1種類がアルキルフェニルスルホン酸塩であることを特徴とする。
乾式分析要素を用いた分析では、検体を希釈することなく分析するため、検体に含まれる様々な成分の影響を受けやすい。本発明者らは、希釈検体を使用する分析法では問題にならなかったリパーゼ活性化の検体間差が、乾式分析要素を用いる分析で発生することを初めて見出した。このリパーゼ活性化の検体間差に関する問題を解決するためには、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムなどのアルキルフェニルスルホン酸塩の添加が有用であることが、本発明によって見出した。即ち、従来の乾式分析要素を用いた分析においては、一部の検体のリパーゼ反応不良のために、多検体相関が不良であった。この問題を解決するために、本発明では、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムなどのアルキルフェニルスルホン酸塩を乾式分析要素に添加することによって、相関係数を著しく向上させることに成功した。この効果は、相関で負誤差を生じていた検体のリパーゼ活性が回復したためである。
本発明の乾式分析要素は、2種類以上のアニオン界面活性剤を含み、かつそのうちの少なくとも1種類がアルキルアリールスルホン酸塩である。
本発明で用いるアニオン界面活性剤は、例えば、親水基が、カルボキシル基、スルホン酸基、硫酸エステル基、リン酸塩などを有すものが挙げられる。本発明で用いることができる好ましいスルホン酸基を有するアニオン界面活性剤は、アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキルナフタレンスルホン酸塩、アルキル硫酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸液、α‐オレフィンスルホン酸塩、N-アシルメチルタウリン塩である。疎水基の炭素数が12〜20程度が好ましい。これらの中で、リパーゼ活性を阻害せず、乾式分析要素に添加された酵素を失活させないものが好ましい。
この中で、好ましくは、アルキルベンゼンスルホン酸塩であり、アルキル鎖の炭素数10〜14がさらに好ましい。さらに好ましいのは、洗剤の主要成分となっている、炭素数が12である直鎖ドデシルベンゼンスルホン酸塩である。塩は、ナトリウム塩が好ましいが、カリウム塩、リチウム塩も使用できる。アルキルベンゼンスルホン酸を添加した後、乾式分析要素内で塩を形成させてもよい。
カルボキシ基を有するアニオン界面活性剤は、リパーゼ活性化作用がある胆汁酸塩が好ましく、デオキシコール酸塩、コール酸塩、タウロコール酸塩、タウロデオキシコール酸塩、デオキシタウロコール酸塩が好ましく、特に、デオキシコール酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸ナトリウムが好ましい。
本発明におけるアニオン界面活性剤の最適な組み合わせは、デオキシコール酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸ナトリウムと直鎖ドデシルベンゼンスルホン酸塩である。
本発明におけるアルキルアリールスルホン酸塩の添加量は、本発明の効果が達成できる限り特に限定されないが、好ましくは0.1〜10g/m2であり、より好ましくは0.2〜5g/m2であり、さらに好ましくは0.5〜5g/m2である。
本発明で使用するグリセリドは、長鎖アルキル鎖の脂肪酸からなるジグリセリドもしくはトリグリセリドである。長鎖アルキル鎖は飽和でも不飽和でもよい。長鎖アルキル鎖の脂肪酸のアルキル鎖長は、膵リパーゼへの選択性から炭素数12以上22以下であればよく、好ましくは炭素数16以上20以下である。以下に例を示す。
飽和脂肪酸の例は、ラウリン酸(C12:0)、ミリスチン酸(C14:0)、パルミチン酸(C16:0)、ステアリン酸(C18:0)、アラキン酸(C20:0)、ベヘン酸(C22:0)が挙げられる。不飽和脂肪酸の例は、パルミトオレイン酸(C16:1)、ペトロセリン酸(C11H23COOH)、オレイン酸(C18:1)、リノール酸(C18:1)、リノレン酸(C18:2)、エレステアリン酸(C18:3)、アラキドン酸(C20:4)等が挙げられる。好ましくは、オレイン酸、リノール酸のグリセリドである。特に、好ましいグリセリドは、オレイン酸のトリグリセリドであるトリオレインである。
また、本発明では、実質的にジグリセリドに反応しないモノグリセリドリパーゼ、および、従来からある信頼性の高いグリセリン発色試薬を用いる。層構成は、少なくとも1つ以上の展開層または試薬層があればよく、1層の試験紙でもよい。好ましくは、より測定精度と強度を高めるために、支持体と少なくとも1層以上の試薬層からなる多層分析要素を用いる。基質はエタノールなどの有機溶剤にトリオレイン等のグリセリドを溶解し、乾式分析用を組み込み、好ましくは、温風乾燥で乾燥させることができる。
本発明のリパーゼ測定用乾式分析要素の支持体層を構成するものとしては、光透過性でかつ水不透過性である支持体が用いることができる。光透過性・水不透過性支持体の例としては、ポリエチレンテレフタレート、ビスフェノールAのポリカルボネート、ポリスチレン、セルロースエステル(例、セルロースジアセテート、セルローストリアセテート、セルロースアセテートプロピオネート等)等のポリマーからなる厚さ約50μmから約1mm、好ましくは約80μmから約300μmの範囲のフィルムもしくはシート状の透明支持体を挙げることができる。
支持体の表面には必要により下塗層を設けて、支持体の上に設けられる反応層と支持体との接着を強固なものにすることができる。また、下塗層の代りに、支持体の表面を物理的あるいは化学的な活性化処理を施して接着力の向上を図ってもよい。
支持体の上には(場合によっては下塗層等の他の層を介して)反応層が設けられる。反応層はアナライトであるリパーゼと反応して光学的に検出可能な変化を生じる後述の試薬組成物の少なくとも一部が親水性ポリマーバインダー中に実質的に一様に分散されている吸水性で水浸透性の層である。
反応層のバインダーとして用いることができる親水性ポリマーは、一般には水吸収時の膨潤率が30℃で約150%から約2000%、好ましくは約250%から約1500%の範囲の天然または合成親水性ポリマーである。そのような親水性ポリマーの例としては、特開昭58−171864号公報および特開昭60−108753号公報等に開示されているゼラチン(例、酸処理ゼラチン、脱イオンゼラチン等)、ゼラチン誘導体(例、フタル化ゼラチン、ヒドロキシアクリレートグラフトゼラチン等)、アガロース、プルラン、プルラン誘導体、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン等をあげることができる。
反応層は架橋剤を用いて適宜に架橋硬化された層とすることができる。架橋剤の例として、ゼラチンに対する1,2−ビス(ビニルスルホニルアセトアミド)エタン、ビス(ビニルスルホニルメチル)エーテル等の公知のビニルスルホン系架橋剤、アルデヒド等、メタリルアルコールコポリマーに対するアルデヒド、2個のグリシジル基含有エポキシ化合物等がある。
反応層の乾燥時の厚さは約1μmから約100μmの範囲であることが好ましく、より好ましくは約3μmから約30μmの範囲である。また試薬層は実質的に透明であることが好ましい。
本発明では多孔性展開層に布製の展開層を用いることが好ましいが、ポリビニルスルホン、アセチルセルロースからなる多孔質膜または、微小ビーズから形成する多孔質膜、ガラス繊維濾紙、濾紙など布以外の材質を使用することも可能である。
この布製の多孔性展開層としては特開昭55−164356号公報、特開昭57−66359号公報等に記載の織物布地展開層(例:ブロード、ポプリン等の平織布地等)、特開昭60−222769号公報等に記載の編物布地展開層(例:トリコット編布地、ダブルトリコット編布地、ミラニーズ編布地等)、特開平1−172753号公報に記載のアルカリエッチング液でエッチング処理した織物布地又は編物布地からなる展開層、等がある。好ましいものは編物布であり、特にトリコット編物が好ましい。布の材質としてはポリエステル、綿、ナイロン、絹、ビニロン、レーヨン、ポリアミド、アクリル、ウール、ポリプロピレン、麻等が用いられ、好ましいものはポリエステルである。展開層の厚さは50〜400μm程度、好ましくは200〜300μm程度が適当である。布の空隙率は20〜90%程度、好ましくは40〜85%程度である。
多孔性展開層に用いられる織物布地、編物布地は特開昭57−66359に記載のグロー放電処理またはコロナ放電処理に代表される物理的活性化処理を布生地の少なくとも片面に施すか、または特開昭55−164356、特開昭57−66359等に記載の水洗脱脂処理、界面活性剤含浸又は親水性ポリマー含浸等の親水化処理、またはこれらの処理工程を適宜に組み合せて逐次実施することにより布地を親水化し、下側(支持体に近い側)の層との接着力を増大させることができる。
展開反応層として多孔性層を用いる場合、その多孔性媒体は繊維質であってもよいし、非繊維質であってもよい。繊維質材料としては、例えば濾紙、不織布、織物布地(例えば平織布地)、編物布地(例えばトリコット編物布地)、ガラス繊維濾紙等を用いることができる。非繊維質材料としては、特開昭49−53888等に記載の酢酸セルロース等からなるメンブランフィルター、特開昭49−53888、特開昭55−90859(対応米国特許4,258,001)、特開昭58−70163(対応米国特許4,486,537)等に記載の無機物又は有機物微粒子からなる連続空隙含有粒状構造物層等のいずれでもよい。特開昭61−4959(対応欧州公開EP0166365A)、特開昭62−116258、特開昭62−138756(対応欧州公開EP0226465A)、特開昭62−138757(対応欧州公開EP 0226465A)、特開昭62−138758(対応欧州公開EP0226465A)等に記載の部分接着された複数の多孔性層の積層物も好適である。
展開層への試薬添加のためには、展開層を形成させた後、反応試薬を塗布等の手段により添加してもよく、また、例えば紙、布、高分子からなる多孔質膜等に本発明の試薬を予め含浸又は塗布した後、支持体上に設けた他の水浸透性層の上に、特開昭55-164356 号のような方法で接着させるのも有用な方法である。
多孔性層は供給される液体の量にほぼ比例した面積に液体を展開する、いわゆる計量作用を有する展開層であってもよい。この機能の制御には、界面活性剤と親水性バインダーの使用が有用である。
本発明の乾式分析要素には上記以外の層も設けることができる。例えば、光遮蔽層、吸水層、接着層等である。
本発明で採用している測定反応系は、測定対象であるリパーゼによって基質であるジグリセリドまたはトリグリセリドが分解して生成するモノグリセリドをモノグリセリドリパーゼで分解する。このグリセロールをグリセロールキナーゼによってL−α−グリセロリン酸とし、L−α−グリセロリン酸をL−α−グリセロリン酸オキシダーゼによってジヒドロキシアセトンリン酸に変えるとともに過酸化水素を発生させ、この過酸化水素によりペルオキシダーゼの作用で発色色素を発色させるものである。
本発明の乾式分析要素に組み込まれる試薬系には、モノグリセリドリパーゼを加える。モノグリセリドリパーゼは、トリグリセリドおよびジグリセリドと実質的に反応せず、長鎖脂肪酸のモノグリセリドに反応するものが好ましい。特に好ましいのは、特開昭63-245672、特開平4-316500号公報に記載の、バチルス・ステアロサーモフィラスH-165由来のモノグリセリドリパーゼである。
グリセロールキナーゼはグリセロールとATPを反応させてL−α−グリセロリン酸(L−グリセロール−3−リン酸)とADPに変えるものであり、Mg2+、Mn2+等を補酵素としている。
L−α−グリセロリン酸オキシダーゼ(グリセロール−3−リン酸オキシダーゼ)はL−グリセロリン酸を酸化してジヒドロキシアセトンリン酸に変えるとともに過酸化水素を発生させるものである。
この過酸化水素によりペルオキシダーゼの作用で発色させる発色系は乾式分析要素用として種々開発されており、そのなかから適宜選択して使用することができる。その多くはロイコ色素であり、代表的なものはo−トルイジンである。
本発明の乾式分析要素に組み込まれる試薬系には、また、本発明の測定対象は主に血液に含まれる膵リパーゼの反応性を高めるため、コリパーゼを加えることが好ましい。コリパーゼはブタ膵臓由来のコリパーゼが好ましい。また、膵リパーゼの活性を高め、膵リパーゼ以外のリパーゼ活性を軽減するため、デオキシコール酸やタウロコール酸を活性化剤として加えることによって、エステラーゼ、肝リパーゼ、リポプロテインリパーゼの影響を排除して、高い特異性で膵リパーゼを測定できる。
上記各試薬の含有量としては、トリグリセリドが0.1〜15g/m2程度、好ましくは0.5〜10g/m2程度、グリセロールキナーゼが0.5〜100KU/m2程度、好ましくは1〜10KU/m2程度、L−α−グリセロリン酸オキシダーゼが2〜200KU/m2程度、好ましくは5〜50KU/m2程度、ペルオキシダーゼが1〜200KU/m2程度、好ましくは5〜50KU/m2程度、モノグリセリドリパーゼが2〜100KU/m2程度、好ましくは3〜30KU/m2程度、発色色素が0.05〜2.00g/m2程度、好ましくは0.1〜1.00g/m2程度、コリパーゼが0.010〜0.400g/m2 (5〜200KU/m2)程度、デオキシコール酸が0.1〜10g/m2程度が適当である。
ここで、モノグリセリドリパーゼは、好ましくは、8000U/m2から1000U/m2、さらに好ましくは6000U/m2から2000U/m2、最適には4300U/m2から2000U/m2である。モノグリセリドリパーゼは共役酵素であるものの、過剰量を添加することは好ましくない。ジグリセリドを基質に使用するとバックグランドが高くなることがある。また、トリグリセリドを基質として使用した場合でも、モノグリセリドリパーゼ量が多くなるに従い、血液中の一部のリポプロテインが反応し、測定誤差を生じる場合があるためである。
この試薬組成物は全てを反応層又は展開層に含有させてもよく、また、両層に振り分けて含有させてもよく、一部を他の層に含有させてもよい。
本発明の乾式分析要素には、その他の試薬も加えることができる。このような試薬には緩衝剤、界面活性剤等がある。
本発明の乾式分析要素に含有させることができる緩衝剤の例としては、炭酸塩、ホウ酸塩、燐酸塩、トリス塩およびグッド(Good)の緩衝剤などの公知の緩衝剤を挙げることができる。これらの緩衝剤は「蛋白質・酵素の基礎実験法」(梶尾武一他,南江堂,1981)等の公知文献を参考にして選択し、使用することができる。含有量は一体型多層分析要素で通常使用されている量と同程度でよく、約100mg/m2〜約5.0g/m2の範囲、好ましくは約500mg/m2〜約3.0g/m2の範囲である。
本発明の分析要素の展開層又は反応層には、上記したアニオン界面活性剤以外の界面活性剤、例えばノニオン性界面活性剤を含有させることもできる。親油基としてアルキル基、アルキルフェニル基、スチレン化フェニル基、ベンジルフェニル基、ソルビタンアルキル基など、親水基はポリオキシエチレン基、ポリグリセロール基、ポリオキシエチレンポリプロピレン重合体などを組み合わせた界面活性剤を用い、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレン分岐アルキルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、アルキルフェニルポリグリセリド等が挙げられる。具体的には、ポリオキシエチレントリデシルエーテル、ポリオキシエチレン分岐デシルエーテル、ポリオキシエチレンp−オクチルフェノニルエーテル、ポリオキシエチレンp−オクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンp−ノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、p−ノニルフェノキシポリグリシドール、オクチルグルコシド等がある。これらのノニオン性界面活性剤のうちでは、ポリオキシエチレントリデシルエーテル、ポリオキシエチレン分岐デシルエーテル、p−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール、p−ノニルフェノキシポリエトキシエタノール、p−ノニルフェノキシポリグリシドールなどが好ましい。ノニオン性界面活性剤を展開層に含有させることにより水性液体試料の展開作用(メータリング作用)がより良好になる。ノニオン性界面活性剤を反応層に含有させることにより分析操作時に水性液体試料中の水が反応層に実質的に一様に吸収されやすくなり、また展開層との液体接触が迅速にかつ実質的に一様になる。
また、展開層には親水性ポリマーも含有させることができる。この親水性ポリマーには、澱粉、セルロースおよびセルロース誘導体(メチル化セルロース、ヒドロキシエチル化セルロース、ヒドロキシプロピル化セルロース等)、アガロース、ゼラチン(例、酸処理ゼラチン、脱イオンゼラチン等)、ゼラチン誘導体(例、フタル化ゼラチン、ヒドロキシアクリレートグラフトゼラチン等)、アクリルアミド重合体、アクリルアミドと各種ビニル性モノマーとの共重合体、ビニルピロリドン重合体、ビニルピロリドンと各種ビニル性モノマーとの共重合体、アクリレート重合体およびアクリレートと各種ビニル性モノマーとの共重合体等を挙げることができる。上記親水性ポリマーのうちではビニルピロリドン誘導体とセルロース誘導体が好ましい。
本発明の乾式分析要素の好ましい製造方法を記す。支持体にゼラチン等のバインダーと界面活性剤を加え、製膜性を向上した水溶液である塗布液を塗布し乾燥することで、試薬層を作製する。展開層は、例えば、布やすでに形成された多孔質膜を展開層膜として用いる場合には、試薬層に水を付着させ一部可溶化したのち、必要なら加温しバインダーをさらに軟化させ、展開層膜と支持体上の試薬層に圧着し乾燥する。
従来、トリオレインをリパーゼ分析液や乾式分析具に添加する方法として使用されてきた水への分散法は、界面活性剤や保護コロイドで安定化されているとはいえ、試薬添加のタイミング、攪拌効率、液温の変動等によりグリセリド粒子径は安定せず、ロット内、ロット間のバラツキは大きく、精度がよいリパーゼ乾式分析具を製造するのは困難である。さらに、この分散や乳化には、高度で高価な分散装置が必要とされる。また、分散粒径が小さくならない限り、粒子の沈降が発生する。この沈降は、均一な分析具を作製するためには問題となる。
トリグリセリドやジグリセリドを界面活性剤の水溶液として可溶化して乾式分析具に添加する方法は、膵リパーゼだけでなく、非膵リパーゼやエステラーゼのこれらの基質への反応性を向上させることがあり、また、界面活性剤が共役酵素を失活させることがあるので、好ましくない。
そこで、トリオレイン等のグリセリド(リパーゼ基質)を低級アルコールまたはアセトンに溶解し、塗布性を向上させるために必要な場合はポリビニルピロリドン等のバインダーを加え粘度を調整することができる。低級アルコールまたはアセトンとしては、炭素数1〜6の低級アルコール系溶媒またはアセトンが好ましく、特にメタノール、エタノール、プロピルアルコール、アセトンが好ましく、特にエタノールが好ましい。テトラヒドロフラン、ジオキサン等のエーテル系溶剤の使用は好ましくない。この理由のひとつは、塗布性を向上させ、乾式分析要素に添加された後は血液検体での溶解に有用である、ポリビニルピロリドン等の水溶性ポリマーの溶解性が良好でないためである。クロロホルム、塩化メチレンは、グリセリドの溶解性がよいので有用であるが、近年、発ガン性等の環境毒性が問題になっているので使用には注意が必要である。
上記グリセリドと溶剤の量比は、例えば、トリオレインをエタノールに溶解する場合、トリオレイン1gに対しエタノールは50〜300gが好ましい。より好ましくは、トリオレイン1gに対しエタノール100〜200gである。トリオレイン濃度が高いとエタノールに溶解しないため、均一なトリオレインの添加が困難になる。グリセリドの溶剤液の添加方法は、塗布または含浸が使用することができる。これらの添加方法の中で、ギーサーにより塗布し乾燥する工程が均一で効率の高い生産方法を与える。この工程において、乾燥は温風乾燥が好ましい。乾燥風は温度20〜60℃が好ましく、特に、25〜40℃が好ましい。露点は0℃から10℃が好ましい。風量は0.5〜10m/秒が好ましい。乾燥時間は溶剤が実質的に乾燥すればよく、一方、長時間の乾燥では、共役酵素が失活する場合があるので、1分から60分が好ましい。複数の乾燥ゾーンを用い、それぞれのゾーンで、乾燥風の温度、露点、風速、風向、時間を制御し、良好な乾燥条件を設定することもできる。
CaCl2は、どの塗布液に添加してもよいがデオキシコール酸と反応して凝集物を形成する場合もあるので、また、エタノールに溶解するので、基質液に溶解して添加するのが好ましい。
有機溶剤に溶解しない反応試薬は、別途、水溶液として塗布により添加する。塗布適性、血液の展開性を向上させるために、バインダーおよび界面活性剤を加えると良い。pH緩衝剤、リパーゼ反応促進剤であるコリパーゼ、デオキシコール酸はこの液に加えるとよい。同様、塗布と乾燥により、展開層中に試薬を添加する。
反応試薬は、検体中のリパーゼが反応するとき、溶解・拡散することで反応に適した試薬環境を設定できればよいので、各試薬は、製造において基本的にどの層に加えてもよい。
試薬の添加方法は、均一な試薬量を設定できれば、含浸してもよく、またスプレーを用いてもよい。各層の作製順序は、均一で試薬が分解しない方法であればよい。場合によれば、支持体を使用せず、ガラス繊維濾紙や濾紙のような多孔質膜を使用し、上記の製造方法で作製することもできる。この場合も、基質を有機溶剤に溶解した液は、温風乾燥で乾燥することが好ましい。
本発明の一体型分析要素は、一辺約10mmから約30mmの正方形または、ほぼ同サイズの円形等の小片に裁断し特開昭57−63452号、特開昭54−156079号、実開昭56−142454号、実開昭58−32350号および特開昭58−501144号各公報等に開示のスライド枠等に納めて分析スライドとして用いるのが製造、包装、輸送、保存および測定操作等の全ての観点で好ましい。
本発明の一体型分析要素は、前述の諸公報に開示の方法に従い約5μlから約30μl、好ましくは約8μlから約15μlの水性液体試料を多孔性展開層に点着供給し、必要に応じて約20℃から約45℃の範囲の実質的に一定の温度でインクベーションの後に、光透過性支持体側から一体型多層分析要素内の色変化、発色等の検出可能な変化を反射測光し比色法の原理により液体試料中の測定対象成分を分析する。
以下の実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
実施例1:直鎖ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムを含む膵リパーゼ分析スライドの作製
(1)グリセリン発色試薬の添加:
ゼラチン下塗りがされている厚さ180μmのポリエチレンテレフタレート無色透明平滑フイルム上に下記の組成の試薬を塗布、乾燥させたのち、続いて、水を均一供給し湿潤させ、その上に50デニール相当のポリエチレンテレフタレート紡績糸を36ゲージ編みしたトリコット編み物布地を軽く圧力をかけて積層し、乾燥温度20℃でゼラチンを固めたのち、45℃で乾燥させた。なお、pH緩衝剤PIPESを含む塗布液は1N-NaOH水溶液でpH6に調整したものを用いた。
(1)グリセリン発色試薬の添加:
ゼラチン下塗りがされている厚さ180μmのポリエチレンテレフタレート無色透明平滑フイルム上に下記の組成の試薬を塗布、乾燥させたのち、続いて、水を均一供給し湿潤させ、その上に50デニール相当のポリエチレンテレフタレート紡績糸を36ゲージ編みしたトリコット編み物布地を軽く圧力をかけて積層し、乾燥温度20℃でゼラチンを固めたのち、45℃で乾燥させた。なお、pH緩衝剤PIPESを含む塗布液は1N-NaOH水溶液でpH6に調整したものを用いた。
ゼラチン 12 g/m2
PIPES(同仁化学) 22 g/m2
塩化マグネシウム(和光純薬工業)0.52 g/m2
ATP−2ナトリウム塩(オリエンタル酵母)1.4 g/m2
ポリオキシエチレントリデシルエーテルHLB14.8(第一工業製薬)0.55 g/m2
ポリエチレンアルキル分岐デシルエーテルHLB15.9 (第一工業製薬)0.059 g/m2
ロイコ色素 0.21 g/m2
ワサビペルオキシダーゼ(東洋紡)14 KU/m2
グリセロールキナーゼ(旭化成)3.8 kU/m2
L-α-グリセロリン酸オキシダーゼ(旭化成)19 kU/m2
1,2−ビス(ビニルスルホニルアセトアミド)エタン 3.3 g/m2
PIPES(同仁化学) 22 g/m2
塩化マグネシウム(和光純薬工業)0.52 g/m2
ATP−2ナトリウム塩(オリエンタル酵母)1.4 g/m2
ポリオキシエチレントリデシルエーテルHLB14.8(第一工業製薬)0.55 g/m2
ポリエチレンアルキル分岐デシルエーテルHLB15.9 (第一工業製薬)0.059 g/m2
ロイコ色素 0.21 g/m2
ワサビペルオキシダーゼ(東洋紡)14 KU/m2
グリセロールキナーゼ(旭化成)3.8 kU/m2
L-α-グリセロリン酸オキシダーゼ(旭化成)19 kU/m2
1,2−ビス(ビニルスルホニルアセトアミド)エタン 3.3 g/m2
(2)基質の添加:
上記の布地上に下記組成の試薬をエタノールに溶解し塗布し、乾燥温度32℃、露点0℃の風で、温風乾燥させた。
上記の布地上に下記組成の試薬をエタノールに溶解し塗布し、乾燥温度32℃、露点0℃の風で、温風乾燥させた。
塩化カルシウム(和光純薬)0.18 g/m2
ポリビニルピロリドンK90 2.0 g/m2
トリオレイン(98%、ICN-Biochemical)1.1 g/m2
ポリビニルピロリドンK90 2.0 g/m2
トリオレイン(98%、ICN-Biochemical)1.1 g/m2
(3)リパーゼ反応補助剤の添加
さらに、下記試薬を水に溶解し、塗布、乾燥し、膵リパーゼ乾式分析要素を作製した。なお、pH緩衝剤HEPESを含む塗布液は1N-NaOH水溶液でpH8.0に調整したものを用いた。
さらに、下記試薬を水に溶解し、塗布、乾燥し、膵リパーゼ乾式分析要素を作製した。なお、pH緩衝剤HEPESを含む塗布液は1N-NaOH水溶液でpH8.0に調整したものを用いた。
HEPES(同仁化学) 6.1 g/m2
直鎖ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム(和光純薬) 0.67 g/m2
デオキシコール酸ナトリウム(和光純薬) 4.6 g/m2
タウロデオキシコール酸ナトリウム 1.5 g/m2
メトロース 2.1 g/m2
モノグリセリドリパーゼ(旭化成) 4300 U/m2
ブタコリパーゼ(ロシュ)0.05 g/m2
アスコルビン酸オキシダーゼ(東洋紡)8500 U/m2
直鎖ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム(和光純薬) 0.67 g/m2
デオキシコール酸ナトリウム(和光純薬) 4.6 g/m2
タウロデオキシコール酸ナトリウム 1.5 g/m2
メトロース 2.1 g/m2
モノグリセリドリパーゼ(旭化成) 4300 U/m2
ブタコリパーゼ(ロシュ)0.05 g/m2
アスコルビン酸オキシダーゼ(東洋紡)8500 U/m2
比較例1:
実施例1において、直鎖ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムを含まないこと以外は同じ方法で膵リパーゼ分析スライドを作製した。
実施例1において、直鎖ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムを含まないこと以外は同じ方法で膵リパーゼ分析スライドを作製した。
測定1:
イヌ血漿46検体を用い、各10μlを実施例1および比較例1で作製した膵リパーゼ分析スライドに点着し、37℃で加温し5分間の650nmの反射濃度の変化を調べた。市販の富士ドライケム7000を用いた。リパーゼ活性への変換は、富士ドライケムシステムで従来から行っているように、反射濃度を基質反応量(グリセリン濃度)に変換し、色素退色補正を行ったのち、1分あたりの検体ごとのリパーゼ活性を算出した。基準法は、アナライザーは日立7180を使用し、試薬はロシュ社RGGR法によるリパーゼ分析キットを用いた。
イヌ血漿46検体を用い、各10μlを実施例1および比較例1で作製した膵リパーゼ分析スライドに点着し、37℃で加温し5分間の650nmの反射濃度の変化を調べた。市販の富士ドライケム7000を用いた。リパーゼ活性への変換は、富士ドライケムシステムで従来から行っているように、反射濃度を基質反応量(グリセリン濃度)に変換し、色素退色補正を行ったのち、1分あたりの検体ごとのリパーゼ活性を算出した。基準法は、アナライザーは日立7180を使用し、試薬はロシュ社RGGR法によるリパーゼ分析キットを用いた。
多検体相関データを図1及び図2に示す。比較例の相関係数がR=0.930に対し、実施例1はR=0.980に向上した。図1及び図2の検体A,Bを用いて、実施例3の解析を行った。
実施例2:ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムとコリパーゼ量の影響
実施例1と同じ製法で、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムとコリパーゼ量を変更した分析要素を作製し、46イヌ検体での多検体相関を調べた。結果を表1に示す。ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムを添加したリパーゼ分析スライドは、ドデシルベンゼンスルホン酸Naを添加しないタイプと比較し、これらの試薬量が表1に記載の範囲内で使用される場合、相関係数が大きく良好であることが再確認された。
実施例1と同じ製法で、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムとコリパーゼ量を変更した分析要素を作製し、46イヌ検体での多検体相関を調べた。結果を表1に示す。ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムを添加したリパーゼ分析スライドは、ドデシルベンゼンスルホン酸Naを添加しないタイプと比較し、これらの試薬量が表1に記載の範囲内で使用される場合、相関係数が大きく良好であることが再確認された。
実施例3. ドデシルベンゼンスルホン酸Na添加による膵リパーゼ反応タイムコースの測定:
実施例1及び2と同じ製法で、ドデシルベンゼンスルホン酸Na(図3及び図4ではSDBSと省略する)の添加量を変えた膵リパーゼ測定用乾式分析要素を作製した。表2の3-1は、比較例2とする。
実施例1及び2と同じ製法で、ドデシルベンゼンスルホン酸Na(図3及び図4ではSDBSと省略する)の添加量を変えた膵リパーゼ測定用乾式分析要素を作製した。表2の3-1は、比較例2とする。
測定:
比較例1の多検体相関で、正誤差および負誤差を与えた2検体(A,B)を選び、実施例3で作製した膵リパーゼ乾式分析要素を用いて測定し、それらの反応タイムコースを比較した。検体A,Bは、上記の実施例1および比較例1の各多検体相関データに記載した同じものを用いた。
比較例1の多検体相関で、正誤差および負誤差を与えた2検体(A,B)を選び、実施例3で作製した膵リパーゼ乾式分析要素を用いて測定し、それらの反応タイムコースを比較した。検体A,Bは、上記の実施例1および比較例1の各多検体相関データに記載した同じものを用いた。
結果:
結果を図3(左図は検体Aを示し、右図は検体Bを示す)に示す。比較例1の多検体相関で、負誤差を与えた検体Bはドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムを添加することでリパーゼの反応性が向上することが見出された。一方、若干正誤差を与えた検体Aはドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムを添加しても反応性の変化は少ない。これらの結果から、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムの添加は、反応性が悪かった検体の活性だけを向上させることで、多検体相関を改良したことが確認できた。
結果を図3(左図は検体Aを示し、右図は検体Bを示す)に示す。比較例1の多検体相関で、負誤差を与えた検体Bはドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムを添加することでリパーゼの反応性が向上することが見出された。一方、若干正誤差を与えた検体Aはドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムを添加しても反応性の変化は少ない。これらの結果から、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムの添加は、反応性が悪かった検体の活性だけを向上させることで、多検体相関を改良したことが確認できた。
Claims (17)
- 炭素数12から22の長鎖アルキル脂肪酸のジグリセリドまたはトリグリセリド、モノグリセリドリパーゼ、及びグリセリン測定試薬を含有する少なくとも1つ以上の展開層及び/または試薬層を含む、体液中の膵リパーゼ測定用乾式分析要素において、前記展開層及び/または試薬層が、2種類以上のアニオン界面活性剤を含み、かつそのうちの少なくとも1種類がアルキルアリールスルホン酸塩であることを特徴とする、体液中の膵リパーゼ測定用乾式分析要素。
- アルキルアリールスルホン酸塩が、アルキルベンゼンスルホン酸塩である、請求項1に記載の乾式分析要素。
- アルキルベンゼンスルホン酸塩が、アルキル基の鎖長が炭素数10〜14であるアルキルベンゼンスルホン酸塩である、請求項2に記載の乾式分析要素。
- アルキルベンゼンスルホン酸塩が、直鎖ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム塩である、請求項3の何れかに記載の乾式分析要素。
- アルキルアリールスルホン酸塩の添加量が0.1〜10g/m2である、請求項1から4の何れかに記載の乾式分析要素。
- トリグリセリドがトリオレインである、請求項1から5の何れかに記載の乾式分析要素。
- モノグリセリドリパーゼがバチルス・ステアロサーモフィラスH-165由来のモノグリセリドリパーゼである、請求項1から6の何れかに記載の乾式分析要素。
- グリセリン測定試薬が、グリセロキナーゼとグリセロリン酸オキシダーゼと発色試薬から構成される、請求項1から7の何れかに記載の乾式分析要素。
- 乾式分析要素の構成が、水不透過性支持体、試薬層および展開層からなる、請求項1から8の何れかに記載の乾式分析要素。
- 展開層が、布または多孔質膜からなるものである、請求項1から9の何れかに記載の乾式分析要素。
- 多孔質膜が、ポリビニルスルホンもしくはアセチルセルロースからなる多孔質膜、または微小ビーズから形成する多孔質膜である、請求項1から10の何れかに記載の乾式分析要素。
- モノグリセリドリパーゼの添加量が8000U/m2から1000U/m2である、請求項1から11の何れかに記載の乾式分析要素。
- 低級アルコールまたはアセトンに溶解したジグリセリドまたはトリグリセリドを展開層または試薬層に添加して乾燥する工程を含む方法によって製造される、請求項1から12の何れかに記載の乾式分析要素。
- ジグリセリドまたはトリグリセリドの乾燥方法が温風乾燥である、請求項13に記載の乾式分析要素。
- ジグリセリドまたはトリグリセリドが、メタノール、エタノール、プロピルアルコールまたはアセトンに溶解されている、請求項13又は14に記載の乾式分析要素。
- 請求項1から15の何れかに記載の乾式分析要素に体液を適用して、該体液中の膵リパーゼを測定する方法。
- 体液がイヌ血液である、請求項16に記載の体液中の膵リパーゼを測定する方法。
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