JP2002125699A - リパーゼ測定用多層乾式分析素子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 膵リパーゼの基質として最も適当な、３
つのエステル位の全てに長鎖脂肪酸残基を有するトリグ
リセリドを用いて、反応速度がはやく、しかも十分な強
度を有していて取扱上も問題がない、リパーゼ測定用多
層乾式分析素子を提供する。 【解決手段】 上記課題は、少なくとも展開層、反応層
及び水不透過性透明支持体がこの順に積層されており、
グリセリドを基質とし、グリセロールキナーゼ、Ｌ−α
−グリセロリン酸オキシダーゼ及びペルオキシダーゼを
共役酵素として用いる反応試薬系が組み込まれているリ
パーゼ測定用多層乾式分析素子において、グリセリド
に、３つの水酸基の全てに長鎖脂肪酸がエステル結合さ
れているトリグリセリドを用い、展開層には布を用い、
その布の空隙に無機又は有機質の微粒子を含有させたこ
とを特徴とするリパーゼ測定用多層乾式分析素子によっ
て解決される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、リパーゼ測定用多層乾
式分析素子に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】リパーゼ測定用多層乾式分析素子は既に
開発されている。特開昭５９−４８０９８号公報に開示
されている分析素子では、リパーゼの基質として、α位
のエステル位の一つに炭素数８個以上の長鎖のアルキル
基を有しこのアルキル基が加水分解されて生成するジエ
ステルが水溶性となるよう２つの残りのエステル位に短
鎖のアルキル基を有する特殊なトリグリセリドをリパー
ゼの基質に用いている。この特許公報には、二酸化チタ
ンや微結晶性セルロースを用いて形成した展開層も開示
されている。

【０００３】また、乾式分析素子によるリパーセ測定用
試薬として、基質に炭素数１４〜２０の長鎖脂肪酸を有
するトリグリセリドを基質に用いたモノグリセリドリパ
ーゼ、グリセリン測定試薬を含む試薬も開発されている
（特開平４−３１６５００号公報）。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】リパーゼ測定用乾式分
析素子の課題は基質特異性と反応速度にある。すなわ
ち、基質に特殊な化合物を使用すると、エステラーゼ等
リパーゼ以外の酵素も反応したりして分析値がなくな
り、一方、トリグリセリドは水溶性でないため、リパー
ゼはその表面でしか反応せず、反応速度が遅いという問
題がある。前記特開昭５９−４８０９８号公報開示の乾
式分析素子では、生体内にはほとんど存在しないこの特
殊なトリグリセリドを基質に用いているので各種動物の
膵リパーゼに対する反応性及び特異性が、膵リパーゼ本
来の基質とされる３つのエステル位全てに長鎖のアルキ
ル基又はアルケニル基を有するトリグリセリドを基質に
用いた場合とで異なることが懸念される。また、二酸化
チタンや微結晶セルロースよりなる展開層は、微粒子の
みで形成されているため強度が弱く、崩れやすいという
問題がある。

【０００５】本発明の目的は、膵リパーゼの基質として
最も適当な、３つのエステル位の全てに長鎖脂肪酸残基
を有するトリグリセリドを用いて、反応速度がはやく、
しかも十分な強度を有していて取扱上も問題がない、リ
パーゼ測定用多層乾式分析素子を提供することにある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】トリオレインのような３
つのエステル位全てに長鎖脂肪酸を有するトリグリセリ
ドは乳化しにくい性質を持つため、ドライ試薬作製時に
界面活性剤や保護コロイドの存在下でトリオレインを攪
拌、超音波等の物理的な剪断力により均一に乳化分散し
た溶液として添加してもドライ状態にすると分散媒であ
る水が無くなるために乳化物は凝集、合一し展開層表面
に付着し、油水界面の表面積が極端に減少する。測定時
に、このドライ試薬にリパーゼを含む検体（液体）を作
用させても物理的な剪断力がないため、トリオレインは
凝集、合一したまま元の分散状態には戻らない。リパー
ゼは油水界面が反応場であるため、油水界面の表面積の
減少が反応速度を低下させる原因と考えられる。そこ
で、基質付着面積を拡大することを目的とし、基質（ト
リオレイン）を含む展開層に微粒子を添加することを試
みた結果、反応速度を改善することに成功した。展開層
の基質付着表面積を拡大することが、リパーゼ反応を向
上させるポイントであることを見いだし本発明を完成さ
せるに至った。

【０００７】すなわち、本発明は、少なくとも展開層、
反応層及び水不透過性透明支持体がこの順に積層されて
おり、グリセリドを基質とし、グリセロールキナーゼ、
Ｌ−α−グリセロリン酸オキシダーゼ及びペルオキシダ
ーゼを共役酵素として用いる反応試薬系が組み込まれて
いるリパーゼ測定用多層乾式分析素子において、グリセ
リドに、３つの水酸基の全てに長鎖脂肪酸がエステル結
合されているトリグリセリドを用い、展開層には布を用
い、その布の空隙に無機又は有機質の微粒子を含有させ
たことを特徴とするリパーゼ測定用多層乾式分析素子に
関するものである。

【０００８】

【発明の実施の形態】本発明のリパーゼ測定用多層乾式
分析素子の支持体層を構成するものとしては、光透過性
でかつ水不透過性である支持体が用いられる。光透過性
・水不透過性支持体の例としては、ポリエチレンテレフ
タレート、ビスフェノールＡのポリカルボネート、ポリ
スチレン、セルロースエステル（例、セルロースジアセ
テート、セルローストリアセテート、セルロースアセテ
ートプロピオネート等）等のポリマーからなる厚さ約５
０μｍから約１ｍｍ、好ましくは約８０μｍから約３０
０μｍの範囲のフィルムもしくはシート状の透明支持体
を挙げることができる。

【０００９】支持体の表面には必要により下塗層を設け
て、支持体の上に設けられる反応層と支持体との接着を
強固なものにすることができる。また、下塗層の代り
に、支持体の表面を物理的あるいは化学的な活性化処理
を施して接着力の向上を図ってもよい。

【００１０】支持体の上には（場合によっては下塗層等
の他の層を介して）反応層が設けられる。反応層はアナ
ライトであるリパーゼと反応して光学的に検出可能な変
化を生じる後述の試薬組成物の少なくとも一部が親水性
ポリマーバインダー中に実質的に一様に分散されている
吸水性で水浸透性の層である。

【００１１】反応層のバインダーとして用いることがで
きる親水性ポリマーは、一般には水吸収時の膨潤率が３
０℃で約１５０％から約２０００％、好ましくは約２５
０％から約１５００％の範囲の天然または合成親水性ポ
リマーである。そのような親水性ポリマーの例として
は、特開昭５８−１７１８６４号公報および特開昭６０
−１０８７５３号公報等に開示されているゼラチン
（例、酸処理ゼラチン、脱イオンゼラチン等）、ゼラチ
ン誘導体（例、フタル化ゼラチン、ヒドロキシアクリレ
ートグラフトゼラチン等）、アガロース、プルラン、プ
ルラン誘導体、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコ
ール、ポリビニルピロリドン等をあげることができる。

【００１２】反応層は架橋剤を用いて適宜に架橋硬化さ
れた層とすることができる。架橋剤の例として、ゼラチ
ンに対する１,２−ビス(ビニルスルホニルアセトアミ
ド）エタン、ビス（ビニルスルホニルメチル）エーテル
等の公知のビニルスルホン系架橋剤、アルデヒド等、メ
タリルアルコールコポリマーに対するアルデヒド、２個
のグリシジル基含有エポキシ化合物等がある。

【００１３】反応層の乾燥時の厚さは約１μｍから約１
００μｍの範囲であることが好ましく、より好ましくは
約３μｍから約３０μｍの範囲である。また試薬層は実
質的に透明であることが好ましい。

【００１４】本発明では多孔性展開層に布製の展開層を
用いる。この布製の多孔性展開層としては特開昭５５−
１６４３５６号公報、特開昭５７−６６３５９号公報等
に記載の織物布地展開層（例：ブロード、ポプリン等の
平織布地等）、特開昭６０−２２２７６９号公報等に記
載の編物布地展開層（例：トリコット編布地、ダブルト
リコット編布地、ミラニーズ編布地等）、特開平１−１
７２７５３号公報に記載のアルカリエッチング液でエッ
チング処理した織物布地又は編物布地からなる展開層、
等がある。好ましいものは編物布であり、特にトリコッ
ト編物が好ましい。布の材質としてはポリエステル、
綿、ナイロン、絹、ビニロン、レーヨン、ポリアミド、
アクリル、ウール、ポリプロピレン、麻等が用いられ、
好ましいものはポリエステルである。展開層の厚さは５
０〜４００μｍ程度、好ましくは２００〜３００μｍ程
度が適当である。布の空隙率は２０〜９０％程度、好ま
しくは４０〜８５％程度である。

【００１５】布の空隙に含有させる微粒子は、無機質微
粒子としては、ガラスパウダー、二酸化チタン、アルミ
ナ、シリカ、硫酸バリウム、炭酸カルシウム、炭化ケイ
素、窒化ケイ素、ジルコニア、酸化亜鉛、チタン酸バリ
ウム等、有機質微粒子としては、ポリスチレン、ポリプ
ロピレン、ポリメチルメタクリレート、ポリエチレン、
ナイロン、ポリウレタン、エポキシ樹脂、フェノール樹
脂、シリコーン樹脂等がある。微粒子の粒径は平均粒径
で０．０１〜１００ｍμ程度、好ましくは０．１〜１０
ｍμ程度のものがよい。布への微粒子の含有量は０．５
〜１５ｇ／ｍ^２程度、好ましくは３〜１０ｇ／ｍ^２程度
が適当である。

【００１６】布への微粒子を含有させる方法は、微粒子
を含む液に布を含浸させる方法、微粒子を含む液を塗布
する方法、微粒子を含む液を布に噴霧する方法などがあ
る。

【００１７】多孔性展開層に用いられる織物布地、編物
布地は特開昭５７−６６３５９に記載のグロー放電処理
またはコロナ放電処理に代表される物理的活性化処理を
布生地の少なくとも片面に施すか、または特開昭５５−
１６４３５６、特開昭５７−６６３５９等に記載の水洗
脱脂処理、界面活性剤含浸又は親水性ポリマー含浸等の
親水化処理、またはこれらの処理工程を適宜に組み合せ
て逐次実施することにより布地を親水化し、下側（支持
体に近い側）の層との接着力を増大させることができ
る。

【００１８】本発明の乾式分析素子には上記以外の層も
設けることができる。例えば、光遮蔽層、吸水層、接着
層等である。

【００１９】本発明で採用している測定反応系は、測定
対象であるリパーゼによってトリグリセリドを分解して
グリセロールを生成させ、このグリセロールをグリセロ
ールキナーゼによってＬ−α−グリセロリン酸とし、Ｌ
−α−グリセロリン酸をＬ−α−グリセロリン酸オキシ
ダーゼによってジヒドロキシアセトンリン酸に変えると
ともに過酸化水素を発生させ、この過酸化水素によりペ
ルオキシダーゼの作用で発色色素を発色させるものであ
る。

【００２０】トリグリセリドは、３つのエステル位の全
てに長鎖脂肪酸がエステル結合されているものである。
各長鎖脂肪酸は炭素数が１４〜２２程度、好ましくは１
６〜２０程度であり、例えば、パルミチン酸、ステアリ
ン酸等の飽和脂肪酸やオレイン酸、リノール酸、リノレ
ン酸等の不飽和脂肪酸である。トリグリセリドの具体例
としては、トリオレイン、トリシリスチン、トリパルミ
チン、トリステアリン、トリリノレチン、１−シリスト
ジパルミチン、１−パルミトジステアリン、２−パルミ
トジステアリン、１−ステアロー２パルミト−３シリス
チン等を挙げることができ、特に好ましいものはトリオ
レインである。

【００２１】グリセロールキナーゼはグリセロールとＡ
ＴＰを反応させてＬ−α−グリセロリン酸（Ｌ−グリセ
ロール−３−リン酸）とＡＤＰに変えるものであり、Ｍ
ｇ^{２ ＋}、Ｍｎ^２＋等を補酵素としている。

【００２２】Ｌ−α−グリセロリン酸オキシダーゼ（グ
リセロール−３−リン酸オキシダーゼ）はＬ−グリセロ
リン酸を酸化してジヒドロキシアセトンリン酸に変える
とともに過酸化水素を発生させるものである。

【００２３】この過酸化水素によりペルオキシダーゼの
作用で発色させる発色系は乾式分析素子用として種々開
発されており、そのなかから適宜選択して使用すること
ができる。その多くはロイコ色素であり、代表的なもの
はｏ−トルイジンである。

【００２４】本発明の分析素子に組み込まれる試薬系に
は、モノグリセリドリパーゼを加えることによってトリ
グリセリドからのグリセロールの生成速度を高めること
ができるので好ましい。また、本発明の測定対象は主に
血清に含まれる膵リパーゼであり、そこで、コリパーゼ
とデオキシコール酸を活性化剤として加えることによっ
て、エステラーゼ、肝リパーゼ、リポプロテインリパー
ゼの影響を排除して、高い特異性で膵リパーゼを測定で
きる。

【００２５】上記各試薬の含有量としては、トリグリセ
リドが０．１〜１５ｇ／ｍ^２程度、好ましくは０．５〜
１０ｇ／ｍ^２程度、グリセロールキナーゼが０．５〜１
００ＫＵ／ｍ^２程度、好ましくは１〜１０ＫＵ／ｍ^２程
度、Ｌ−α−グリセロリン酸オキシダーゼが２〜２００
ＫＵ／ｍ^２程度、好ましくは５〜５０ＫＵ／ｍ^２程度、
ペルオキシダーゼが１〜２００ＫＵ／ｍ^２程度、好まし
くは５〜５０ＫＵ／ｍ ^２程度、モノグリセリドリパーゼ
が２〜１００ＫＵ／ｍ^２程度、好ましくは３〜３０ＫＵ
／ｍ^２程度、発色色素が０．０５〜２．００ｇ／ｍ^２程
度、好ましくは０．１〜１．００ｇ／ｍ^２程度、コリパ
ーゼが５〜２００ＫＵ／ｍ^２程度、デオキシコール酸が
０．１〜１０ｇ／ｍ^２程度が適当である。

【００２６】この試薬組成物は全てを反応層又は展開層
に含有させてもよく、また、両層に振り分けて含有させ
てもよく、一部を他の層に含有させてもよい。

【００２７】本発明の分析素子には、その他の試薬も加
えることができる。このような試薬には緩衝剤、界面活
性剤等がある。

【００２８】本発明の分析素子に含有させることができ
る緩衝剤の例としては、炭酸塩、ホウ酸塩、燐酸塩、ト
リス塩およびグッド（Ｇｏｏｄ）の緩衝剤などの公知の
緩衝剤を挙げることができる。これらの緩衝剤は「蛋白
質・酵素の基礎実験法」（梶尾武一他，南江堂，１９８
１）等の公知文献を参考にして選択し、使用することが
できる。含有量は一体型多層分析要素で通常使用されて
いる量と同程度でよく、約１００ｍｇ／ｍ^２〜約５．０
ｇ／ｍ^２の範囲、好ましくは約５００ｍｇ／ｍ ^２〜約
３．０ｇ／ｍ^２の範囲である。

【００２９】本発明の分析素子の展開層又は反応層には
界面活性剤、例えばノニオン性界面活性剤を含有させる
ことができる。ノニオン性界面活性剤の具体例として、
ｐ−オクチルフェノキシンポリエトキシエタノール、ｐ
−ノニルフェノキシポリエトキシエタノール、ポリオキ
シエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレンソル
ビタンモノラウレート、ｐ−ノニルフェノキシポリグリ
シドール、オクチルグルコシド等がある。これらのノニ
オン性界面活性剤のうちでは、ｐ−オクチルフェノキシ
ポリエトキシエタノール、ｐ−ノニルフェノキシポリエ
トキシエタノール、ｐ−ノニルフェノキシポリグリシド
ールなどが好ましい。ノニオン性界面活性剤を展開層に
含有させることにより水性液体試料の展開作用（メータ
リング作用）がより良好になる。ノニオン性界面活性剤
を反応層に含有させることにより分析操作時に水性液体
試料中の水が反応層に実質的に一様に吸収されやすくな
り、また展開層との液体接触が迅速にかつ実質的に一様
になる。

【００３０】また、展開層には親水性ポリマーも含有さ
せることができる。この親水性ポリマーには、澱粉、セ
ルロース、アガロース、ゼラチンおよびこれらの誘導体
（例、ヒドロキシメチル化およびヒドロキシプロピル化
等）、アクリルアミド重合体、アクリルアミドと各種ビ
ニル性モノマーとの共重合体、ビニルピロリドン重合
体、ビニルピロリドンと各種ビニル性モノマーとの共重
合体、アクリレート重合体およびアクリレートと各種ビ
ニル性モノマーとの共重合体等を挙げることができる。
上記親水性ポリマーのうちではビニルピロリドン誘導体
が好ましい。

【００３１】本発明の一体型多層分析素子は、一辺約１
０ｍｍから約３０ｍｍの正方形またはほぼ同サイズの円
形等の小片に裁断し特開昭５７−６３４５２号、特開昭
５４−１５６０７９号、実開昭５６−１４２４５４号、
実開昭５８−３２３５０号および特開昭５８−５０１１
４４号各公報等に開示のスライド枠等に納めて分析スラ
イドとして用いるのが製造、包装、輸送、保存および測
定操作等の全ての観点で好ましい。

【００３２】本発明の一体型多層分析素子は、前述の諸
公報に開示の方法に従い約５μｌから約３０μｌ、好ま
しくは約８μｌから約１５μｌの水性液体試料を多孔性
展開層に点着供給し、必要に応じて約２０℃から約４５
℃の範囲の実質的に一定の温度でインクベーションの後
に、光透過性支持体側から一体型多層分析素子内の色変
化、発色等の検出可能な変化を反射測光し比色法の原理
により液体試料中の測定対象成分を分析する。

【００３３】

【実施例】［実施例１］ゼラチン下塗り層が設けられて
いる厚さ１８０μｍの無色透明ポリエチレンテレフタレ
ート（ＰＥＴ）平滑フィルムシート（支持体）上に下記
に記載の被覆量になるようにして反応層塗布液を塗布
し、さらにそれを乾燥させて反応層を設けた。 ＭｇＣｌ_２ ０．５ｇ／ｍ^２ ゼラチン １５ｇ／ｍ^２ ノニオン系界面活性剤 ０．６５ｇ／ｍ^２ ロイコ色素 ０．２２ｇ／ｍ^２ ＡＴＰ・２Ｎａ １ｇ／ｍ^２ ＧＫＺ ４ＫＵ／ｍ^２ ＧＰＯＳＰ ２０ＫＵ／ｍ^２ ＰＤＯ １５ＫＵ／ｍ^２ ＧＫＺ：グリセリンキナーゼ ＧＰＯＳＰ：Ｌ−α−グリセロリン酸オキシダーゼ ＰＯＤ：ペルオキシダーゼ

【００３４】ついで、この反応層の上に３０ｇ／ｍ^２の
割合で水を供給して湿潤させた後、トリコット編物布地
（ポリエチレンテレフタレート紡績糸製４０ゲージ）を
ほぼ一様に軽く圧力をかけてラミネートして多孔性展開
層を設けた。

【００３５】次に、この展開層の上から、下記に記載の
被覆量になるようにほぼ一様に塗布し、さらにそれを乾
燥させてリパーゼ測定用一体型多層乾式分析素子を作製
した。 トリオレイン ９ｇ／ｍ^２ ノニオン系界面活性剤 １．２ｇ／ｍ^２ トリシン ５ｇ／ｍ^２ デオキシコール酸Ｎａ １ｇ／ｍ^２ ポリアクリルアミド ３．９ｇ／ｍ^２ コリパーゼ ４０ＫＵ／ｍ^２ ＭＧＬＰ ９ＫＵ／ｍ^２ ガラスパウダー ４．５ｇ／ｍ^２ ＭＧＬＰ：モノグリセリドリパーゼ ガラスパウダー：平均粒径５ｍμ

【００３６】［比較例１］ガラスパウダーを添加しなか
ったほかは、実施例１と同様にして、リパーゼ測定用一
体型乾式多層分析素子を作製した。

【００３７】［測定例１］上記２つの分析素子に、リパ
ーゼ２００Ｕ／Ｌを含む水溶液１０μｌを点着し、３７
℃でインキュベートして支持体側から６００ｎｍで反射
光学濃度の経時変化を測定した。その結果、直線変化時
の光学濃度変化速度として次の結果を得た。 ΔＯＤ／ｍｉｎ 実施例１ ０．０７４ 比較例１ ０．０４１

【００３８】

【発明の効果】本発明の乾式分析素子を用いることによ
って、リパーゼを迅速かつ正確に測定することができ
る。本発明の乾式分析素子は、取扱上問題がない十分な
強度を有しており、特に、自動分析装置に用いられるマ
ウント（枠）のない乾式分析素子としても利用できる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 2G045 AA40 DA20 FA26 FA29 FB17 GC11 HA10 4B029 AA07 BB16 FA13 4B063 QA01 QQ32 QR02 QR03 QR07 QR45 QR84 QS02

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 少なくとも展開層、反応層及び水不透過
   性透明支持体がこの順に積層されており、グリセリドを
   基質とし、グリセロールキナーゼ、Ｌ−α−グリセロリ
   ン酸オキシダーゼ及びペルオキシダーゼを共役酵素とし
   て用いる反応試薬系が組み込まれているリパーゼ測定用
   多層乾式分析素子において、グリセリドに、３つの水酸
   基の全てに長鎖脂肪酸がエステル結合されているトリグ
   リセリドを用い、展開層には布を用い、その布の空隙に
   無機又は有機質の微粒子を含有させたことを特徴とする
   リパーゼ測定用多層乾式分析素子