WO2006080329A1

WO2006080329A1 - 多層分析要素

Info

Publication number: WO2006080329A1
Application number: PCT/JP2006/301101
Authority: WO
Inventors: Kentaro Nakamura
Original assignee: Fujifilm Corporation
Priority date: 2005-01-26
Filing date: 2006-01-25
Publication date: 2006-08-03
Also published as: JP4819789B2; JPWO2006080329A1

Abstract

　本発明の目的は、ロット間差及びロット内差が小さく、測定精度が高く、小型化が可能な多層分析要素を提供することである。本発明によれば、水不透過性平面支持体の片面上に、少なくとも１つの機能層と少なくとも１つの非繊維性多孔膜からなる多孔性液体試料展開層がこの順に積層一体化された液体試料分析用多層分析要素において、デヒドロゲナーゼ（脱水素酵素）をアナライトまたは共役酵素とし、酸化型補酵素、ジアホラーゼ及びホルマザン色素形成テトラゾリウム塩を該機能層、該多孔性液体試料展開層またはその両方に含み、かつ該非繊維性多孔膜がセルロースアシレートであることを特徴とする液体試料分析用多層分析要素が提供される。

Description

多層分析要素

技術分野

[0001] 本発明は、臨床検査、食品検査、環境分析等に用いられる多層分析要素に関する背景技術

[0002] 臨床検査、食品検査及び環境分析の分野では、迅速'簡便に検体を処理する要求が年々高くなつており、そのニース Ίこ応えた乾式分析素子が汎用されている。乾式分析要素の中で、血液の受容、展開、拡散を行わせる展開層には、特開昭 55— 16 4356号公報、特開昭 57— 66359号公報、特開昭 60— 222769号公報等に代表されるように、繊維質多孔性材料が用いられてきた。

[0003] この繊維質多孔性材料は、液体試料点着時の展開が速く、製造時の取り扱!/、性にも優れている。また、全血のような粘性のある試料に対しても適用性があり、広く使用されている。

[0004] しかし、この分野では、より高、精度 (再現性)での測定が要求されるようになってきており、繊維質多孔性材料 (布展開層）では、いくつか不具合がでてきている。その一つ力布自身のロット変動の問題である。通常、布展開層には、織物と編物がある力その織り方、編み方にロット間差及びロット内差が見つ力ている。具体的には、単位面積当たりの編目数、単位面積当たりの重量、厚みなどである。また、中間工程で、材料の洗浄工程があるが、その洗浄の程度により、布の親水性にロット間差、ロット内差がある。さらに、布展開層は、平滑ではないため、積層方式で、十分な接着力を確保して製造しょうとすると、下層に展開層を食い込ませざるをえない。これにより下層は乱れており、より高い精度での測定に対しては、好ましくない。さらに、布展開層は布自身及び下層のくい込み等の影響によって液体試料の下層への移行量を増カロさせることが難しぐ高感度化できにくいという問題もある。また布は下層に布を接着する際に、その構造上伸びやすぐ空隙体積の変化を起こしやすい。そのために液体試料点着時の展開面積が変化しやすぐロット内差及び高精度測定が達成できない原因となっている。また近年、より少ない試料で測定することが望まれているが、布展開層では、試料液量を少なくしていくと、編目の影響による反射光量のバラツキが顕著になり、高精度の測定ができなくなる。

[0005] 上述したような布展開層の欠点を解決する手段として、特公昭 53— 21677号公報、特公平 1— 33782号公報等に示されるような非繊維質多孔性膜を展開層に用いた乾式分析素子が検討されている。ここで言う非繊維質多孔性膜は、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、酢酸セルロースなどの有機高分子の製膜原液を作製し、これを支持体上に、塗布、流延し、乾燥を行うことで製膜して作製したものである。ここでは、写真フィルムで培われた塗布技術が応用されており、その製膜精度は、 5〜10% 程度であり、ロット間差、ロット内差なども十分に小さい。また、これら非繊維質多孔性膜は、布展開層に比べ、平滑で、かつ、比表面積が大きいことから、下層への食い込みは少ない状態で、下層と所望の強さでの接着が可能である。さらに、布展開層に代表される編目はなぐ白色度も高いため、分析素子の面積を小さくしても、反射光量のバラツキは安定しており、高精度の測光が可能である。

[0006] このような非繊維質多孔性膜を展開層に用いた分析素子にぉ、て、デヒドロゲナーゼ (脱水素酵素）をアナライトまたは共役酵素とし、酸化型補酵素、ジァホラーゼ及びホルマザン色素形成テトラゾリゥム塩を含む系（例えば、 LDH、 CPK、又は CKMBを分析する系）では展開層に用いる非繊維質多孔性膜の素材により、特開昭 62— 20 5798号公報、特開昭 63— 32499号公報、特開平 11— 196号公報等に示された従来の布展開層に比べ検出感度が大きく変化すること、また検出感度の変化に伴い測定精度にも影響を及ぼすこと場合があることが分力てきた。

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0007] 本発明は、ロット間差及びロット内差が小さぐ測定精度が高ぐ小型化が可能な多層分析要素を提供することを解決すべき課題とした。本発明はさらに、デヒドロゲナーゼ (脱水素酵素）をアナライトまたは共役酵素とし、酸化型補酵素、ジァホラーゼ及びホルマザン色素形成テトラゾリゥム塩を含む系にお、て測定精度の向上を達成できる多層分析要素を提供することを解決すべき課題とした。課題を解決するための手段

[0008] 本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、デヒドロゲナーゼ (脱水素酵素）をアナライトまたは共役酵素とし、酸化型補酵素、ジァホラーゼ及びホルマザン色素形成テトラゾリゥム塩を含む液体試料分析用多層分析要素において、多孔性液体試料展開層を構成する非繊維性多孔膜としてセルロースァシレートを使用すること〖こよって、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに到った。

[0009] 即ち、本発明によれば、水不透過性平面支持体の片面上に、少なくとも 1つの機能層と少なくとも 1つの非繊維性多孔膜からなる多孔性液体試料展開層がこの順に積層一体化された液体試料分析用多層分析要素において、デヒドロゲナーゼ (脱水素酵素）をアナライトまたは共役酵素とし、酸化型補酵素、ジァホラーゼ及びホルマザン色素形成テトラゾリゥム塩を該機能層、該多孔性液体試料展開層またはその両方に含み、かつ該非繊維性多孔膜がセルロースァシレートであることを特徴とする液体試料分析用多層分析要素が提供される。

[0010] 好ましくは、酸化型補酵素は NAD +または NADP +である。

好ましくは、ホルマザン色素形成テトラゾリゥム塩は-トロテトラゾリゥムブルーである好ましくは、セルロースァシレートはセルロースアセテート、セルロースアセテートの酸化物、セルロースアセテートブチレート、セルロースアセテートブチレートの鹼化物、またはこれらの混合物である。

さらに好ましくは、セルロースァシレートはセルロースアセテート、セルロースァセテートの酸化物、またはこれらの混合物である。

発明を実施するための最良の形態

[0011] 以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。

本発明の液体試料分析用多層分析要素は、水不透過性平面支持体の片面上に、少なくとも 1つの機能層と少なくとも 1つの非繊維性多孔膜からなる多孔性液体試料展開層がこの順に積層一体化された液体試料分析用多層分析要素において、デヒドロゲナーゼ (脱水素酵素）をアナライトまたは共役酵素とし、酸化型補酵素、ジァホラーゼ及びホルマザン色素形成テトラゾリゥム塩を該機能層、該多孔性液体試料展開層またはその両方に含み、かつ該非繊維性多孔膜がセルロースァシレートであることを特徴とする。

[0012] 本発明によれば、セルロースァシレートの非繊維性多孔膜を展開層として用いることで、デヒドロゲナーゼ (脱水素酵素)をアナライトまたは共役酵素とし、酸化型補酵素、ジァホラーゼ及びホルマザン色素形成テトラゾリゥム塩を含む液体試料分析用多層分析要素において、ロット間差及びロット内差が小さぐ測定精度が高ぐ小型化可能となる。

[0013] 本発明の液体試料分析用多層分析要素の構成例としては、（1)支持体上に、ほたは複数の機能層が設けられ、さらに該機能層の上に非繊維性多孔膜が設けられている液体試料分析用多層分析要素、並びに、（2)支持体上に、ほたは複数の機能層が設けられ、さらに該機能層の上に、試料分析用の試薬を含有する非繊維性多孔膜が設けられている液体試料分析用多層分析要素、が挙げられる。即ち、本発明における非繊維性多孔膜は、試料分析用の試薬を含んでいてもよいし、含んでいなくてちょい。

[0014] 多孔性液体試料展開層は、 1層だけに限定する必要はなぐ 2層以上の非繊維性多孔膜を部分的に配置された接着剤により接着された積層物を用いることができる。また、少なくとも 1つの非繊維性多孔膜からなる多孔性液体試料展開層は特開昭 57 — 66359に開示の物理的活性ィ匕処理、好ましくはグロ一放電処理またはコロナ放電処理を非繊維性多孔膜の少なくとも片面に施す力、あるいは特開昭 55— 164356、特開昭 57— 66359等に開示の界面活性剤含浸処理、好ましくはノ-オン性界面活性剤含浸処理、または親水性ポリマー含浸処理などの親水化処理、またはこれらの処理工程の二つ以上の組合わせを逐次実施することにより非繊維性多孔膜を親水化し、下側 (支持体に近い側)の機能層との接着力の強化、または展開面積のコントロールをすることができる。更に、目的とする検出反応を行うための試薬、該検出反応を促進するための試薬、あるいは干渉'妨害反応を低減又は阻止するための各種試薬、もしくはこれらの試薬の一部を含ませることができる。

[0015] 本発明においては、上記非繊維性多孔膜として、セルロースァシレートを用いる。

好ましくはセノレロースアセテート、セノレロースアセテートの酸ィ匕物、セノレロースァセテ一トブチレート、セルロースアセテートブチレートの鹼化物またはこれらの混合物を用いることができ、更に好ましくはセルロースアセテート、セルロースアセテートの鹼化物またはこれらの混合物を用いることができる。

[0016] 例えば、セルロースアセテートの多孔膜としては、ミクロフィルター FM500 (富士写真フィルム (株)製)がある。

[0017] セルロースァシレートから成る非繊維性多孔膜の平均孔径は特に限定されないが、一般的に ίま 0. 3 μ m〜50 μ mであり、好ましく ίま 0. 5 μ m〜20 μ mであり、より好ましくは 1 μ m〜10 μ mであり、特に好ましくは 1 μ m〜7 μ mである。

セルロースァシレートからなる非繊維性多孔膜の厚さ、空隙率、透水速度などは特に限定されない力厚さについては 50〜500 m、好ましくは 50〜350 m、更に好ましくは 80〜200 μ mであることが望まし!/、。空隙率につ!、ては好ましくは 50〜95 %、更に好ましくは 60〜90%が望ましい。また透水速度については 25°Cで lKgZc m²の圧力で水を透過させたときの透水量が好ましくは非繊維性多孔膜 lcm²当たり 1 分間に l〜5000ml、更に好ましくは 5〜2000mlであることが望ましい。

[0018] また、試薬含有非繊維性多孔膜は、試薬を含有して!/ヽる膜を指すが、予め多孔膜を試薬溶液に浸漬後、乾燥させることにより試薬含有膜を作製できる。また、別法として多孔膜上に試薬溶液を塗布後乾燥させることにより試薬含有非繊維性多孔膜を作製できるが、特に手段は、限定しない。

[0019] さらに、本発明の液体試料分析用多層分析要素は、デヒドロゲナーゼ (脱水素酵素 )をアナライトまたは共役酵素とし、上記の非繊維性多孔膜またはこれと液体接触関係にある少なくとも 1つの機能層またはその両方に、酸化型補酵素、ジァホラーゼ及びホルマザン色素形成テトラゾリゥム塩などの試薬を含む。

[0020] 本発明の多層分析要素が対象とする被検物質は特に限定されず、任意の液体試料 (例えば、全血、血漿、血清、リンパ液、尿、唾液、髄液、膣液などの体液中の特定成分を分析することができる。例えば、クレアチンフォスフォキナーゼ (CPK)、乳酸脱水素酵素（LDH)、クレアチンキナーゼ MBアイソザィム（CKMB)などを分析することがでさる。

[0021] (1)クレアチンフォスフォキナーゼ（CPK)の分析血中のクレアチンフォスフォキナーゼ (CPK)活性値は、心筋梗塞、進行性筋ジスト口フィーやその他の筋肉疾患、並びに内分泌疾患などの臨床診断上の重要な指標として近年利用されている。 CPKは、 ATP +クレアチン→ADP +クレアチン酸の可逆反応を触媒する。本発明の液体試料分析用多層分析要素においては、上記反応の逆反応を用い、さらに呈色色素を生成させる酵素系を導入した NADH比色法を使用している。 CPK測定用の分析要素で使用する試薬の具体例としては、特開昭 6 3— 32499号公報に記載されて、るものを使用することができる。

[0022] 即ち、本発明の液体試料分析用多層分析要素を用いて CPKの分析を行う場合には、分析要素中には、クレアチンリン酸 2ナトリウム、ニトロテトラゾリゥムブルー、 ADP 、グルコース 6—リン酸脱水素酵素、グルコース、 NAD+、へキソキナーゼ、及びジァホラーゼが含まれる。上記した成分を含む多層分析要素に検体を点着すると、以下の反応により、ホルマザン色素が生成する。即ち、検体中の CPKは、分析要素中のクレアチンリン酸と ADPとの反応を触媒する。反応の開始と共に ATPは、共存するへキソキナーゼ、グルコースー6—リン酸脱水素酵素、ジァホラーゼなどの酵素の働きで-トロテトラゾリゥムブルーを還元し、ホルマザン色素が生成する。生成した色素による吸光度の増加を測定することにより生成速度が算出され、 CPK活性値を求めることがでさる。

[0023] [化 1] クレアチンリン酸 +ADP _{h n} . クレアチン +ΑΤΡ

Mg⁺⁺ · NAC

へ：、ノ. +—ゼ

ATP+グルコース Mg₊₊ ADP十グルコ一ス -6-リン酸グルコース一 ₆—リン酸 +_NAD十 _^ £0_ 6 -フォスフォグルコン酸 +NADH+H +

NTB+NADH 'ノアフ—ゼヅホルマザン色素 +NAD +

[0024] (2)乳酸脱水素酵素 (LDH)の分析

血清中の乳酸脱水素酵素 (LDH)活性の上昇は、心 '腎*肝などの各種疾患、白血病、悪性貧血などに見られる。本発明の液体試料分析用多層分析要素においては、乳酸を基質として用い、テトラゾリゥム塩を発色試薬とした NADH比色法を使用している。 LDH測定用の分析要素で使用する試薬の具体例としては、特開昭 62— 205 798号公報に記載されているものを使用することができる。

[0025] 即ち、本発明の液体試料分析用多層分析要素を用いて LDHの分析を行う場合には、分析要素中には、乳酸リチウム、ニトロテトラゾリゥムブルー、 NAD+、ジァホラーゼ、及びァスコルビン酸ォキシダーゼが含まれる。上記した成分を含む多層分析要素に検体を点着すると、以下の反応により、ホルマザン色素が生成する。即ち、検体中の LDHは、基質である乳酸塩と補酵素酸化型ニコチン酸アミドジヌクレオチド (N AD+)との反応を触媒する。生成した還元型補酵素 (NADH)は、ジァホラーゼの触媒作用により-トロテトラゾリゥムブルーを還元し、ホルマザン色素が生成する。生成した色素による吸光度の増加を測定することにより生成速度が算出され、 LDH活性値を求めることができる。

[0026] [化 2] 乳酸塩十 NAD + ―—— - ピルピン酸 +NADH

画十 NADH ノア、 —ゼ> ホルマザン色素十 NAD+

[0027] (3)クレアチンキナーゼ MBアイソザィム（CKMB)の分析

クレアチンフォスフォキナーゼ（CPK)のァイソザィムの一つである CKMBは、その含有比率と含有量が心筋に著しく高いことが知られている。心筋に傷害が起こると血中 CKMB活性が上昇するため、 CKMBの測定が心筋梗塞に特異性の高い検出法として重要視されている。本発明の液体試料分析用多層分析要素においては、 CK M活性を阻害する抗体を用いた免疫阻害法を用い、さらに呈色色素を生成させる酵素系を導入した NADH比色法を使用してヽる。 CKMB測定用の分析要素で使用する試薬の具体例としては、特開平 11— 196号公報に記載されているものを使用することがでさる。

[0028] 即ち、本発明の液体試料分析用多層分析要素を用いて CKMBの分析を行う場合には、分析要素中には、抗ヒト CK— Mヒッジ抗体、クレアチンリン酸 2ナトリウム、 -トロテトラゾリゥムブルー、 1, 5 ジ（アデノシン一 5，） 5リン酸、 NAC、 AMP、ァスコルビン酸ォキシダーゼ、 ADP、グルコースー6—リン酸脱水素酵素、グルコース、 NAD +、へキソキナーゼ、及びジァホラーゼが含まれる。上記した成分を含む多層分析要素に検体を点着すると、以下の反応により、ホルマザン色素が生成する。即ち、検体中の CK M活性は、抗 CK M抗体により阻害され、阻害作用を受けない CK B サブユニットは N ァセチルシスティン (NAC)により活性化され、クレアチンリン酸と ADPからクレアチンと ATPを生成する反応を触媒する。この反応で生成した ATPはへキソキナーゼ（HK)の触媒作用でグルコースと反応し、グルコース— 6—リン酸と A DPに変化する。さらに、グルコース 6—リン酸は、グルコース 6—リン酸脱水素酵素（G6PDH)の作用で酸ィ匕され、同時にニコチン酸アミドアデニンジヌクレオチド (N ADH)が生成する。最終的には、 NADHはジァホラーゼ (DI)の作用で-トロテトラゾリゥムブルー（NTB)を還元し、ホルマザン色素が生成する。生成した色素による吸光度の増加を測定することにより生成速度が算出され、 CKMB活性値を求めることができる。

[0029] [化 3]

C MM , CKMB 抗 CK-赚体 ^ CK-B クレアチンリン酸 +ADP 9!±Ξ ^クレアチン +ΑΤΡ

MAC；、 Mg^{2 +}

ATP十グルコース _へキ -ゼ ~~► ADP十グルコース- 6-リン酸グルコース 6-リン酸十 NAD^{+ G6PDH} ^ 6-フォスフォグルコン酸 +NADH+H+ NTB+NADH 7r^-^_ ^ジホルマザン色素 +NAD+

[0030] 機能層の具体例としては、展開層と機能層を接着する接着層、液状試薬を吸水する吸水層、化学反応により生成した色素の拡散を防止する媒染層、ガスを選択的に透過させるガス透過層、層間での物質移動を抑制 '促進させる中間層、内因性物質を除去する除去層、反射測光を安定に行うための光遮蔽層、内因性色素の影響を抑制する色遮蔽層、血球と血漿を分離する分離層、分析対象物と反応する試薬を含む試薬層、発色剤を含む発色層などが挙げられる。

[0031] 本発明の一例としては、例えば、支持体の上には、場合によっては下塗層等の他の層を介して、機能層として親水性ポリマー層を設けることができる。親水性ポリマー層としては、例えば、無孔性、吸水性かつ水浸透性の層であり、基本的に親水性ポリマーのみなる吸水層、親水性ポリマーをバインダーとし発色反応に直接関与する発色試薬の一部又は全部を含む試薬層、及び親水性ポリマー中に発色色素を固定し不動にする成分 (例:媒染剤)を含有する検出層などを設けることができる。

[0032] 試薬層は水性液体中の被検成分と反応して光学的に検出可能な変化を生じる試薬組成物の少なくとも一部が親水性ポリマーバインダー中に実質的に一様に分散されている吸水性で水浸透性の層である。この試薬層には指示薬層、発色層なども含まれる。

[0033] 試薬層のバインダーとして用いることができる親水性ポリマーは、一般には水吸収時の膨潤率が 30°Cで約 150%力も約 2000%、好ましくは約 250%力も約 1500% の範囲の天然または合成親水性ポリマーである。そのような親水性ポリマーの例としては、特開昭 60— 108753号公報等に開示されているゼラチン (例、酸処理ゼラチン、脱イオンゼラチン等）、ゼラチン誘導体 (例、フタルイ匕ゼラチン、ヒドロキシアタリレートグラフトゼラチン等）、ァガロース、プルラン、プルラン誘導体、ポリアクリルアミド、ポリビュルアルコール、ポリビュルピロリドン等をあげることができる。

[0034] 試薬層は架橋剤を用いて適宜に架橋硬化された層とすることができる。架橋剤の例として、ゼラチンに対する 1, 2—ビス（ビニルスルホ-ルァセトアミド）ェタン、ビス（ビュルスルホ -ルメチル）エーテル等の公知のビュルスルホン系架橋剤、アルデヒド等、メタリルアルコールコポリマーに対するアルデヒド、 2個のグリシジル基含有ェポキシ化合物等がある。

[0035] 試薬層の乾燥時の厚さは約 1 μ m力ら約 100 μ mの範囲であることが好ましぐより好ましくは約 3 μ m力も約 50 μ mの範囲である。また試薬層は実質的に透明であることが好ましい。

[0036] 本発明の多層分析要素の試薬層やその他の層に含める試薬としては、被験物質に応じてその検出に適した試薬を選択することができる。

[0037] 本発明の液体試料分析用多層分析要素における水不透過性平面支持体としては、従来公知の分析要素に用いられて、る水不透過性の支持体を用いることができる。水不透過性支持体の例としては、ポリエチレンテレフタレート、ビスフエノール Aのポリカルボネート、ポリスチレン、セルロースエステル（例、セルロースジアセテート、セルローストリアセテート、セルロースアセテートプロピオネート等）等のポリマー力なる厚さ約 50 μ mから約 lmm、好ましくは約 80 μ m力ら約 300 μ mの範囲のフィルムもしくはシート状の支持体を挙げることができる。

[0038] 支持体の表面には必要により下塗層を設けて、支持体の上に設けられる機能層と支持体との接着を強固なものにすることができる。また、下塗層の代りに、支持体の表面を物理的あるいは化学的な活性ィ匕処理を施して接着力の向上を図ってもよい。非繊維性多孔膜からなる多孔性液体試料展開層を試薬層、吸水層または接着層等の機能層にラミネートするには特開昭 55— 164356、特開昭 57— 66359等に開示の方法に従うことができる。すなわち試薬層、吸水層または接着層等の機能層が塗布後未乾燥のうちに、または乾燥後の機能層に水、界面活性剤を含む水溶液、界面活性剤と親水性ポリマーを含む水溶液、有機溶媒または有機溶媒を含有する水溶液等をワイヤーバー塗布装置及びダイを用ヽた塗布装置等で実質的に均一に供給し、機能層を膨潤または溶解させ、ついで非繊維性多孔膜からなる多孔性液体試料展開層を膨潤または溶解している機能層の上に実質的に均一に軽く圧力をかけながらラミネートし、一体化する。機能層の膨潤または溶解に際しては、赤外線ヒータ一等の幅射熱の照射による加温、支持体にヒーターを接触させ加温する方法等を用いることがでさる。

[0039] 本発明の多層分析要素は、公知の方法により調製することができる。溶血試薬は塗布または含浸される試薬水溶液に予め加えておけばよい。他の方法としては、単独又は界面活性剤 ·展開面積制御のための親水性ポリマーなどを含む水溶液、有機溶媒 (エタノール、メタノールなど)溶液又は水一有機溶媒混合液溶液を展開層の上から塗布して含浸させることもできる。これを用いた被験物質の分析も公知の方法に従つて行なうことができる。

[0040] 例えば、本発明の多層分析要素は、一辺約 5mmから約 30mmの正方形またはほぼ同サイズの円形等の小片に裁断し、特公昭 57— 283331号公報 (対応米国特許 4, 169, 751)、実開昭 56— 142454号公報（対応米国特許 4, 387, 990)、特開昭 57— 63452号公報、実開昭 58— 32350号公報、特表昭 58— 501144号公報（対応国際公: WO083Z00391)等に記載のスライド枠に収めて化学分析スライドとして用いることができ、これは製造，包装，輸送，保存，測定操作等の観点で好ましい。使用目的によっては、長いテープ状でカセットまたはマガジンに収めて用いたり、又は小片を開口のある容器内に収めて用いたり、又は小片を開口カードに貼付または収めて用いたり、あるいは裁断した小片をそのまま用いることなどもできる。

[0041] 本発明の多層分析要素は、例えば約 2 μ L〜約 30 μ L、好ましくは 4 μ L〜15 μ L の範囲の水性液体試料液を、粒状構造物展開層に点着する。点着した多層分析要素を約 20°C〜約 45°Cの範囲の一定温度で、好ましくは約 30°C〜約 40°Cの範囲内の一定温度で 1〜10分間インキュベーションする。多層分析要素内の発色又は変色を支持体側力反射測光し、予め作成した検量線を用いて比色測定法の原理により検体中の被験物質の量を求めることができる。

[0042] 測定操作は特開昭 60— 125543号公報、特開昭 60— 220862号公報、特開昭 6 1— 294367号公報、特開昭 58— 161867号公報（対応米国特許 4, 424, 191)などに記載の化学分析装置により極めて容易な操作で高精度の定量分析を実施できる。なお、目的や必要精度によっては目視により発色の度合いを判定して、半定量的な測定を行ってもよい。

[0043] 本発明の多層分析要素は、分析を行うまでは乾燥状態で貯蔵'保管されるため、試薬を用時調製する必要がなぐまた一般に乾燥状態の方が試薬の安定性が高いことから、試薬溶液を用時調製しなければならないいわゆる湿式法より簡便性、迅速性に優れている。また、微量の液体試料で、精度の高い検査を迅速に行うことができる検査方法としても優れてヽる。

以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明する力本発明は実施例によつて限定されるものではない。

実施例

[0044] 実施例 1：各種展開層素材を用いた LDH分析用多層分析要素の感度及び精度比較

(1)平均孔径 5 mのセルロースアセテート膜を展開層に用いた LDH分析用多層分析要素の作製方法

ゼラチン下塗りされている 180 μ mのポリエチレンテレフタレート無色透明平滑フィルムに下記組成の水溶液 (pH = 6. 4)を、下記の被覆量になるように塗布、乾燥し発色層とした。

[0045] ゼラチン 19.9gZm²

ニトロテトラゾリゥムブルー 0.8g/m²

ポリオキシ（2—ヒドロキシ）プロピレンノユルフェ-ルエーテル 0.4gZm²

1, 2—ビス（ビュルスルホ-ルァセトアミド）ェタン 0.2gZm²

[0046] 次に上記試薬層上に約 30gZm²の供給量で水を全面に供給して湿潤させた後、平均孔径 5 μ mのセルロースアセテート膜 (FM-500 :富士写真フィルム社製）を軽く圧力をカゝけて積層し、乾燥させて、接着させた。

[0047] 上記 FM-500膜上に、下記組成の水溶液 (pH = 8. 0)を下記の被覆量になるように塗布、乾燥させ、平均孔径 5 mのセルロースアセテート膜を展開層に用いた LD H分析用多層分析要素を作製した。

[0048] ポリアクリルアミド 2.9gZm²

ポリエチレングリコール（10)ォクチルフエ-ルエーテル 0.9gZm²

ポリエチレングリコール（40)ォクチルフエ-ルエーテル 0.4gZm²

トリス（ヒドロキシメチル）ァミノメタン 2.5gZm²

L—グルタミン酸 1.4gZm²

乳酸リチウム l.lgZm²

ジァホラーゼ 0.75 KU/m²

グルタミン酸ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ (GPT) 1.83 KU/m²

ァスコルビン酸ォキシダーゼ 16.2 KU/m²

ニコチンアミドアデニンヌクレオチド酸化型 (NAD") 0.24g/m²

[0049] 上記の多層分析要素を 12mm X 13mm四方のチップに裁断し、スライド枠 (特開昭 57— 63452号公報に記載）に収めて、 LDH分析用スライド 1を作製した。

[0050] (2)平均孔径 1. 2 mのセルロースアセテート膜を展開層に用いた LDH分析用多層分析要素の作製方法

展開層に平均孔径 1. 2 μ mのセルロースアセテート膜 (FM-120)を用いる以外は、（1)平均孔径 5 mのセルロースアセテート膜を展開層に用いた LDH分析用多層分析要素の作製方法と同様に作製し、 LDH分析用スライド 2を作製した。 [0051] (3)編物布地を展開層に用いた LDH分析用多層分析要素の作製方法展開層に 50デニール相当のポリエチレンテレフタレート紡績糸を 36ゲージ編みしたトリコット編物布地（以下編物布地とする）を用いる以外は、（1)平均孔径 5 μ mのセルロースアセテート膜を展開層に用いた LDH分析用多層分析要素の作製方法と同様に作製し、 LDH分析用スライド 3を作製した。

[0052] (4)感度及び測定精度比較

上記 LDH分析用スライド 1、 2、 3に水及び LDH活性が 946U/Lである管理血清を各々 10 L点着した。この後、各スライドを 37°Cでインキュベーションし、支持体側から 540nmの反射光学濃度を測定し、点着後 1から 2分後の反射光学濃度の変化量を求め、感度（946UZLである管理血清を点着した時の反射光学濃度の変化量と水を点着した時の反射光学濃度の変化量の差 (ddODr (946UZL— 0U/L) ) ) を比較した。また、 LDH活性力 70U/Lの管理血清を 10 Lで 100回点着した時の精度 (変動係数％< CV>)を比較した。表 1に感度比較結果、表 2に精度比較結果を示す。

[0053] [表 1]

表 1 ：各種展開層素材を用いた L D H分析用多層分析要素の感度比較

[0054] [表 2]

表 2 ：各種展開層素材を用いた L D H分析用多層分析要素の精度（C V (%) ) 比較

[0055] セルロースアセテート膜を展開層に用いた LDH分析用多層分析要素 1、 2は編物布地を展開層に用いた LDH分析用多層分析要素 3に対し、感度が向上する。さらに測定精度の向上も達成された。

[0056] 実施例 2：各種展開層素材を用いた CPK分析用多層分析要素の感度及び精度比較 (1)平均孔径 5 /z mのセルロースアセテート膜を展開層に用いた CPK分析用多層分析要素の作製方法

[0057] ゼラチン 19.9gZm²

ニトロテトラゾリゥムブルー 0.8g/m²

1, 2—ビス（ビュルスルホ-ルァセトアミド）ェタン 0.2g/m²

[0058] 次に上記試薬層上に約 30gZm²の供給量で水を全面に供給して湿潤させた後、平均孔径 5 μ mのセルロースアセテート膜 (FM-500 :富士写真フィルム社製）を軽く圧力をカゝけて積層し、乾燥させて、接着させた。

[0059] 上記 FM-500膜上に、下記組成の水溶液 (pH = 6. 5)を下記の被覆量になるように塗布、乾燥させ、平均孔径 5 /z mのセルロースアセテート膜を展開層に用いた CP K分析用多層分析要素を作製した。

[0060] ポリアクリルアミド 3.2gZm²

ポリエチレングリコール（10)ォクチルフエ-ルエーテル 0.6gZm²

ポリエチレングリコール（40)ォクチルフエ-ルエーテル 0.3gZm²

イミダゾール 1.8gZm

グノレコース 0.6g/m²

N-ァセチル- L-システィン 0.2gZm²

エチレンジァミン 4酢酸 · 2ナトリウム塩 0.5gZm²

（アデノシン-⁵し）ペンタホスフェート 0.0²g/m²

ニコチンアミドアデニンヌクレオチド酸化型 (NAD") 0.6g/m²

クレアチンリン酸 · 2ナトリウム塩 1.8gZm²

アデノシン- 5'-モノホスフェート · 1ナトリウム塩 1.2gZm²

アデノシン- 5'-ジホスフェート · 1カリウム塩 0.7g/m²

スクロース 6.8g/m² 塩ィ匕マグネシウム

ジァホラーゼ 1.1 KU/m

グルコース- 6-リン酸デヒドロゲナーゼ 4.0 KU/m^:

へキソキナーゼ 2.8 KU/m²

ァスコルビン酸ォキシダーゼ 4.8 KU/m²

[0061] 上記の多層分析要素を 12mm X 13mm四方のチップに裁断し、スライド枠 (特開昭 57— 63452号公報に記載）に収めて、 CPK分析用スライド 1を作製した。

[0062] (2)編物布地を展開層に用いた CPK分析用多層分析要素の作製方法

展開層に 50デニール相当のポリエチレンテレフタレート紡績糸を 36ゲージ編みしたトリコット編物布地（以下編物布地とする）を用いる以外は、（1)平均孔径 5 μ mのセルロースアセテート膜を展開層に用いた CPK分析用多層分析要素の作製方法と同様に作製し、 CPK分析用スライド 2を作製した。

[0063] (3)感度及び測定精度比較

上記 CPK分析用スライド 1、 2に水及び CPK活性が 1095U/Lである管理血清を各々 10 L点着した。この後、各スライドを 37°Cでインキュベーションし、支持体側から 540nmの反射光学濃度を測定し、点着後 2. 5から 4分後の反射光学濃度の変化量を求め、感度（1095UZLである管理血清を点着した時の反射光学濃度の変化量と水を点着した時の反射光学濃度の変化量の差 (ddODr (1095U/L 0U/L) ；) )を比較した。また、 LDH活性が 1095UZLの管理血清を 10 /z Lで 20回点着した時の精度 (変動係数％< CV>)を比較した。表 3に感度比較結果、表 4に精度比較結果を示す。

[0064] [表 3]

表 3 ：各種展開層素材を用いた C P K分析用多層分析要素の感度比較

[0065] [表 4] 表 4 ：各種展開層素材を用いた C P K分析用多層分析要素の精度（C V (%) ) 比較

[0066] セルロースアセテート膜を展開層に用いた CPK分析用多層分析要素 1は編物布地を展開層に用いた CPK分析用多層分析要素 2に対し、感度が向上する。さらに測定精度の向上も達成された。

産業上の利用可能性

[0067] 本発明によれば、デヒドロゲナーゼ (脱水素酵素）をアナライトまたは共役酵素とし、酸化型補酵素、ジァホラーゼ及びホルマザン色素形成テトラゾリゥム塩を含む系において、ロット間差及びロット内差が小さぐ測定精度が高ぐ小型化が可能な多層分析要素のための展開層を提供することができる。

Claims

請求の範囲

[1] 水不透過性平面支持体の片面上に、少なくとも 1つの機能層と少なくとも 1つの非繊維性多孔膜からなる多孔性液体試料展開層がこの順に積層一体化された液体試料分析用多層分析要素において、デヒドロゲナーゼ (脱水素酵素）をアナライトまたは共役酵素とし、酸化型補酵素、ジァホラーゼ及びホルマザン色素形成テトラゾリゥム塩を該機能層、該多孔性液体試料展開層またはその両方に含み、かつ該非繊維性多孔膜がセルロースァシレートであることを特徴とする液体試料分析用多層分析要素。

[2] 酸ィ匕型補酵素が NAD +または NADP +である、請求項 1に記載の液体試料分析用多層分析要素。

[3] ホルマザン色素形成テトラゾリゥム塩が-トロテトラゾリゥムブルーである、請求項 1または 2に記載の液体試料分析用多層分析要素。

[4] セノレロースァシレートがセノレロースアセテート、セノレロースアセテートの酸ィヒ物、セノレロースアセテートブチレート、セルロースアセテートブチレートの鹼化物、またはこれらの混合物である請求項 1から 3の何れか〖こ記載の液体試料分析用多層分析要素。

[5] セノレロースァシレートがセノレロースアセテート、セノレロースアセテートの酸ィ匕物、またはこれらの混合物である、請求項 1から 3の何れかに記載の液体試料分析用多層分析要素。