JP2513509B2 - 尿素分析用試薬組成物及びそれを含む一体型多層分析要素 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は尿素窒素（BUN）を測定するための試薬系を
含む、特に臨床検査に有用な一体型多層分析要素に関す
るものである。

〔従来の技術〕

蛋白質代謝の中間体及び最終生成物である尿素窒素
（BUN）の測定は腎疾患の診断、治療経過の判断等のた
めに必要である。従来、これらは湿式法で分析され、例
えば尿素窒素は強酸性条件下でテレフタルアルデヒド及
びフェニレンジアミン誘導体を直接反応させて発色を比
色定量する方法（D.J.Jung,Clin,Chem.,21,1136（197
5））、尿素にウレアーゼを作用させて生成したアンモ
ニウムイオンをネスラー試薬を用いるかあるいはインド
フェノール法で比色定量する方法で定量されていた。イ
ンドフェノール法はその後多くの研究者によって改良が
なされている（例えば、H.Okuda et al,Tokushima J.Ex
ptl.Med.,12（１）,11-23（1965））。この方法は強酸
性条件下で反応させるので装置が腐食しやすいという問
題があり、感度が低いこと及び測定に時間を要すること
も問題であった。

酵素法についても、尿素にウレアーゼを作用させ生成
したアンモニア、グルタミン酸脱水素酵素を利用してNA
DPHの減少量を紫外線吸収の変化を測定して求める方法
が開発されている（A.Mondzac et al,J.Lab.Clin.Med.,
66,526（1965））。この方法も感度及び精度に問題があ
った。尿素にウレアーゼを作用させ生成したアンモニア
とグルタミン酸及びATPの存在下でグルタミン合成酵素
を作用させ、さらにピルビン酸キナーゼ及びピルビン酸
オキシダーゼを作用させて生成した過酸化水素をペルオ
キシダーゼと４−アミノアンチピリンを利用して比色定
量する方法も開発されている（特開昭62-3800号公
報）。

一方、簡便な操作で迅速に定量できる方法として乾式
法も知られている。乾式法に用いる分析器具の例とし
て、日本分析化学会編分析ライブラリ−３「臨床化学分
析II含窒素成分」第２版（東京化学同人、1979年発行）
13〜14頁、「臨床検査」第５巻（第６号）387〜391頁
（1961年発行）米国特許3011874号等には、濾紙片に細
帯状の試薬層（ウレアーゼとアルカリ剤を含み、尿素か
らアンモニアガスを生成させる）、細帯状の障壁物層、
細帯状の指示薬層（pH指示薬ブロムクレゾールグリーン
を含む）がこの層に設けられたBUN定量分析用試薬片が
開示されている。特開昭50-93494号公報には、濾紙片に
pH指示薬ブロムチモールブルーを含浸し、ついでウレア
ーゼと親水性ポリマーからなる障壁形成体との混合物を
さらに含浸し、最後にエチルセルロース半透膜を設けた
BUN定量分析用試験片が開示されている。また、特開昭5
2-3488号公報（特公昭58-19062号）には水不浸透性の透
明支持体の上に支持薬層、アンモニア蒸気が均一に浸透
可能で液体状水およびアルカリ性妨害物が浸透不可能な
セルロースアセテートブチレート等の疎水性ポリマーの
均質（非孔性）薄層からなる障壁物層（透析層）、ウレ
アーゼおよびアルカリ剤を含む試薬層、および多孔性展
開層をこの順に一体に積層してなるBUN定量分析用一体
型多層分析要素等が提案されている。

〔発明が解決しようとする課題〕

従来の乾式法においてはいずれも尿素をウレアーゼで
加水分解し生成したアンモニアガスを試験片ないし分析
要素内を拡散させており、この拡散が定量性に欠けると
いう問題があった。

本発明の目的は蛋白質代謝の中間体及び最終生成物で
ある尿素を簡便な方法で高精度で定量できる分析要素を
提供することにある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは上記目的を達成するべく鋭意検討を行っ
た結果特開昭60-54699号記載の尿素アミドリアーゼにピ
ルビン酸キナーゼ及びピルビン酸オキシダーゼを組合わ
せ、生成した過酸化水素を比色定量する方法に着目する
に至った。特開昭60-54699に記載の尿素分析用試薬組成
物はR.J.Roon et alの見出した（Methods in Enzymolog
y,XVIIA巻、317-324頁（1970年））ATP:アミドリアーゼ
〔EC3,5,1,45〕を用い、ピルビン酸塩をピルビン酸オキ
シダーゼで過酸化水素検出試薬組成物系へ導くピルビン
酸定量試薬組成物系を組み合わせた尿素の酵素的定量分
析用試薬組成物である。この試薬組成物は成分として尿
素アミドリアーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ピルビン酸オ
キシターゼ、２価陽イオン、１価陽イオン、ホスホエノ
ールピルベート、チアミンピロ燐酸、アデノシン三燐
酸、炭酸水素塩、過酸化水素検出用発色試薬組成物を含
む。この試薬組成物に含まれるピルビン酸オキシダーゼ
は熱安定性に欠ける（約40℃を越えると活性値の低下が
早い）ので、酵素的定量分析用試薬組成物の調製工程に
おける品質管理と試薬組成物の使用の保存時の温度管理
は非常に難しい、多層分析要素を製造する際の試薬層塗
布工程で好ましい親水性バインダポリマであるゼラチン
などを使い難いという諸種の問題点のあることが判明し
た。さらにまた、この反応系を乾式分析要素に組込んだ
場合に試料に含まれているピルビン酸が同時に検出され
てこれが誤差になるという問題も生じた。そこで本発明
者らはさらに検討を進め、熱安定性の優れたピルビン酸
デヒドロゲナセーゼ反応系を用いかつこのピルビン酸を
前記の反応系に影響を与えることなく効率よく除去しう
る手段を案出するに至り、これによって前記目的を達成
することができた。

かかる本発明は、尿素アミドリアーゼ、ピルビン酸キ
ナーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼよりなる共役酵素
反応系試薬に電子伝達剤と電子受容性指示薬組成物とこ
れを組込んだ尿素分析用一体型多層分析要素に関するも
のである。

本発明の分析要素において尿素を検出する反応系は下
記のように進行する。

URL:尿素アミドリアーゼ P K:ピルビン酸キナーゼ PDH:ピルビン酸デヒドロゲナーゼ 本発明の試薬組成物に用いられる酵素は約50℃以下の
周囲温度で活性値の低下が生じない酵素である。

尿素アミドリアーゼ〔EC3,5,1,45〕は尿素アミドヒド
ロラーゼともいい、Candida・utilis、Saccharomyces・
cerebisiae等を尿素を唯一の窒素源とする培地に培養す
ることによって産生させることができる。

ピルビン酸キナーゼ〔EC2,7,1,40〕はBacillus・stea
rothermophilus、Bacillus・licheniformis等が産生し
うるほか、ラット、ウサギ、イヌ、ニワトリ等の動物の
筋肉、ブタの心臓などから取得しうる。

ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（PDH;ピルビン酸脱水素
酵素）〔CE1,2,4,1〕はLactobacillus de1−bruekiiな
どの諸種の細菌から抽出された酵素や動物臓器から抽出
された酵素を用いることができる。好ましいPDHはNADH
非依存性のものである。諸種の生物起源のPDHのうちでL
actobacillus delbruekii起源の酵素（東洋紡績（株）
から市販）は好ましい酵素である。この酵素は分子量約
16万、等電点pH4.4±0.1で、FAD、TPP等の補酵素を必要
とするが、燐酸をも基質とする点で従来のピルビン酸デ
ヒドロゲナーゼと異なる酵素である。Michaelis定数は
ピルビン酸に対して4.4×10^-4Ｍ、燐酸に対して1.4×10
^-2Ｍである。また、45℃の50mM pH7.0燐酸緩衝液中で
の活性値減少は極めて少なく、少なくとも３時間にわた
って実質的に活性値の減少は見られなかった。この酵素
に限らず一般にPDHは熱安定性が良く、約50℃の周囲温
度（緩衝液中など）で活性値の減少は僅少なものが多
い。またいずれも市販されており、購入して用いること
ができる。一方、本発明の分析要素用としてはこれらの
酵素は純品でなくともよく、例えば微生物の発酵液ある
いはそれから沈澱等の手段で得た粗製酵素を利用するこ
ともできる。

２価陽イオン及び１価陽イオンは前記の共役酵素を活
性化させるものであり、Mg²⁺、Mn²⁺、K⁺、NH₄ ⁺等を含む。
ホスホエノールピルベートはピルビン酸キナーゼの基質
であり、チアミンピロ燐酸はピルビン酸デヒドロゲナー
ゼの活性化に必要な試薬成分である。アデノシン三燐酸
（ATP）は尿素アミドリアーゼの基質であり、炭酸水素
イオンは尿素アミドリアーゼの活性化に必要な試薬成分
である。

電子伝達剤としてはJ.F Burd et al Clin.Chim Acta
46,223（1973）、S.Nakamura et al Clin.Chim.Acta 10
1,321（1980）等に記載の電子伝達剤やジアホラーゼ〔E
C1,6,4,3〕等の酵素が使用できる。例えば、１−メトキ
シ−５−メチルフェナジニウムメチルサルフェート（１
−メトキシPMS）、メクロラスブルー（９−ジメチルア
ミノベンゾーα−フェナゾニウムクロリド）、５−メチ
ルフェナジニウムメチルサルフェート（PMS）等であ
る。Bacillus・stearothermophilusの産生するDiaphora
seは50℃でも活性が低下しない程熱安定性が高く、特に
好ましい。

指示薬としては還元性発色剤として公知のテトラゾリ
ウム塩類やレサズリン誘導体を使用できる。テトラゾリ
ウム塩類の例としては、３−（ｐ−インドフェニル）−
２−（ｐ−ニトロフェニル−５−フェニル−2H−テトラ
ゾリウムクロリド（INT）、３−（４、５−ジメチル−
２−チアジル）−２、５−ジフェニル−2H−テトラゾリ
ウムブロミド（MTT）、３、３′−（４、４′−ビフェ
ニレン）−ビス（２、５−ジフェニル−2H−テトラゾリ
ウムクロリド）（ネオ−TB）、３、３′（３、３′−ジ
メトキシ−４、４′−ビフェニレン）ビス〔２−（ｐ−
ニトロフェニル）−５−フェニル−2Hテトラゾリウムク
ロリド〕（ニトロ−TB）、3,3′−（3,3′−ジメトキシ
−4,4′−ビフェニレン）ビス（2,5−ジフェニル−2Hテ
トラゾリウムクロリド）（TB）、3,3′−（3,3′−ジメ
トキシ−4,4′−ビフェニレン）ビス〔2,5−ビス（ｐ−
ニトロフェニル）−2Hテトラゾリウムクロリド〕等々を
挙げることができる。

本発明の一体型多層分析要素は少なくとも光透過性
（透明）水不透過性支持体、試薬層及び展開層がこの順
に積層されている。

光透過性水不透過性支持体は一般の多層分析要素に使
用されている公知のものを利用すればよい。その具体例
としては、ポリエチレンテレフタレート、ビスフェノー
ルＡのポリカルボネート、ポリスチレン、セルロースエ
ステル（セルロースジアセテート、セルローストリアセ
テート、セルロースアセテートプロピオネート等）など
のポリマーからなる厚さ約50μｍから約1mm、好ましく
は約80μｍから約300μｍの範囲の透明支持体を用いる
ことができる。支持体の表面には必要により前記の諸特
許明細書等により公知の下塗層または接着層を設けて支
持体の上に設けられる親水性層等との接着を強固にする
ことができる。

試薬層は前記の酵素及び試薬組成物の全部又は一部を
含有する層であり、非孔性で吸水性の層又は微多孔性で
水浸透性の層である。

実質的に非孔性で吸水性の試薬層に用いられる親水性
ポリマーバインダーは水吸収時の膨潤率が30℃で約150
℃から約2000％、好ましくは約250％から約1500％の範
囲の天然または合成親水性ポリマーである。その例とし
て、ゼラチン（酸処理ゼラチン、脱イオンゼラチン
等）、ゼラチン誘導体（フタル化ゼラチン、ヒドロキシ
アクリレートグラフトゼラチン等）、アガロース、プル
ラン、プルラン誘導体、ポリアクリルアミド、ポリビニ
ルアルコール、ポリビニルピロリドン等を挙げることが
できる。実質的に非孔性の試薬層の乾燥厚さは約３μｍ
から約50μｍ、好ましくは約５μｍから約30μｍの範囲
であり、また試薬層は実質的に透明であることが好まし
い。

微多孔性で水浸透性の試薬層は後述する布地展開層と
同様の布地、特開昭57-148250に記載の有機ポリマー繊
維パルプ含有抄造紙、特開昭57-125847等に記載の繊維
と親水性ポリマーの分散液を塗布して形成した多孔性層
等の繊維質多孔性層；特公昭53-21677号、米国特許3992
158等に記載のメンブランフィルター層（ブラッシュポ
リマー層）、ポリマーミクロビーズ等の微粒子が親水性
ポリマーバインダーで点接触状に接着されてなる連続微
空隙含有等方的多孔性層、特開昭55-90859に記載のポリ
マーミクロビーズが水で膨潤しないポリマー接着剤で点
接触状に接着されてなる連続微空隙含有等方的多孔性層
（三次元格子状粒状構造物層）等の非繊維等方的多孔性
層等の微多孔性層に試薬組成物を含有させた層又は固体
微粒子と親水性ポリマーバインダーから構成される微多
孔性構造体に試薬組成物を含有させた層である。微多孔
性試薬層の乾燥時の層厚は約７μｍから約250μｍ、好
ましくは約10μｍから約250μｍの範囲である。微多孔
性試薬層の上に展開層を設ける場合には、両層の間は特
開昭61-4959、特開昭62-138759等に記載の多孔性接着に
よるのが好ましい。

試薬層には公知のpH緩衝剤組成物、高分子pH緩衝剤、
塩基性ポリマー、酸性ポリマー、高分子媒染剤等を含有
させることができる。

展開層としては特公昭53-21677号公報等に開示のメン
ブランフィルタ（ブラッシュポリマー層）、ポリマーミ
クロビーズ、ガラスミクロビーズ、珪藻土が親水性ポリ
マーバインダーに保持されてなる連続微空隙含有多孔性
層、特開昭55-90859号公報に開示のポリマーミクロビー
ズ、ガラスミクロビーズ等で水が膨潤しないポリマー接
着剤で点接触状に接着されてなる連続微空隙含有多孔性
層（三次元格子状粒状構造物層）等の非繊維質等方的多
孔性展開層、特開昭55-164356号公報、特開昭57-66359
号公報等に開示の織物展開層、特願昭59-79158号明細書
に開示の織物展開層、特願昭57-148250号公報に開示の
有機ポリマー繊維パルプを含む抄造紙からなる展開層等
の繊維質多孔性展開層等があげられる。

展開層は直接あるいは必要により接着層を介して積層
される。

糖の代謝生成物であるピルビン酸は血清内に存在する
ので、本発明の試薬組成物を用いて血中尿素を定量分析
する際には内因性ピルビン酸により正誤差が生じる可能
性がある。血清中の尿素含有量は正常値域で2.9〜1.0mm
ol/L、ピルビン酸の含有量は正常値域で0.12〜1.0mmol/
Lであるので、スクリーニング検査などの迅速簡易検査
では状況に応じて無視できる誤差とされることもある
が、通常の定量分析では無視できない誤差とはいえな
い。そこで、本発明の試薬組成物を用いる血中尿素の定
量分析においては内因性ピルビン酸を除去する前処理工
程を付加するのが好ましい。一方、本発明の試薬組成物
を配合した一体型多層分析要素においては、要素内で尿
素分析反応の始る前に内因性ピルビン酸を除去するため
に、尿素からピルビン酸の生成までのいずれかの反応ス
テップ、例えば尿素アミドリアーゼで尿素を加水分解す
るステップ又はピルビン酸キナーゼでピルビン酸を生成
するステップを反応速度の律速状態になるような試薬成
分量で含有させ、他の反応ステップを迅速に進行させる
ような試薬成分量で含有させることにより目的を達成す
ることができる。あるいは試薬層での主反応である尿素
アミドリアーゼの作用する反応ステップ以降を進行させ
る前に内因性ピルビン酸を除去するための反応ステップ
を起こさせるための内因性ピルビン酸除去層を試薬層よ
り上側に設けることが好ましい。

内因性ピルビン酸除去層は、ピルビン酸を基質とする
が、電子伝達剤と電子受容性指示薬組成物と反応する反
応生成物を生じない酵素含有試薬組成物を含む独立の層
として、試薬層より上側（指示体から遠い側）に設ける
ことが好ましい。

このような酵素反応試薬組成物としては、ホスホエノ
ールピルビン酸合成酵素〔EC2.7.9.2〕とATPの組合せ、
ピルビン酸燐酸ジキナーゼ〔EC2.7.9.1〕とATPと燐酸塩
の組合せ、ピルビン酸カルボキシラーゼ〔EC6.4.1.1〕
とATPと炭酸イオンの組合せ等を挙げることができる。
ホスホエノールピルビン酸合成酵素とATPの組合せを用
いることによって２価のマンガンイオンの存在下で試料
中のピルビン酸をホスホエノールピルビン酸に変えるこ
とができ、ピルビン酸燐酸ジキナーゼとATPと燐酸塩の
組合せを用いることによってマグネシウムイオンとアン
モニウムイオン又はカリウムイオンの存在下でピルビン
酸をホスホエノールピルビン酸に変えることができる。
ピルビン酸カルボキシラーゼとATPと炭酸塩の組合せを
用いることによってビオチンとマグネシウムイオンの存
在下でピルビン酸をオキサロ酢酸に変えることができ
る。そのほか、次に示す酵素反応系も内因性ピルビン酸
の除去に利用できる。

内因性ピルビン酸除去層に使用される反応系は、Ｌ−
グルタミン酸合成酵素−ピルビン酸キナーゼ−ピルビン
酸脱水素酵素共役系が充分に機能できるpH域にて活性及
び保存性が保障できるピルビン酸に特異性の高い酵素反
応系が好ましい。更に、不可逆反応を進行させる酵素が
好ましい。また基質や反応生成物が共存させる電子受容
性指示薬組成物（還元系発色剤指示薬組成物）に活性を
持たない酵素反応系が好ましい。

また、上記の酵素反応と共役した反応系をさらに導入
して生成物をさらに別生成物に変えあるいは副生成物を
反応前の化合物に戻すことも好ましい。例えば、ピルビ
ン酸デカルボキシラーゼでアセトアルデヒドと炭酸に分
解する反応は逆反応が起こらない点で好ましい。前記の
共役反応系は数多く存在し、それらのなかから本発明に
適当なものを選択することができる。

酵素反応試薬組成物にはpH緩衝剤、酵素活性化剤等を
さらに組合せることができる。

上記の酵素反応試薬組成物を含むピルビン酸除去層は
試薬層により上側（支持体から遠い側）に設けて試料中
のアナライト（尿素）から生じたピルビン酸を酵素反応
させる前に試料に予め含まれていたピルビン酸を他の物
質に変えるようにする。このピルビン酸除去層は別異の
独立した層として設けてもよく、展開層、光遮蔽層等に
酵素反応試薬組成物を含有させて兼用させることもでき
る。別異の層として設ける場合には例えば前述の試薬層
で説明した親水性ポリマーバインダー層又は微多孔性層
を利用することができる。また、ピルビン酸除去層は１
層に限られるものではなく、酵素反応試薬組成物の各成
分を２層以上に分けて含有せしめてもよい。

一方、尿素アミドリアーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ピ
ルビン酸デヒドロゲナーゼ及び電子伝達剤と電子受容性
指示薬試薬組成物も一部は試薬層以外の層に含有させて
もよいが、その場合であっても試料中のアナライト（尿
素）から生じたアンモニアをピルビン酸に変える反応が
ピルビン酸除去層によって試料中に予め含まれていたピ
ルビン酸が除去された後に起こるように配置する必要が
ある。

本発明の一体型多層分析要素における含有量は尿素ア
ミドリアーゼが約1500〜約10万IU/m²程度、好ましくは
約7000〜約７万IU/m²程度、ピルビン酸キナーゼが約200
0〜約10万IU/m²程度、好ましくは約4000〜約６万IU/m²
程度、ピルビン酸デヒドロゲナーゼが約2000〜約10万IU
/m²程度、好ましくは約5000〜約５万IU/m²程度が適当で
ある。

他の酵素の場合も上記に準じてあるいは必要により実
験を行うことにより適当な含有量を設定することができ
る。

本発明の分析要素においては尿素アミドリアーゼ又は
ピルビン酸キナーゼの一方を、好ましくは尿素アミドリ
アーゼを、反応速度律速量とすることが好ましい。これ
はピルビン酸オキシターゼとペルオキシダーゼの量（活
性値）に対してグルタミン合成酵素又はピルビン酸キナ
ーゼの量（活性値）が前記の反応の進行する速度を支配
するような量であることを意味する。

反応速度律速量は試料が血清の場合には一般に尿素ア
ミドリアーゼは約400〜約4000IU/m²程度、そしてピルビ
ン酸キナーゼは約500〜約3000IU/m²程度である。

多層分析要素には前述の諸層のほかに必要に応じて特
開昭51-40191、特開昭53-131089等に開示の検出層また
は媒染層、特開昭54-29700等に開示のミグレーション阻
止層、特開昭51-40191等に開示の中間層、特開昭56-854
9に開示の試薬含有微粒子分散層等を組み込んで設ける
ことができる。

展開層、試薬層、検出試薬層、吸水層、検出層、接着
層等には界面活性剤、好ましくはノニオン性界面活性剤
を含有させることができる。ノニオン性界面活性剤の例
として、ｐ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノー
ル、ｐ−ノニルフェノキシポリグリシドール、ポリオキ
シエチレンオレイルエーテル、ポロオキシエチレンソル
ビタンモノラウレート、オキチルグルコシド等がある。
ノニオン性界面活性剤を試薬層、検出試薬層、吸水層又
は検出層に含有させることにより分析操作時に水性液体
試料中の水が試薬層、検出試薬層、吸水層又は検出層に
実質的に一様に吸収されやすくなり、また展開層との液
体接触が迅速かつ実質的に一様になる。ノニオン性界面
活性剤を展開層に含有させることにより水性液体試料の
展開作用（メータリング作用）がより良好になる。ノニ
オン性界面活性剤の展開層における含有量は展開層１m²
当り約10mg〜約3.0g、好ましくは約20mg〜約2.0gの範囲
である。

本発明の多層分析要素は前述の諸特許明細書に記載の
公知の方法により調製することができる。

本発明の多層分析要素は一辺約15mmから約30mmの正方
形またはほぼ同サイズの円形等の小片に裁断し、特公昭
57-28331、実公昭56-142454、特開昭57-63452、実開昭5
8-32350、特表昭58-501144等に記載のスライド枠に収め
て化学分析スライドとして用いることが、製造、包装、
輸送、保存、測定操作等諸種の観点で好ましい。使用目
的によっては長いテープ状でカセットまたはマガジンに
収めて用いること、または小片を開口のあるカードに貼
付または収めて用いることなどもできる。

本発明の多層分析要素は前述の諸特許明細書等に記載
の操作により液体試料中のアナライトの分析を実施でき
る。例えば約５μｌから約30μｌ、好ましくは８μｌか
ら15μｌ、の範囲の全血、血漿、血清、尿等に水性液体
試料滴を展開層に点着し、１分から10分の範囲で、約20
℃から約40℃の範囲の実質的に一定の温度で、好ましく
は37℃近傍の実質的に一定の温度でインクベーション
し、要素内の発色または変色を可視光又は紫外光の吸収
極大波長またはその近傍の波長の光を用いて光透過性支
持体側から反射測光し、予め作成した検量線を用いて比
色測定法の原理により液体試料中のアナライトの含有量
を求めることができる。

測定操作は特開昭60-125543、特開昭60-220862、特開
昭61-294367、特開昭58-161867、特開昭63-313063等に
記載の化学分析装置により極めて容易な操作で高精度の
定量分析を実施できる。尿素アミドリアーゼ又はピルビ
ン酸キナーゼが反応速度律速量の場合には次のようにし
て測定を実施できる。例えば約５μｌから約30μｌ、好
ましくは８μｌから15μｌ、の範囲の全血、血漿、血
清、尿等に水性液体試料滴を展開層に点着し、１分から
10分の範囲で、約20℃から約40℃の範囲の実質的に一定
の温度で、好ましくは37℃近傍の実質的に一定の温度で
インクベーションし、要素内の発色または変色を可視光
又は紫外光の吸収極大波長またはその近傍の波長の光を
用いて光透過性支持体側から反射測光し、レートアッセ
イする。これは反射光学濃度を連続的に測定して求めて
もよく、経時的に２回以上測定して求めてもよい。本発
明の分析要素における発色はまず試料に予め含まれてい
るピルビン酸に起因して起こり、次に被分析物の尿素に
基づく発色が開始される。試料中のピルビン酸による発
色は通常反応開始後30秒位で起こり、１分半ないし２分
程度まで一定の発色濃度状態が続くので反応開始後１分
から１分半位の間に反射光学濃度を測定してこれを試料
に予め含まれていたピルビン酸による発色とすることが
できる。被分析物に基づく発色は反応開始後１分半ない
し２分後にはじまり、その発色速度が被分析の濃度と相
関しているので、この発色速度を求める。この発色速度
は２回の測定で求めてもよく、３回あるいはそれ以上測
定して求めてもよい。測定時期は２回の場合には通常反
応開始後３分以降がよく、例えば３分後と５分後に測定
することができる。被分析物濃度の決定は予め求めてお
いて被分析物の濃度と発色速度との関係から算出する。
測定操作は特開昭60-125543、特開昭60-220862、特開昭
61-294367、特開昭58-161867等に記載の化学分析装置に
より極めて容易な操作で高精度の定量分析を実施でき
る。

〔作用〕

本発明の分析要素で採用されている尿素測定用の反応
試薬系は尿素を尿素アミドリアーゼがATPと反応させて
アンモニア、炭酸、ADP及び燐酸イオンに変換し、その
際生成したADPをピルビン酸キナーゼがホスホエノール
ピルビン酸と反応させてピルビン酸を生成させる。この
ピルビン酸をピルビン酸デヒドロゲナーゼがアセチル燐
酸に変えその際に電子受容性化合物が還元される。この
電子受容性化合物を電子伝達剤と電子受容性指示薬組成
物にすることによって比色定量するのである。このよう
な反応系では試料中に予め含まれているピルビン酸も検
出されて誤差の原因となる。このピルビン酸は試料中の
あるいは目的成分から生じた尿素からピルビン酸が生成
される前にピルビン酸除去用の酵素反応試薬組成物で他
の物質に変えて誤差を除くことができる。例えば、この
酵素反応試薬組成物にピルビン酸デカルボキシラーゼ
〔EC4.1.1.1〕を用いた場合にはピルビン酸オキサロ酢
酸に変えて尿素分析用の反応系で反応しないようにして
いる。

〔実施例〕

実施例１ 上記の尿素分析用試薬組成物溶液3mlに、光路長10mm
のフローセルを用いて、下記の尿素を含有する検体を10
ml添加した。光路長10mmのフローセルを用いて、37℃で
６分間インキュベーションして570nmで発色光学濃度を
透過測光したところ、下記の結果が得られた。

尿素濃度 透過光学濃度（570nm） 23mg/dl 0.28 46mg/dl 0.57 92mg/dl 1.13 115mg/dl 1.40 実施例２ 実施例１においてmPMSの替りに、Bacillus stearothe
rmophilus由来のジアホラーゼ1U/mlを添加した尿素分析
用試薬組成物水溶液に実施例１と同じ尿素含有液体を加
えて発色反応させたところ実施例１と同様の発色結果を
得た。

実施例３ ゼラチン下塗層を有する厚さ185μｍの無色透明ポリ
エチレンテレフタレート（PET）フィルタ支持体の上に
下記組成の尿素測定用検出試薬層を乾燥後の層厚が約15
μｍになるようにして塗布し乾燥した。

検出試薬層の成分被覆層（１m²当り） ゼラチン 15g ピルビン酸デヒドロゲナーゼ 15,000U チアミンピロ燐酸 225mg FAD 45mg EDTA・Na₂ 750mg MgSO₄ 900mg mPMS 400mg NTB 600mg ノニルフェノキシポリエトキシエタノール （平均10オキシエチレン単位含有） 500mg 燐酸緩衝剤 pH6.7 10g 次いで検出試薬層の上に次の組成から成る試薬層を乾
燥膜厚10μｍになるように塗布し乾燥した。

試薬層の成分被覆層（１m²当り） ゼラチン 10g 尿素アミドリアーゼ 50,000U ピルビン酸キナーゼ 40,000U ATP 1g ホスホエノールピルビン酸 800mg KHCO₃ 1.3g 燐酸緩衝液 pH6.7 500mM 10g ノニルフェノキシポリエトキシエタノール （平均10オキシエチレン単位含有）450mg 次に、試薬層をノニルフェノキシポリエトキシエタノ
ール（平均10オキシエチレン単位含有）２％含有水で全
面にわたりほぼ一様に湿らせておき、試薬層の上に展開
層としてセルロースアセチート製メンブレンフィルター
（孔径の最小値の平均3.0μｍ、空隙率約85％、厚さ140
μｍ）をラミネートして尿素分析用多層分析要素を作製
した。この分析要素を15mm×15mmの正方形チップに裁断
し、特開昭57-63452号記載のプラスチックマウントに収
め、FDC5000アナライザー（富士写真フィルム（株）
製）を用いて要素内の発色光学濃度を波長510nmの可視
光でPET支持体側から反射測光したところ、下記の結果
が得られた。尚、試料は健常者の血清を用いた。

尿素含有血清 尿素量 発色光学濃度（510nm） No.1 15mg/dl
0.353 2 32mg/dl
0.524 3 60mg/dl
0.902 4 125mg/dl
1.347 実施例４ ゼラチン下塗層を有する厚さ185μｍの無色透明PETフ
ィルム支持体の上に下記組成の尿素測定用試薬層を乾燥
後の層厚が約13μｍになるようにして塗布し乾燥した。

尿素測定用試薬組成（１m²当りの被覆量） 尿素アミドリアーゼ 50,000U/m² ピルビン酸キナーゼ 40,000U/m² KHCO₃ 1.3g/m² ホスホエノールピルビン酸 0.8g/m² ATP 3.0g/m² ピルビン酸デヒドロゲナーゼ 33,000U/m² チアミンピロ燐酸（TPP） 460mg/m² FAD 500mg/m² Mg⁺⁺（硫酸マグネシウム） 150mg/m² ジアホラーゼ 33,000U/m² NTB 750mg/m² 燐酸緩衝剤（pH7.0） 0.2mol 脱イオンゼラチン 10g/m² ノニルフェノキシポリエトキシエタノール （平均10オキシエチレン単位含有） 0.3g/m² この試薬層の上に0.2gのノニルフェノキシポリエトキ
シエタノール（平均10オキシエチレン単位含有）、8gの
二酸化チタン微粒子（ルチル型、粒子径0.25〜0.40μ
ｍ）および1gの脱イオンゼラチンの割合の水分散液を塗
布し乾燥して乾燥層厚が約５μｍの光遮蔽層を設けた。

次いで、この光遮蔽層の上に下記組成の内因性ピルビ
ン酸除去層を乾燥後の層厚が10μｍになるようにして塗
布し乾燥した。

ピルビン酸除去層用試薬組成 ピルビン酸デカルボキシラーゼ （Brewers Yeast由来） 55,000U/m² pH7.0燐酸緩衝剤 0.2mol/m² 脱イオンゼラチン 7g/m² 更にこの内因性ピルビン酸除去層の上に、2.7g/m²の
脱イオンゼラチンと135mg/m²のノニルフェノキシポリエ
トキシエタノール（平均10オキシエチレン単位含有）の
接着層を水溶液から塗布し乾燥して設けた（乾燥層厚約
２μｍ）。

一方、太さ約50D相当のPET紡績糸からなる厚さ約250
μｍの水洗脱脂済トリコット編生地で、その片面を60秒
グロー放電処理（1.6kW/m²；酸素濃度は減圧）した編物
生地を用意した。

次いで、接着層を水でほぼ均一に湿潤させ、その上に
前述のトリコット編物生地をグロー放電処理時の電極側
表面を接着層に向きあわせてかさね全体を加圧ローラー
間を通過させ接着層に均一にラミネートして編物展開層
を設けた。

ついで編物展開層の上から下記組成の編物展開層含浸
処理用水溶液を１m²当り150mlの割合で塗布し乾燥して
尿素分析用一体型多層分析要素を調製した。

織物展開層含浸処理用水溶液の組成 メチルセルロース （２％水溶液の20℃での粘度50cps） 20g オクチルフェノキシポリエトキシエタノール （オキシエチレン単位の平均縮合数30、HLB価17.4）10g 水 1000g この分析要素を15mm×15mmの正方形のチップに裁断
し、特開昭57-63452号公報に記載のプラスチックマウン
トに入れて測定を行った。検体には、健康で正常な成人
の血液をヘパリン採血して用いた。この血漿に塩化アン
モニウム及びピルビン酸カリウムを各々添加し、各々ア
ンモニア及びピルビン酸濃度を自動分析装置（日立705
0）で測定しておいた。測定は波長510nmでFDC5000アナ
ライザー（富士写真フィルム（株）製）を用いて実施例
３と同様にして行い、下記の結果を得た。

実施例５ 尿素アミドリアーゼを1000U/m²としたほかは実施例４
と同様の試薬層の上に実施例４と同じ光遮蔽層を設け、
その上に実施例４と同じ接着層及び展開層を順次積層し
た。但し、ピルビン酸除去層は設けなかった。展開層の
上から実施例４と同じ含浸処理用水溶液を塗布して尿素
分析用一体型多層分析要素を調製した。この分析要素を
実施例４と同様にして評価した。但し、点着後３分と５
分の反射光学濃度値の差を波長600nmで測定したとこ
ろ、下記の結果が得られた。

検体 尿素濃度 光学濃度値の差（５分値−３分
値） 31mg/dl 0.046
62 0.081
92 0.132
121 0.177
〔発明の効果〕 本発明の尿素分析用試薬組成物は安定性が高く、この
試薬組成物を一体型多層分析要素に組込むことにより尿
素を簡便な操作で高精度で定量分析することができる。

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】尿素アミドリアーゼ、ピルビン酸キナー
   ゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、及び電子受容性指示
   薬組成物を含む尿素分析用試薬組成物。
2. 【請求項２】光透過性水不透過性支持体の上に少なくと
   も１層の試薬層及び展開層がこの順に積層されている一
   体型多層分析要素であって、前記試薬層に尿素アミドリ
   アーゼ、ピルピン酸キナーゼ、ピルリン酸デヒドロゲナ
   ーゼ、及び電子受容性指示薬組成物を含む尿素測定試薬
   組成物が含有されていることを特徴とする尿素分析用一
   体型多層分析要素。