JPH08103296A - 遊離脂肪酸測定用乾式分析要素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 血液等の液体試料に含まれる遊離脂肪酸を高
感度かつ高精度で測定できる乾式分析要素を提供する。 【構成】 少なくとも多孔性展開層、試薬層および水不
透過性支持体がこの順に積層されており、遊離脂肪酸と
反応して過酸化水素を発生させる脂肪酸測定試薬組成物
とペルオキシダーゼとＨ₂Ｏ₂発色試薬成分として一般式
〔Ｉ〕で示される尿素誘導体を含有することを特徴とす
る遊離脂肪酸測定用乾式分析要素。 【化１】 ｛式中、Ｒ¹，Ｒ²は夫々独立して４−ジ置換アミノアリ
ール基を示し、Ｒ¹とＲ²のアリール基は、酸素又は硫黄
原子を介して互いに結合していてもよく、Ｒ³はカルボ
キシアルキル基、アルコキシカルボニル基、アルキルカ
ルボニル基、アリールスルホニル基、スルホアリール基
又はカルボキシアリール基を示す。｝

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は液体試料中、例えば血液
中の遊離脂肪酸の測定方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】血中の遊離脂肪酸濃度は肝臓疾患、内分
泌に関する疾患、糖尿病など、糖質や脂質の代謝異常に
基づく疾患の指標として有益であり、種々の分析法が開
発されている。例えば、有機溶剤で抽出してアルカリで
中和滴定する方法、硝酸銅とトリエタノールアミンを作
用させて銅塩に変えこれを定量する方法、アデノシン三
リン酸とコエンザイムＡの存在下でアシルコエンザイム
Ａシンセターゼを作用させて生成したアデノシン一リン
酸を定量する方法等がある。上記のコエンザイムＡを使
用する方法ではアシルコエンザイムＡシンセターゼを作
用させることによる生成物であるアシルコエンザイムＡ
にＳＨ試薬の存在下でアシルコエンザイムＡ酸化酵素を
作用させて酸化し、生じた過酸化水素を測定する方法も
知られている（特開昭５７−８７９７号公報）。

【０００３】これらはいずれも湿式分析法であり、乾式
分析法による遊離脂肪酸の測定方法はまだ開発されてい
ない。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】近年、簡便でありなが
ら分析精度の高い方法として乾式分析要素が開発され、
各種の分析項目が乾式分析要素で分析しうるようになっ
てきている。

【０００５】本発明者らは、遊離脂肪酸を定量しうる乾
式分析を開発明するべく種々検討の結果、Ｈ₂Ｏ₂発色系
試薬の使用に注目した。しかしながら、従来Ｈ₂Ｏ₂発色
系試薬として使用されている特開昭５３−２６１８８
（対応米国特許４ ０８９ ７４７）等に記載のトリアリ
ールイミダゾールロイコ色素、特開昭５９−１９３３５
２（対応ＥＰ特許０ １２２ ６４１Ｂ）等に記載のジア
リールイミダゾールロイコ色素などのロイコ色素や４−
アミノアンチピリンと１，７−ジヒドロキシナフタレン
の組合せからなる改良Ｔｒｉｎｄｅｒ発色試薬組成物を
用いたのでは全く感度が得られなかった。

【０００６】本発明の目的は、血液等の液体試料に含ま
れる遊離脂肪酸を高感度かつ高精度で定量分析できる乾
式分析要素を提供することにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記の乾式
分析要素を開発するべくさらに検討を進めた結果、Ｈ ₂
Ｏ₂発色系試薬として特定の尿素誘導体を用いることに
よって上記目的を達成しうることを見出して本発明を完
成するに到った。

【０００８】すなわち、本発明は、少なくとも多孔性展
開層、試薬層および水不透過性支持体がこの順に積層さ
れており、遊離脂肪酸と反応して過酸化水素を発生させ
る脂肪酸測定試薬組成物とペルオキシダーゼとＨ₂Ｏ₂発
色試薬成分として一般式〔Ｉ〕で示される尿素誘導体を
含有することを特徴とする遊離脂肪酸測定用乾式分析要
素。

【０００９】

【化２】

【００１０】｛式中、Ｒ¹，Ｒ²は夫々独立して４−ジ置
換アミノアリール基を示し、Ｒ¹とＲ²のアリール基は、
酸素又は硫黄原子を介して互いに結合していてもよく、
Ｒ³はカルボキシアルキル基、アルコキシカルボニル
基、アルキルカルボニル基、アリールスルホニル基、ス
ルホアリール基又はカルボキシアリール基を示す。｝に
関するものである。

【００１１】本発明の遊離脂肪酸測定用一体型多層分析
要素の支持体層を構成するものとしては、光透過性でか
つ水不透過性である支持体が好ましい。光透過性・水不
透過性支持体の例としては、ポリエチレンテレフタレー
ト、ビスフェノールＡのポリカルボネート、ポリスチレ
ン、セルロースエステル（例、セルロースジアセテー
ト、セルローストリアセテート、セルロースアセテート
プロピオネート等）等のポリマーからなる厚さ約５０μ
ｍから約１ｍｍ、好ましくは約８０μｍから約３００μ
ｍの範囲のフィルムもしくはシート状の透明支持体を挙
げることができる。

【００１２】支持体の表面には必要により下塗層を設け
て、支持体の上に設けられる試薬層と支持体との接着を
強固なものにすることができる。また、下塗層の代り
に、支持体の表面を物理的あるいは化学的な活性化処理
を施して接着力の向上を図ってもよい。

【００１３】支持体の上には（場合によっては下塗層等
の他の層を介して）試薬層が設けられる。試薬層はアナ
ライトである遊離脂肪酸と反応して光学的に検出可能な
変化を生じる後述の試薬組成物の少なくとも一部が親水
性ポリマーバインダー中に実質的に一様に分散されてい
る吸水性で水浸透性の層である。

【００１４】試薬層のバインダーとして用いることがで
きる親水性ポリマーは、一般には水吸収時の膨潤率が３
０℃で約１５０％から約２０００％、好ましくは約２５
０％から約１５００％の範囲の天然または合成親水性ポ
リマーである。そのような親水性ポリマーの例として
は、特開昭５８−１７１８６４号公報および特開昭６０
−１０８７５３号公報等に開示されているゼラチン
（例、酸処理ゼラチン、脱イオンゼラチン等）、ゼラチ
ン誘導体（例、フタル化ゼラチン、ヒドロキシアクリレ
ートグラフトゼラチン等）、アガロース、プルラン、プ
ルラン誘導体、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコ
ール、ポリビニルピロリドン等をあげることができる。

【００１５】試薬層は架橋剤を用いて適宜に架橋硬化さ
れた層とすることができる。架橋剤の例として、ゼラチ
ンに対する１,２−ビス(ビニルスルホニルアセトアミ
ド）エタン、ビス（ビニルスルホニルメチル）エーテル
等の公知のビニルスルホン系架橋剤、アルデヒド等、メ
タリルアルコールコポリマーに対するアルデヒド、２個
のグリシジル基含有エポキシ化合物等がある。

【００１６】試薬層の乾燥時の厚さは約１μｍから約１
００μｍの範囲であることが好ましく、より好ましくは
約３μｍから約３０μｍの範囲である。また試薬層は実
質的に透明であることが好ましい。

【００１７】上記試薬層の上に必要に応じて光遮蔽層を
設けることができる。光遮蔽層は、光吸収性または光反
射性（これらを合わせて光遮蔽性という。）を有する微
粒子または微粉末（以下、単に微粒子という）が少量の
被膜形成能を有する親水性ポリマーバインダーに分散保
持されている水透過性または水浸透性の層である。光遮
蔽層は試薬層にて発生した検出可能な変化（色変化、発
色等）を光透過性を有する支持体側から反射測光する際
に、後述する展開層に点着供給された水性液体の色、特
に試料が全血である場合のヘモグロビンの赤色等、を遮
蔽するとともに光反射層または背景層としても機能す
る。

【００１８】光反射性を有する微粒子の例としては、二
酸化チタン微粒子（ルチル型、アナターゼ型またはブル
カイト型の粒子径が約０．１μｍから約１．２μｍの微
結晶粒子等）、硫酸バリウム微粒子、アルミニウム微粒
子または微小フレーク等を挙げることができ、光吸収性
微粒子の例としては、カーボンブラック、ガスブラッ
ク、カーボンミクロビーズ等を挙げることができ、これ
らのうちでは二酸化チタン微粒子、硫酸バリウム微粒子
が好ましい。特に好ましいのは、アナターゼ型二酸化チ
タン微粒子である。

【００１９】被膜形成能を有する親水性ポリマーバイン
ダーの例としては、前述の試薬層の製造に用いられる親
水性ポリマーと同様の親水性ポリマーのほかに、弱親水
性の再生セルロース、セルロースアセテート等を挙げる
ことができ、これらのうちではゼラチン、ゼラチン誘導
体、ポリアクリルアミド等が好ましい。なお、ゼラチ
ン、ゼラチン誘導体は公知の硬化剤（架橋剤）を混合し
て用いることができる。

【００２０】光遮蔽層は、光遮蔽性微粒子と親水性ポリ
マーとの水性分散液を公知の方法により試薬層の上に塗
布し乾燥することにより設けることができる。また光遮
蔽層を設ける代りに、後述する展開層中に光遮蔽性微粒
子を含有させてもよい。

【００２１】なお、試薬層の上に、場合によっては光遮
蔽層等の層を介して、後述する展開層を接着し積層する
ために接着層を設けてもよい。

【００２２】接着層は水で湿潤しているとき、または水
を含んで膨潤しているときに展開層を接着することがで
き、これにより各層を一体化できるような親水性ポリマ
ーからなることが好ましい。接着層の製造に用いること
ができる親水性ポリマーの例としては、試薬層の製造に
用いられる親水性ポリマーと同様な親水性ポリマーがあ
げられる。これらのうちではゼラチン、ゼラチン誘導
体、ポリアクリルアミド等が好ましい。接着層の乾燥膜
厚は一般に約０．５μｍから約２０μｍ、好ましくは約
１μｍから約１０μｍの範囲である。

【００２３】なお、接着層は試薬層上以外にも、他の層
間の接着力を向上させるため所望の層上に設けてもよ
い。接着層は親水性ポリマーと、必要によって加えられ
る界面活性剤等を含む水溶液を公知の方法で、支持体や
試薬層等の上に塗布する方法などにより設けることがで
きる。

【００２４】多孔性展開層としては特開昭５５−１６４
３５６号公報、特開昭５７−６６３５９号公報等に記載
の織物布地展開層（例：ブロード、ポプリン等の平織布
地等）、特開昭６０−２２２７６９号公報等に記載の編
物布地展開層（例：トリコット編布地、ダブルトリコッ
ト編布地、ミラニーズ編布地等）、特開平１−１７２７
５３号公報に記載のアルカリエッチング液でエッチング
処理した織物布地又は編物布地からなる展開層、特開昭
５７−１４８２５０号公報に記載の有機ポリマー繊維パ
ルプ含有抄造紙からなる展開層；特公昭５３−２１６７
７号公報、米国特許３,９９２,１５８等に記載のメンブ
ランフイルタ(ブラッシュポリマー層)、ポリマーミクロ
ビーズ、ガラスミクロビーズ、珪藻土が親水性ポリマー
バインダーに保持されてなる連続微空隙含有多孔性層等
の非繊維等方的多孔性展開層、特開昭５５−９０８５９
号公報に記載のポリマーミクロビーズが水で膨潤しない
ポリマー接着剤で点接触状に接着されてなる連続微空隙
含有多孔性層（三次元格子状粒状構造物層）からなる非
繊維等方的多孔性展開層等を用いることができる。

【００２５】多孔性展開層に用いられる織物布地、編物
布地又は抄造紙は特開昭５７−６６３５９に記載のグロ
ー放電処理またはコロナ放電処理に代表される物理的活
性化処理を布生地又は紙の少なくとも片面に施すか、ま
たは特開昭５５−１６４３５６、特開昭５７−６６３５
９等に記載の水洗脱脂処理、界面活性剤含浸又は親水性
ポリマー含浸等の親水化処理、またはこれらの処理工程
を適宜に組み合せて逐次実施することにより布地又は紙
を親水化し、下側（支持体に近い側）の層との接着力を
増大させることができる。

【００２６】本発明の多層分析要素には、支持体と試薬
層の間に吸水層を設けることができる。吸水層は水を吸
収して膨潤する親水性ポリマーを主成分とする層で、吸
水層の界面に到達または浸透した水性液体試料の水を吸
収できる層であり、全血試料を用いる場合には水性液体
成分である血漿の試薬層への浸透を促進する作用を有す
る。吸水層に用いられる親水性ポリマーは前述の試薬層
に使用されるもののなかから選択することができる。吸
水層には一般的にはゼラチンまたはゼラチン誘導体、ポ
リアクリルアミド、ポリビニルアルコール、特に前述の
ゼラチン又は脱イオンゼラチンが好ましく、試薬層と同
じ前述のゼラチンが最も好ましい。吸水層の乾燥時の厚
さは約３μｍから約１００μｍ、好ましくは約５μｍか
ら約３０μｍの範囲、被覆量では約３ｇ／ｍ²から約１
００ｇ／ｍ²、好ましくは約５ｇ／ｍ²から約３０ｇ／ｍ
²の範囲である。吸水層には後述するｐＨ緩衝剤、公知
の塩基性ポリマー等を含有させて使用時（分析操作実施
時）のｐＨを調節することができる。さらに吸水層には
公知の媒染剤、ポリマー媒染剤等を含有させることがで
きる。

【００２７】一方、血球分離層を展開層の上に別異の層
として載置するか、あるいは展開層と一体化して設ける
こともできる。血球分離層としては特開昭６１−４９５
９（ＵＳ５ ０１９ ３４７）、特開昭６２−１３８７５
７（ＥＰ０ ２２６ ４６５Ａ）、特開平０３−１６６５
１（ＥＰ０ ３８２ ２０７Ａ）、特開平０３−２６２９
６７等の記載の、少なくとも３層の多孔性層が、支持体
側から第１の繊維質多孔性層、非繊維質多孔性層、第２
の繊維質多孔性層の順に、それぞれ隣接する界面の間
で、液体の一様透過が実質的に妨げられない微少貫通部
が形成されるように部分的に配置された接着剤により実
質的に密着した状態で接着積層されて一体化した複数の
多孔性層の積層構造物層（この接着を部分接着又は多孔
性接着という）、特開平０３−１３１７５７（ＥＰ０
４２３ ７８４Ａ）に記載のフィラメント平均直径０．
２μｍ〜１０μｍの微細繊維からなる不織布の単一層又
はその支持体側に繊維質又は非繊維質多孔性層が部分接
着（又は多孔性接着）された複数の多孔性層の積層構造
物層、特開平０３−１３１７５８（ＥＰ０ ４２３ ７８
４Ａ）に記載のフィラメント平均直径１μｍ〜３０μ
ｍ、平均繊維長０．５ｍｍ〜５．０ｍｍの繊維を立毛さ
せた織物布地又は編物布地の単一層又はその支持体側に
繊維質又は非繊維質多孔性層が部分接着（又は多孔性接
着）された複数の多孔性層の積層構造物層、特開平０３
−１３１７５９（ＥＰ０ ４２３ ７８４Ａ）に記載のフ
ィラメント平均直径０．１μｍ〜７μｍの微細繊維から
なる織物布地又は編物布地の単一層又はその支持体側に
繊維質又は非繊維質多孔性層が部分接着（又は多孔性接
着）された複数の多孔性層の積層構造物層、特開昭５７
−５３６６１（ＥＰ０ ０４５ ４７６Ａ）、特開昭６１
−９６４６６（ＥＰ０ １５９７２７Ａ）等の記載の繊
維質又は非繊維質の多孔性層の上（支持体から遠い側）
にガラス繊維濾紙を載置した積層構造物層があげられ
る。これらの血球分離層が展開層の機能を有する態様に
おいては、展開層を別個に設ける必要がないことはいう
までもない。血球分離層を乾燥分析要素の最上層に設け
るとにより、全血試料を適用して遊離脂肪酸の正確な定
量分析をすることができる。

【００２８】本発明の一体型多層分析要素に組み込まれ
る呈色試薬組成物は遊離脂肪酸と反応して過酸化水素を
発生させる脂肪酸測定試薬組成物と、Ｈ₂Ｏ₂発色試薬成
分として一般式〔Ｉ〕で示される尿素誘導体とペルオキ
シダーゼからなる。

【００２９】一般式〔Ｉ〕

【化３】

【００３０】｛式中、Ｒ¹，Ｒ²は夫々独立して４−ジ置
換アミノアリール基を示し、Ｒ¹とＲ²のアリール基は、
酸素又は硫黄原子を介して互いに結合していてもよく、
Ｒ³はカルボキシアルキル基、アルコキシカルボニル
基、アルキルカルボニル基、アリールスルホニル基、ス
ルホアリール基又はカルボキシアリール基を示す。｝で
示される尿素誘導体は過酸化水素等の酸化物質の発色試
薬として開発されたものであり、その詳細は特開昭63−
246356号公報に説明されている。該尿素誘導体に於い
て、Ｒ¹，Ｒ²で示される４−ジ置換アミノアリール基に
於けるジ置換アミノ基

【００３１】

【化４】

【００３２】及び

【化５】

【００３３】の置換基Ｒ⁴〜Ｒ⁷としては、例えばアルキ
ル基、カルボキシルアルキル基、ヒドロキシアルキル
基、アルコキシアルキル基（これらアルキル基、置換ア
ルキル基のアルキル基としては、例えばメチル基、エチ
ル基、プロピル基、ブチル基、アミル基、ヘキシル基等
炭素数１〜６の低級アルキル基（直鎖状、分岐状のいず
れにても可。）が挙げられ、アルコキシアルキル基のア
ルコキシ基としては、例えばメトキシ基、エトキシ基、
プロポキシ基、ブトキシ基、アミルオキシ基、ヘキシル
オキシ基等炭素数１〜６の低級アルコキシ基（直鎖状、
分岐状のいずれにても可。）が挙げられる。カルボキシ
アルキル基はカルボキシル基の部分が、ナトリウム、カ
リウム、リチウム等のアルカリ金属塩、又はアンモニウ
ム塩等の塩の形になっていてもよい。）等が挙げられ、
Ｒ⁴とＲ⁵、Ｒ⁶とＲ⁷は夫々同じであっても異なっていて
もよい。またＲ⁴とＲ⁵又は／及びＲ⁶とＲ⁷が互いに結合
して、Ｒ⁴，Ｒ⁵及びＮとで又は／及びＲ⁶，Ｒ⁷及びＮと
で、例えばピペリジン環の如き環を形成していてもよ
い。４−ジ置換アミノアリール基のアリール基としては
フェニル基、置換フェニル基（例えばトリル基、メトキ
シフェニル基等）、ナフチル基、置換ナフチル基（例え
ばメチルナフチル基、メトキシナフチル基等）等が挙げ
られる。Ｒ¹とＲ²のアリール基は、また、酸素又は硫黄
原子を介して、例えば

【００３４】

【化６】

【００３５】Ｘ：Ｓ又はＯの如く互いに結合していても
よい。また、Ｒ³で示される、カルボキシアルキル基、
アルキルカルボニル基のアルキル基としては、例えばメ
チル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、アミル基、
ヘキシル基等炭素数１〜６のアルキル基（直鎖状、分岐
状のいずれにても可。）が挙げられ、アルコキシカルボ
ニル基のアルコキシ基としては、例えばメトキシ基、エ
トキシ基、プロポキシ基、ブトキシ基、アミルオキシ
基、ヘキシルオキシ基等炭素数１〜６のアルコキシ基
（直鎖状、分岐状のいずれにても可。）が挙げられる。
アリールスルホニル基、スルホアリール基、カルボキシ
アリール基のアリール基としては、例えばフェニル基、
置換フェニル基（例えばトリル基、メトキシフェニル基
等）、ナフチル基、置換ナフチル基（例えばメチルナフ
チル基、メトキシナフチル基）等が例示される。Ｒ³と
しては、これらカルボキシアルキル基、アルコキシカル
ボニル基、アルキルカルボニル基、アリールスルホニル
基、スルホアリール基、カルボキシアリール基等が通常
好ましく用いられるが、これらに限定されるものではな
く、一般に知られている親水性を有する官能基や極性の
高い構造を有する官能基を導入することも勿論可能であ
る。

【００３６】本発明で特に好ましいものは上記の一般式
〔II〕で示されるものであり、Ｒ⁴〜Ｒ⁷がいずれも炭素
数１〜６の低級アルキル基のものが特に好ましい。市販
品の例としては下記構造のもの(「ＤＡ−６７」，和光
純薬工業(株)製品)がある。

【００３７】

【化７】

【００３８】ペルオキシダーゼ（ＥＣ１．１１．１．
７）はその由来等は問うところではなく、その至適ｐ
Ｈ、入手の安易等を考慮して適当なものを選択すればよ
い。好ましいペルオキシダーゼの具体例として西洋わさ
びペルオキシダーゼである。

【００３９】遊離脂肪酸と反応して過酸化水素を発生さ
せる脂肪酸測定試薬組成物としては、例えばアデノシン
三リン酸、コエンザイムＡ（ＣｏＡ）、アシルＣｏＡシ
ンセターゼ、ＳＨ試薬、およびアシルＣｏＡオキシダー
ゼからなる特開昭５７−８７９７号公報開示のものがあ
る。ＳＨ試薬とは、−ＳＨ基を有する化合物であるＣｏ
Ａの還元作用を抑制する化合物を意味し、例えばマレイ
ミド誘導体、ヨードアセトアミドがあげられる。遊離脂
肪酸と反応して過酸化水素を発生させる脂肪酸測定試薬
組成物のほかの例としては特開昭５６−１５８０９７に
記載の、アシルＣｏＡ合成酵素（シンセターゼ）（ＥＣ
６．２．１．３）、アシルＣｏＡ酸化酵素（オキシダー
ゼ）（ＥＣ１．３．３．Ｘ）、アデノシン三燐酸、Ｍｇ
²⁺イオンを含む遊離脂肪酸測定試薬組成物とペルオキシ
ダーゼ、Ｈ₂Ｏ₂発色試薬組成物、酸性試薬（例：塩酸、
硫酸等の無機酸、酢酸、枸櫞酸、蓚酸等の有機酸のいず
れか）を含む酸性のＨ₂Ｏ₂発色試薬組成物の２試薬系を
用いる還元性物質の影響を低減させた遊離脂肪酸測定方
法に用いられる遊離脂肪酸測定試薬組成物等挙げること
ができる。

【００４０】本発明の遊離脂肪酸測定用乾式分析要素に
含有させる呈色試薬組成物の含有量としては、一般式
〔Ｉ〕で示される尿素誘導体が約１０ｍｇ／ｍ²〜約２
０ｇ／ｍ²程度、好ましくは約１００ｍｇ／ｍ²〜約１．
０ｇ／ｍ²程度、ペルオキシダーゼが約１０００Ｕ／ｍ²
〜約２００ＫＵ／ｍ²程度、好ましくは約３０００Ｕ／
ｍ²〜約５０ＫＵ／ｍ²程度が適当である。脂肪酸測定試
薬組成物として、アデノシン三リン酸約１．０ｇ／ｍ²
〜約１００ｇ／ｍ²程度、好ましくは約２．０ｇ／ｍ²〜
約５０ｇ／ｍ²程度、コエンザイムＡ約１００ｍｇ／ｍ²
〜約１０ｇ／ｍ²程度、好ましくは約２００ｍｇ／ｍ²〜
約８．０ｇ／ｍ²程度、アシルＣｏＡシンセターゼ約１
０００Ｕ／ｍ²〜約３０ＫＵ／ｍ²程度、好ましくは約２
０００Ｕ／ｍ ²〜約２０ＫＵ／ｍ²程度、アシルＣｏＡオ
キシダーゼ約１００Ｕ／ｍ²〜約２０ＫＵ／ｍ²程度、好
ましくは約２００Ｕ／ｍ²〜約１５ＫＵ／ｍ²程度、Ｍｇ
²⁺イオン約２０ｍｇ／ｍ²〜約１．０ｇ／ｍ²程度、好ま
しくは約４０ｍｇ／ｍ²〜約６００ｍｇ／ｍ²程度が適当
である。

【００４１】この試薬組成物は全てを試薬層に含有させ
てもよく、また、一部を展開層等他の層に含有させても
よい。その場合、Ｈ₂Ｏ₂発生試薬組成物はひとまとめに
し、尿素誘導体とペルオキシダーゼも同じ層に含有させ
ることが好ましい。好ましい態様のひとつは脂肪酸測定
試薬組成物を展開層に、そして尿素誘導体とペルオキシ
ダーゼを試薬層に含有させるものである。呈色試薬組成
物全体を展開層に含有させることもできる。

【００４２】本発明の分析要素には、その他の試薬も加
えることができる。このような試薬には緩衝剤、界面活
性剤等がある。別の態様として、シアルＣｏＡオキシダ
ーゼ以外の脂肪酸測定試薬組成物の成分を展開層に含有
させ、シアルＣｏＡオキシダーゼ、尿素誘導体及びペル
オキシダーゼを試薬層に含有させることもできる。

【００４３】本発明の分析要素に含有させることができ
る緩衝剤の例としては、炭酸塩、ホウ酸塩、燐酸塩、ト
リス塩およびグッド（Ｇｏｏｄ）の緩衝剤などの公知の
緩衝剤を挙げることができる。これらの緩衝剤は「蛋白
質・酵素の基礎実験法」（梶尾武一他，南江堂，１９８
１）等の公知文献を参考にして選択し、使用することが
できる。含有量は一体型多層分析要素で通常使用されて
いる量と同程度でよく、約１００ｍｇ／ｍ²〜約５．０
ｇ／ｍ²の範囲、好ましくは約５００ｍｇ／ｍ²〜約３．
０ｇ／ｍ²の範囲である。

【００４４】本発明の分析要素の展開層又は試薬層には
界面活性剤、例えばノニオン性界面活性剤を含有させる
ことができる。ノニオン性界面活性剤の具体例として、
ｐ−オクチルフェノキシンポリエトキシエタノール、ｐ
−ノニルフェノキシポリエトキシエタノール、ポリオキ
シエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレンソル
ビタンモノラウレート、ｐ−ノニルフェノキシポリグリ
シドール、オクチルグルコシド等がある。これらのノニ
オン性界面活性剤のうちでは、ｐ−オクチルフェノキシ
ポリエトキシエタノール、ｐ−ノニルフェノキシポリエ
トキシエタノール、ｐ−ノニルフェノキシポリグリシド
ールなどが好ましい。ノニオン性界面活性剤を展開層に
含有させることにより水性液体試料の展開作用（メータ
リング作用）がより良好になる。ノニオン性界面活性剤
を吸水層に含有させることにより分析操作時に水性液体
試料中の水が吸水層に実質的に一様に吸収されやすくな
り、また展開層との液体接触が迅速にかつ実質的に一様
になる。

【００４５】また、展開層には親水性ポリマーも含有さ
せることができる。この親水性ポリマーには、澱粉、セ
ルロース、アガロース、ゼラチンおよびこれらの誘導体
（例、ヒドロキシメチル化およびヒドロキシプロピル化
等）、アクリルアミド重合体、アクリルアミドと各種ビ
ニル性モノマーとの共重合体、ビニルピロリドン重合
体、ビニルピロリドンと各種ビニル性モノマーとの共重
合体、アクリレート重合体およびアクリレートと各種ビ
ニル性モノマーとの共重合体等を挙げることができる。
上記親水性ポリマーのうちではビニルピロリドン誘導体
が好ましい。

【００４６】本発明の一体型多層分析要素は、一辺約１
０ｍｍから約３０ｍｍの正方形またはほぼ同サイズの円
形等の小片に裁断し特開昭５７−６３４５２号、特開昭
５４−１５６０７９号、実開昭５６−１４２４５４号、
実開昭５８−３２３５０号および特開昭５８−５０１１
４４号各公報等に開示のスライド枠等に納めて分析スラ
イドとして用いるのが製造、包装、輸送、保存および測
定操作等の全ての観点で好ましい。

【００４７】本発明の一体型多層分析要素は、前述の諸
公報に開示の方法に従い約５μｌから約３０μｌ、好ま
しくは約８μｌから約１５μｌの水性液体試料を多孔性
展開層に点着供給し、必要に応じて約２０℃から約４５
℃の範囲の実質的に一定の温度でインクベーションの後
に、光透過性支持体側から一体型多層分析要素内の色変
化、発色等の検出可能な変化を反射測光し比色法の原理
により液体試料中の測定対象成分を分析する。

【００４８】

【実施例】ゼラチン下塗り層が設けられている厚さ１８
０μｍの無色透明ポリエチレンテレフタレート（ＰＥ
Ｔ）平滑フィルムシート（支持体）上に表１記載の被覆
量になるようにして試薬層塗布液を塗布し、さらにそれ
を乾燥させて試薬層を設けた。

【００４９】

【表１】 ＊：10−(Carboxymethylaminocarbonyl)−3,7−bis(dim
ethylamino)phenothiazine sodium salt **：１,２−ビス（ビニルスルホニルアセトアミド）エ
タン

【００５０】ついで、この試薬層の上に３０ｇ／ｍ²の
割合で水を供給して湿潤させた後、トリコット編物布地
（ポリエチレンテレフタレート紡績糸製４０ゲージ）を
ほぼ一様に軽く圧力をかけてラミネートして多孔性展開
層を設けた。

【００５１】次に、この展開層の上から、下記の表２に
記載の被覆量になるようにほぼ一様に塗布し、さらにそ
れを乾燥させて遊離脂肪酸測定用一体型乾式多層分析要
素を作製した。

【００５２】

【表２】 ***：Piperazine−N,N'−bis(2−ethanesulfonic aci
d）

【００５３】比較例 比較対照として実施例の試薬水溶液の組成（表１）の代
わりに下記表３の組成の溶液を用い、他は実施例と同様
にして遊離脂肪酸測定用分析要素（比較例）を作製し
た。

【００５４】

【表３】 ＊：２−（３,５−ジメトキシ−４−ヒドロキシフェニ
ル）−４−フェネチル−５−（４−ジメチルアミノフェ
ニル）イミダゾール **：１,２−ビス（ビニルスルホニルアセトアミド）エ
タン

【００５５】測定例１ 本発明の実施例及び比較例の分析要素の定量性能を調べ
るために以下の試験を実施した。

【００５６】表４に示した各濃度のオレイン酸水溶液
を、実施例および比較例の分析要素にそれぞれ１０μｌ
ずつ点着した。各分析要素を３７℃にて６分間インキュ
ベーションした後波長６５０ｎｍにて支持体側からの反
射濃度（ＯＤｒ）を測定し、盲検ＯＤｒを差し引いた値
（ｄＯＤｒ）を算出した。結果を表４に示す。

【００５７】

【表４】

【００５８】表４の結果を検量線としてグラフ化すると
図１のようになる。図中、●は実施例品を用いて得られ
たものであり、○は比較例品を用いて得られたものであ
る。表４および図１から本発明である実施例では単位ア
ナライトに対する反射光学濃度値が充分大きく、比較例
に比べ定量感度が良好であり分析要素として適当である
ことが明らかである。又、表５に示す濃度のオレイン酸
水溶液を用いてｎ＝６でＣＶを測定した。

【００５９】

【表５】

【００６０】表５の結果より本実施例は比較例に比べ明
らかにＣＶが良好であることが判る。

【００６１】測定例２ さらに血清試料における本発明の定量性能を確認するた
めに以下の試験を実施した。

【００６２】本例と同測定反応法利用遊離脂肪酸測定市
販キットを用い遊離脂肪酸濃度を検定した市販コントロ
ール血清を用い、測定例１と同様の測定を行い検量線を
作成した。結果を図２に示す。

【００６３】図２から明らかなように本発明の一体型乾
式多層分析要素により遊離脂肪酸水溶液のみならず血清
試料中の遊離脂肪酸を測定することが可能である。

【００６４】

【発明の効果】本発明の分析要素を用いることにより液
体試料中の遊離脂肪酸を簡便に、高感度かつ高精度で測
定できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明の実施例及び比較例の分析要素による
測定例１の結果を示す検量線である。

【図２】 本発明の実施例による測定例２の結果を示す
検量線である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 少なくとも多孔性展開層、試薬層および
   水不透過性支持体がこの順に積層されており、遊離脂肪
   酸と反応して過酸化水素を発生させる脂肪酸測定試薬組
   成物とペルオキシダーゼとＨ₂Ｏ₂発色試薬成分として一
   般式〔Ｉ〕で示される尿素誘導体を含有することを特徴
   とする遊離脂肪酸測定用乾式分析要素。 【化１】 ｛式中、Ｒ¹，Ｒ²は夫々独立して４−ジ置換アミノアリ
   ール基を示し、Ｒ¹とＲ²のアリール基は、酸素又は硫黄
   原子を介して互いに結合していてもよく、Ｒ³はカルボ
   キシアルキル基、アルコキシカルボニル基、アルキルカ
   ルボニル基、アリールスルホニル基、スルホアリール基
   又はカルボキシアリール基を示す。｝