JPH03103198A - 尿素分析用試薬組成物及びそれを含む一体型多層分析要素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は尿素窒素（ＢＵＮ）を測定するための試薬系を
含む、特に臨床検査に有用な一体型多層分析要素に関す
るものである。

〔従来の技術〕

蛋白質代謝の中間体及び最終生戒物である尿素窒素（Ｂ
ＵＮ）の測定は腎疾患の診断、治療経過の判断等のため
に必要である。従来、これらは湿式法で分析され、例え
ば尿素窒素は強酸性条件下でテレフタルアルデヒド及び
フェニレンジアミン誘導体を直接反応させて発色を比色
定量する方法（Ｄ．　Ｊ．　Ｊｕｎｇ，　ＣＩｉｎ．　
Ｃｈｅｍ．＋ｆｉ＋　１１３６　（１９７５）　）、尿
素にウレアーゼを作用させて生或したアンモニウムイオ
ンをネスラー試薬を用いるかあるいはインドフェノール
法で比色定量する方法で定量されていた。インドフェノ
ール法はその後多くの研究者によって改良がなされてい
る（例えば、Ｈ．Ｏｋｕｄａ　ｅｔ　ａｌ，　Ｔｏｋｕ
ｓｈｉｍａ　Ｊ．　Ｅｘｐｔｌ．　Ｍｅｄ．．１２（１
），１１−２３　（１９６５））。この方法は強酸性条
件下で反応させるので装置が腐食しやすいという問題が
あり、感度が低いこと及び測定に時間を要゛〆ることも
問題であった。

酵素法についても、尿素にウレアーゼを作用させ生成し
たアンモニア、グルタξン酸脱水素酵素を利用してＮＡ
ＤＰＨの減少量を紫外線吸収の変化を測定して求める方
法が開発されている（Ａ．Ｍｏｎｄｚａｃ　ｅｔ　ａｔ
，　Ｊ．　Ｌａｂ．　Ｃｆｉｎ．　Ｍｅｄ．，Ｊ６＋　
５２６（１９６５）　）．この方法も感度及び精度に問
題があった。

尿素にウレアーゼを作用させ生成したアンモニアとグル
タミン酸及びＡＴＰの存在下でグルタミン合成酵素を作
用させ、さらにピルビン酸キナーゼ及びピルビン酸オキ
シダーゼを作用させて生威した過酸化水素をベルオキシ
ダーゼと４−アミノアンヂビリンを利用して比色定量す
る方法も開発されている（特開昭６２　−　３８００号
公報）。

一方、簡便な操作で迅速に定量できる方法として乾式法
も知られている。乾式法に用いる分析器具の例として、
日本分析化学会編分析ライブラリー３「臨床化学分析■
含窒素成分」第２版（東京化学同人、■９７９年発行）
１３〜ｌ４頁、「臨床検査」第５巻（第６号）３８７〜
３９１頁（１９６１年発行）米国特許３０１１８７４号
等には、濾紙片に細帯状の試薬層（ウレアーゼとアルカ
リ剤を含み、尿素からアｋモニアガスを生成させる）、
細帯状の障壁物層、細帯状の指示薬層（ｐ｝１指示薬ブ
ロムクレゾールグリーンを含む）がこの層に設けられた
ＢＵＮ定量分析用試薬片が開示されている。特開昭５０
　−　９３４９４号公報には、濾紙片にｐＨ指示薬プロ
ムチモールブルーを含浸し、ついでウレアーゼと親水性
ボリマーからなる障壁形成体との混合物をさらに含浸し
、最後にエチルセルロース半透膜を設けたＢＵＮ定量分
析用試験片が開示されている。また、特開昭５２　−　
３４８８号公報（特公昭５Ｂ−１９０６２号）には水平
浸透性の透明支持体の上に指示薬層、アンモニア蒸気が
均一に浸透可能で液体状水およびアルカリ性妨害物が浸
透不可能なセルロースアセテートブチレート等の疎水性
ボリマーの均質（非孔性）′ａ層からなる障壁物Ｎ（透
折Ｎ）、ウレアーゼおよびアルカリ剤を含む試薬層、お
よび多孔性展開層をこの順に一体に積層してなるＢＵＮ
定量分析用一体型多層分析要素等が提案されている。

〔発明が解決しようとする課題〕

従来の乾式法においてはいずれも尿素をウレア一ゼで加
水分解し生或したアンモニアガスを試験片ないし分析要
素内を拡散させており、この拡散が定量性に欠けるとい
う問題があった。

本発明の目的は蛋白質代謝の中間体及び最終生戒物であ
る尿素を簡便な方法で高精度で定量できる分析要素を提
供することにある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者ら．は上記目的を達成するべく鋭意検討を行っ
た結果特開昭６０　−　５４６９９号記載の尿素ア累ド
リアーゼにピルビン酸キナーゼ及びビルビン酸オキシダ
ーゼを組合わせ、生或した過酸化水素を比色定置する方
法に着目するに至った。特開昭６０−５４６９９に記載
の尿素分析用試薬組成物はＲ．Ｊ，Ｒｏｏｎｅｔ　ａｌ
の見出した（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ．　ＸＶＩＩＡ巻、３１７−３２４頁（１９７０年
））ＡＴＰ：アξドリアーゼ（ＥＣ　３．５，１．４５
　）を用い、ピルビン酸塩をピルビン酸オキシダーゼで
過酸化水素検出試薬組成物系へ導くピルビン酸定量試薬
組成物系を組み合わせた尿素の酵素的定量分析用試薬組
成物である。この試薬組成物は成分として尿素アミドリ
アーゼ、ビルビン酸キナーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ
、２価陽イオン、１価陽イオン、ホスホエノールピルヘ
ート、チア果ンピロ燐酸、アデノシン三燐酸、炭酸水素
塩、過酸化水素検出用発色試薬組成物を含む。この試薬
組成物に含まれるビルビン酸オキシダーゼは熱安定性に
欠ける（約４０’Ｃを越えると活性値の低下が早い）の
で、酵素的定量分析用試薬組成物の調製工程における品
質管理と試薬組成物の使用の保存時の温度管理は非常に
難しい、多層分析要素を製造する際の試薬層塗布工程で
好ましい親水性パインダボリマであるゼラチンなどを使
い難いという諸種の問題点のあることが判明した。さら
にまた、この反応系を乾式分析要素に組込んだ場合に試
料に含まれているビルビン酸が同時に検出されてこれが
誤差になるという問題も生じた。そこで本発明者らはさ
らに検討を進め、熱安定性の優れたピルビン酸デヒドロ
ゲナセーゼ反応系を用いかつこのピルビン酸を前記の反
応系に影響を与えることなく効率よく除去しうる手段を
案出するに至り、これによって前記目的を達成すること
ができた。

かかる本発明は、尿素アξドリアーゼ、ピルビン酸キナ
ーゼ、ビルビン酸デヒドロゲナーゼよりなる共役酵素反
応系試薬に電子伝達剤と電子受容性指示薬組成物とこれ
を組込んだ尿素分析用一体型多層分析要素に関するもの
である。

本発明の分析要素において尿素を検出する反応系は下記
のように進行する。

ＰＫ ＡＤＰ＋ホスホエノールピルビン酸→ＡＴＰ＋ビルビン
酸ＵＲＬ：尿素アミドリアーゼ Ｐ　Ｋ：ピルビン酸キナーゼ ＰＤＨ：ピルビン酸デヒドロゲナーゼ 本発明の試薬組成物に用いられる酵素は約５０゜Ｃ以下
の周囲温度で活性値の低下が生じない酵素である。

尿素アξドリアーゼ（ＥＣ　３，　５，　１．　４５）
は尿素アくドヒドロラーゼともいい、Ｃａｎｄｉｄａ　
　−ｕｔｉｌｉｓ，Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　　−
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ等を尿素を唯一の窒素源とする培
地に培養することによって産生させることができる。

ピルビン酸キナーゼ（ＥＣ　２，　７，　１．　４０）
はＢａｃｉｌｌｕｓ　＋ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈ
ｉｌｕｓＳＢａｃｉｌｌｕｓ　゜ｌｉ−（１１６１１ｉ
ｆｏｒｍｉｓ等が産生しうるほか、ラット、ウサギ、イ
ヌ、ニワトリ等の動物の筋肉、ブタの心臓などから取得
しうる。

ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤ｝Ｉ；ピルビン酸脱
水素酵素）　　（ＣＥ　１，２，４．１）はＬａｃｔｏ
ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｅ１−ｂｒｕｅｋｉｉなどの諸種
の細菌から抽出された酵素や動物臓器から抽出された酵
素を用いることができる。好ましいＰＤＩＩはＮＡＤＨ
非依存性のものである。

諸種の生物起源のＰＤＨのうちでＬａｃｔｏｂａｃｉｌ
ｌｕｓ　ｄｅｌ−ｂｒｕｅｋｉｉ起源の酵素（東洋紡績
■から市販）は好ましい酵素である。この酵素は分子量
ＩＪ１６万、等電点ｐｌ４．４±０．１で、ＦＡＤ　Ｓ
ＴＰＰ等の補酵素を必要とするが、燐酸をも基質とする
点で従来のピルビン酸デヒドロゲナーゼと異なる酵素で
ある。

Ｍｉｃｈａｅｌ　ｉｓ定数はピルビン酸に対して４．４
　ＸＩＯ−’Ｈ１燐酸に対して１．４　ＸＩＯ−２Ｍで
ある。また、４５゜Ｃの５０ｍＭ　　ｐＨ７．０燐酸緩
衝液中での活性値減少は極めて少なく、少なくとも３時
間にわたって実質的に活性値の減少は見られなかった。

この酵素に限らず一般にＩ’ＤＩｌは熱安定性が良く、
約５０℃の周囲温度（緩衝液中など）で活性値の減少は
僅少なものが多い。またいずれも市販されており、購入
して用いることができる。一方、本発明の分析要素用と
してはこれらの酵素は純品でなくともよく、例えば微生
物の発酵液あるいはそれから沈澱等の手段で得た粗製酵
素を利用することもできる。

２価陽イオン及び１価陽イオンは前記の共役酵素を活性
化させるものであり、Ｍ　ｇ　２＋、Ｍｎ”、Ｋ゛、Ｎ
Ｈ．”″等を含む。ホスホエノールピルベートはピルビ
ン酸キナーゼの基質であり、チアごンピロ燐酸はビルビ
ン酸デヒドロゲナーゼの活性化に必要な試薬或分である
。アデノシン三燐酸（ＡＴＰ）は尿素アミドリアーゼの
基質であり、炭酸水素イオンは尿素アミドリアーゼの活
性化に必要な試薬威分である。

電子伝達剤としてはＪ，　Ｆ　Ｂｕｒｄ　ｅｔ　ａｌ　
Ｃｌｉｎ．　Ｃｈｉｍ　Ａｃｔａ　４６　２２３　（１
９７３）、Ｓ．　Ｎａｋａｍｕｒａ　ｅｔ　ａｔ　Ｃｌ
ｉｎ．　Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ　１０１，３２１　（１９
８０）等に記載の電子伝達剤やジアホラーゼ（ＥＣ　１
．６，４．３）等の酵素が使用できる。例えば、ｌ−メ
トキシ−５−メチルフェナジニウムメチルサルフェート
（１−メトキシＰＭＳ）　、メクロラスブル−（９−ジ
メチルアξノベンゾーα−フエナゾニウムクロリド）、
５ーメチルフェナジニウムメチルサルフェート（ＰＭＳ
）等である。Ｂａｃｉｌｌｕｓ　０ｓｔｅａｒｏｔｈｅ
ｒｍｏｐｈｉｌｕｓの産生ずるＤｉａｐｈｏｒａｓｅは
５０℃でも活性が低下しない程熱安定性が高く、特に好
ましい。

指示薬としては還元性発色剤として公知のテトラゾリウ
ム塩類やレサズリン誘導体を使用できる。

テトラゾリウム塩類の例としては、３−（ｐ−インドフ
エニル）−２−（ｐ−ニトロフェニル−５−フェニルー
２Ｈ−テトラゾリウムクロリド（！ＮＴ）　、３−　（
４、５−ジメチル−２−チアジル）ー２、５−ジフェニ
ル−２Ｈ−テトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）　、３、
３’　−　（４、４′−ビフエニレン）一ビス（２、５
−ジフエニル−２Ｈ−テトラゾリウムクロリド）（ネオ
ーＴＢ）、３、３“（３、３゛−ジメトキシ−４、４゛
−ビフエニレン）ヒス（２−（ｐ−ニトロフエニル）−
５−フエニルー２Ｈテトラゾリウムクロリド）　（ニト
ロ一ＴＢ）、３．３“　一（３，３’−ジメトキシ−４
，４゛−ビフエニレン）ビス（２．５−ジフエニル−２
Ｈテトラゾリウムクロリド）（ＴＢ）、３．３”−（３
．３”−ジメトキシー４．４”　−ビフエニレン）ビス
（２，５−ビス　（ｐ−ニトロフェニル）−２Ｈテトラ
ゾリウムクロリド〕等々を挙げることができる。

本発明の一体型多層分析要素は少なくとも光透過性（透
明）水平透過性支持体、試薬珈及び展開層がこの順に積
層されている。

光透過性水平透過性支持体は一般の多層分析要素に使用
されている公知のものを利用すればよい。

その具体例としては、ポリエチレンテレフタレート、ビ
スフェノールＡのポリカルボネート、ポリスチレン、セ
ルロースエステル（セルロースジアセテート、セルロー
ストリアセテート、セルロースアセテートプロピオネー
ト等）などのボリマーからなる厚さ約５０μｍから約Ｉ
Ｍ、好ましくは約８０μｍから約３００μｍの範囲の透
明支持体を用いることができる。支持体の表面には必要
により前記の諸特許明細書等により公知の下塗層または
接着層を設けて支持体の上に設けられる親水性層等との
接着を強固にすることができる。

試薬層は前記の酵素及び試薬組底物の全部又は一部を含
有する層であり、非孔性で吸水性の層又は微多孔性で水
浸透性の層である。

実質的に非孔性で吸水性の試薬層に用いられる親水性ボ
リマーバインダーは水吸収時の膨潤率が３０”Ｃで約１
５０゜Ｃから約２０００％、好ましくは約２５０％から
約１５００％の範囲の天然または合威親水性ポリマーで
ある。その例として、ゼラチン（酸処理ゼラチン、脱イ
オンゼラチン等）、ゼラチン誘導体（フタル化ゼラチン
、ヒドロキシアクリレートグラフトゼラチン等）、アガ
ロース、プルラン、プルラン誘導体、ポリアクリルアミ
ド、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン等ヲ
挙ケることができる。実質的に非孔性の試薬層の乾燥厚
さは約３μｍから約５０ｐｍ、好ましくは約５μｍから
約３０一の範囲であり、また試薬層は実質的に透明であ
ることが好ましい。

微多孔性で水浸透性の試薬層は後述する布地展開層と同
様の布地、特開昭５７−１４８２５０に記載の有機ポリ
マー繊維バルプ含有抄造紙、特開昭５７−１２５８４７
等に記載の繊維と親水性ポリマーの分散液を塗布して形
成した多孔性層等の繊維質多孔性層；特公昭５３−２１
６７７号、米国特許３　９９２　１５８等に記載のメン
プランフィルター層（ブラッシュボリマ一層）、ポリマ
ーξクロビーズ等の微粒子が親水性ポリマーバインダー
で点接触状に接着されてなる連続微空隙含有等方的多孔
性層、特開昭５５　−　９０８５９に記載のポリマーミ
クロビーズが水で膨潤しないボリマー接着剤で点接触状
に接着されてなる連続微空隙含有等方的多孔性層（三次
元格子状粒状構造物層）等の非繊維等方的多孔性層等の
微多孔性層に試薬組成物を含有させた層又は固体微粒子
と親水性ポリマーバインダーから構成される微多孔性構
造体に試薬組成物を含有さセた層である。

微多孔性試薬層の乾燥時の層厚は約７μｍから約２５０
ｐｍ、好ましくは約１０ｎから約２５０ｐｆｌ＋の範囲
である。

微多孔性試薬層の上に展開層を設ける場合には、両層の
間は特開昭６１−　４９５９、特開昭６２−１３８７５
９等に記載の多孔性接着によるのが好ましい。

試薬層には公知のｐｌ＋緩衝剤組成物、高分子ｐｌ１緩
衝剤、塩基性ボリマー、酸性ボリマー、高分子媒染剤等
を含有させることができる。

展開層としては特公昭５３−２１６７７号公報等に開示
のメンプランフィルタ（ブラッシュポリマ一層）、ボリ
マーミクロビーズ、ガラスミクロビーズ、珪藻土が親水
性ボリマーバインダーに保持されてなる連続微空隙含有
多孔性層、特開昭５５　−　９０８５９号公報に開示の
ボリマーミクロビーズ、ガラスくクロビーズ等で水が膨
潤しないポリマー接着剤で点接触状に接着されてなる連
続微空隙含有多孔性層（三次元格子状粒状構造物層）等
の非繊維質等方的多孔性展開層、特開昭５５−１６４３
５６号公報、特開昭５７　−　６６３５９号公報等に開
示の織物展開層、特願昭５９−７９１５８号明細書に開
示の織物展開層、特願昭５７−１４８２５０号公報に開
示の有機ポリマー繊維パルプを含む抄造紙からなる展開
層等の繊維質多孔性展開層等があげられる。

展開層は直接あるいは必要により接着層を介して積層さ
れる。

糖の代謝生戒物であるピルビン酸は血清内に存在するの
で、本発明の試薬組成物を用いて血中尿素を定量分析す
る際には内因性ピルビン酸により正誤差が生じる可能性
がある。血清中の尿素含有量は正常値域で２．９〜１．
０ｍｍｏｌ／Ｌ　、ビルビン酸の含有量は正常値域で０
．１２〜１．０ｍｍｏｌ／Ｌであるので、スクリーニン
グ検査などの迅速簡易検査では状況に応じて無視できる
誤差とされることもあるが、通常の定量分析では無視で
きない誤差とはいえない。そこで、本発明の試薬組底物
を用いる血中尿素の定量分析においては内因性ピルビン
酸を除去する前処理工程を付加するのが好ましい。一方
、本発明の試薬組成物を配合した一体型多層分析要素に
おいては、要素内で尿素分析反応の始る前に内因性ピル
ビン酸を除去するために、尿素からピルビン酸の生戒ま
でのいずれかの反応ステップ、例えば尿素アミドリアー
ゼで尿素を加水分解するステップ又はピルビン酸キナー
ゼでピルビン酸を生成するステップを反応速度の律速状
態になるような試薬戒分量で含有させ、他の反応ステッ
プを迅速に進行させるような試薬成分量で含有させるこ
とにより目的を達成することができる。あるいは試薬層
での主反応である尿素アミドリアーゼの作用する反応ス
テップ以降を進行させる前に内因性ピルビン酸を除去す
るための反応ステップを起こさせるための内因性ピルビ
ン酸除去層を試薬層より上側に設けることが好ましい。

内因性ビルビン酸除去層は、ピルビン酸を基質とするが
、電子伝達剤と電子受容性指示薬組成物と反応する反応
生底物を生じない酵素含有試薬組成物を含む独立の層と
して、試薬層より上側（支持体から遠い側）に設けるこ
とが好ましい。

このような酵素反応試薬組成物としては、ホスホエノー
ルピルビン酸合戒酵素（ＥＣ　２．７．９．２）とＡＴ
Ｐの組合せ、ピルビン酸燐酸ジキナーゼ（ＥＣ２．７．
９．１）とＡＴＰと燐酸塩の組合せ、ピルビン酸カルボ
キシラーゼ（ＥＣ　６．４．１．１）とＡＴＰと炭酸イ
オンの組合せ等を挙げることができる。ホスホエノール
ピルビン酸合成酵素とＡＴＰの組合せを用いることによ
って２価のマンガンイオンの存在下で試料中のビルビン
酸をホスホエノールビルビン酸に変えることができ、ビ
ルビン酸燐酸ジキナーゼとＡＴＰと燐酸塩の組合せを用
いることによってマグネシウムイオンとアンモニウムイ
オン又はカリウムイオンの存在下でピルビン酸をホスホ
エノールピルビン酸に変えることができる。ビルビン酸
カルボキシラーゼとＡＴＰと炭酸塩の組合せを用いるこ
とによってビオチンとマグネシウムイオンの存在下でピ
ルビン酸をオキサロ酢酸に変えることができる。そのほ
か、次に示す酵素反応系も内因性ピルビン酸の除去に利
用できる。

内因性ビルビン酸除去層に使用される反応系は、Ｌ−グ
ルタミン酸合成酵素−ピルビン酸キナーゼービルビン酸
脱水素酵素共役系が充分に機能できるｐｉ域にて活性及
び保存性が保障できるピルビン酸に特異性の高い酵素反
応系が好ましい。更に、不可逆反応を進行させる酵素が
好ましい。また基質や反応生成物が共存させる電子受容
性指示薬組成物（還元系発色剤指示薬組成物）に活性を
持たない酵素反応系が好ましい。

また、上記の酵素反応と共役した反応系をさらに導入し
て生或物をさらに別生或物に変えあるいは副生成物を反
応前の化合物に戻すことも好ましい。例えば、ビルビン
酸デカルボキシラーゼでアセトアルデヒドと炭酸に分解
する反応は逆反応が起こらない点で好ましい。前記の共
役反応系は数多く存在し、それらのなかから本発明に適
当なものを選択することができる。

酵素反応試薬組成物にはｐｌｌ緩衝剤、酵素活性化剤等
をさらに組合せることができる。

上記の酵素反応試薬組成物を含むビルビン酸除去層は試
薬層より上側（支持体から遠い側）に設けて試料中のア
ナライト（尿素）から生じたピルビン酸を酵素反応させ
る前に試料に予め含まれていたピルビン酸を他の物質に
変えるようにする。

このピルビン酸除去層は別異の独立した層として設けて
もよく、展開層、光遮蔽層等に酵素反応試薬組成物を含
有させて兼用させることもできる。

別異の層として設ける場合には例えば前述の試薬層で説
明した親水性ボリマーバインダー層又は微多孔性層を利
用することができる。また、ビルビン酸除去層はｌＮに
限られるものではなく、酵素反応試薬ｍ戒物の各或分を
２層以上に分けて含有せしめてもよい。

一方、尿素アミドリアーゼ、ビルビン酸キナーゼ、ピル
ビン酸デヒドロゲナーゼ及び電子伝達剤と電子受容性指
示薬試薬組成物も一部は試薬層以外の層に含有させても
よいが、その場合であっても試料中のアナライト（尿素
）から生じたアンモニアをピルビン酸に変える反応がピ
ルビン酸除去層によって試料中に予め含まれていたピル
ビン酸が除去された後に起こるように配置する必要があ
る。

本発明の一体型多層分析要素における含有量は尿素ア旦
ドリアーゼが約１５００〜約ｌＯ万ＩＵ／ｒｒｒ程度、
好ましくは約７０００〜約７万ＩＵ／ｎｆ程度、ピルビ
ン酸キナーゼが約２０００〜約１０万ＴＵ／ｒｄ程度、
好ましくは約４０００〜約６万ＩＵ／ｒｒｆ程度、ピル
ビン酸デしド口ゲナーゼが約２０００〜約１０万１０／
％程度、好ましくは約５０００〜約５万１Ｕ／ｒｄ程度
が適当である。

他の酵素の場合も上記に準じてあるいは必要により実験
を行うことにより適当な含有量を設定することができる
。

本発明の分析要素番こおいては尿素アミドリアーゼ又は
ビルビン酸キナーゼの一方を、好ましくは尿素アξドリ
アーゼを、反応速度律速量とすることが好ましい。これ
はピルビン酸オキシダーゼとベルオキシダーゼの量（活
性値）に対してグルタξン合成酵素又はピルビン酸キナ
ーゼの量（活性値）が前記の反応の進行する速度を支配
するような量であることを意味する。

反応速度律速量は試料が血清の場合には一般に尿素アξ
ドリアーゼは約４００〜約４０００ＩＵ／ｎ｛程度、そ
してピルビン酸キナーゼは約５００〜約３０００１０／
ｒｒｒ程度である。

多層分析要素には前述の諸層のほかに必要に応じて特開
昭５１−４０１９１　、特開昭５３−１３１０８９等に
開示の検出層または媒染層、特開昭５４　−　２９７０
０等に開示のξグレーション阻止層、特開昭５１−４０
１９１等に開示の中間層、特開昭５６　−　８５４９に
開示の試薬含有微粒子分散層等を組み込んで設けること
ができる。

展開層、試薬層、検出試薬層、吸水層、検出層、接着層
等には界面活性剤、好ましくはノニオン性界面活性剤を
含有させることができる。ノニオン性界面活性剤の例と
して、ｐ−オクチルフエノキシポリエトキシエタノール
、ｐ−ノニルフエノキシポリグリシドール、ポリオキシ
エチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレンソルビ
タンモノラウレート、オキチルグルコシド等がある。ノ
ニオン性界面活性剤を試薬層、検出試薬層、吸水層又は
検出層に含有さ一仕ることにより分析操作時に水性液体
試料中の水が試薬層、検出試薬層、吸水層又は検出層に
実質的に一様に吸収されやすくなり、また展開層との液
体接触が迅速かつ実質的に一様になる。ノニオン性界面
活性剤を展開層に含有させることにより水性液体試料の
展開作用（メータリング作用）がより良好になる。ノニ
オン性界面活性剤の展開層における含有量は展開層１　
ｒｄ当り約１０■〜約３．０ｇ、好ましくは約２０■〜
約２．０ｇの範囲である。

本発明の多層分析要素は前述の諸特許明細書に記載の公
知の方法により調製することができる。

本発明の多層分析要素は一辺約１５閣から約３０ｍｍの
正方形またはほぼ同サイズの円形等の小片に裁断し、特
公昭５７−２８３３１　、実公昭５６−１４２４５４、
特開昭５７−６３４５２　、実開昭５８−３２３５０　
、特表昭５８５０１１４４等に記載のスライド枠に収め
て化学分析スライドとして用いることが、製造、包会、
輸送、保存、測定操作等諸種の観点で好ましい。使用目
的によっては長いテープ状でカセットまたはマガジンに
収めて用いること、または小片を開口のあるカードに貼
付または収めて用いることなどもできる。

本発明の多層分析要素は前述の諸特許明細書等に記載の
操作により液体試料中のアナライトの分析を実施できる
。例えば約５μｌから約３０ｕｌ、好ましくは８μｌか
ら１５μｌ、の範囲の全血、血漿、血清、尿等に水性液
体試料滴を展開層に点着し、１分から１０分の範囲で、
約２０″Ｃから約４０’Ｃの範囲の実質的に一定の温度
で、好ましくは３７゜Ｃ近傍の実質的に一定の温度でイ
ンクベーションし、要素内の発色または変色を可視光又
は紫外光の吸収極大波長またはその近傍の波長の光を用
いて光透過性支持体側から反射測光し、予め作威した検
量線を用いて比色測定法の原理により液体試料中のアナ
ライトの含有量を求めることができる。

測定操作は特開昭６０−１２５５４３、特開昭６０　−
　２２０８６２、特開昭６１−２９４３６７、特開昭５
８−１６１８６７、特開昭６３−３１３０６３等に記載
の化学分析装置により極めて容易な操作で高精度の定量
分析を実施できる。

尿素アミドリアーゼ又はビルビン酸キナーゼが反応速度
律速量の場合には次のようにして測定を実施できる。例
えば約５μｌから約３０μｌ、好ましくは８μｌから１
５μｌ、の範囲の全血、血漿、血清、尿等に水性液体試
料滴を展開層に点着し、１分から１０分の範囲で、約２
０”Ｃから約４０゜Ｃの範囲の実質的に一定の温度で、
好ましくは３７゜Ｃ近傍の実質的に一定の温度でインク
ベーションし、要素内の発色または変色を可視光又は紫
外光の吸収極大波長またはその近傍の波長の光を用いて
光透過性支持体側から反射測光し、レートアッセイする
。

これは反射光学濃度を連続的に測定して求めてもよく、
経時的に２回以上測定して求めてもよい。

本発明の分析要素における発色はまず試料に予め含まれ
ているピルビン酸に起因して起こり、次に被分析物の尿
素に基づく発色が開始される。試料中のビルビン酸によ
る発色は通常反応開始後３０秒位で起こり、１分半ない
し２分程度まで一定の発色濃度状熊が続くので反応開始
後１分から１分半゛位の間に反射光学濃度を測定してこ
れを試料に予め含まれていたピルビン酸による発色とす
ることができる。被分析物に基づく発色は反応開始後１
分半ないし２分後にはじまり、その発色速度が被分析物
の濃度と相関しているので、この発色速度を求める。こ
の発色速度は２回の測定で求めてもよく、３回あるいは
それ以上測定して求めてもよい。測定時期は２回の場合
には通常反応開始後３分以降がよく、例えば３分後と５
分後に測定することができる。被分析物濃度の決定は予
め求めておいて被分析物の濃度と発色速度との関係から
算出する。測定操作は特開昭６０−１２５５４３、特開
昭６０２２０８６２、特開昭６１−　２９４３６７、特
開昭５８−１６１８６７等に記載の化学分析装置により
極めて容易な操作で高精度の定量分析を実施できる。

〔作　用〕

本発明の分析要素で採用されている尿素測定用の反応試
薬系は尿素を尿素アξドリアーゼがＡＴＰと反応させて
アンモニア、炭酸、ＡＤＰ及び燐酸イオンに変換し、そ
の際生威したＡＤＰをピルビン酸キナーゼがホスホエノ
ールピルビン酸と反応させてピルビン酸を生成させる。

このピルビン酸をピルビン酸デヒドロゲナーゼがアセチ
ル燐酸に変えその際に電子受容性化合物が還元される。

この電子受容性化合物を電子伝達剤と電子受容性指示薬
組成物にすることによって比色定量するのである。この
ような反応系では試料中に予め含まれているピルビン酸
も検出されて誤差の原因となる。このピルビン酸は試料
中のあるいは目的威分から生じた尿素からピルビン酸が
生或される前にピルビン酸除去用の酵素反応試薬組成物
で他の物質に変えて誤差を除くことができる。例えば、
この酵素反応試薬組成物にビルビン酸デカルボキシラー
ゼ（ＥＣ　４．１．１．１）を用いた場合にはピルビン
酸オキサロ酢酸に変えて尿素分析用の反応系で反応しな
いようにしている。

〔実施例〕

実施例ｌ 尿素分析用試薬組成物水溶液の成分 燐酸緩衝液　　　　　　ｐｌ１　６．５　　５０ｍＭ尿
素アミドリアーゼ　　　　１．５　　１０／ｄピルビン
酸キナーゼ　　　　２．０　　１０７ｄビルビン酸脱水
素酵素　　　１．Ｑ　　１０／ｄＡＴＰ　　　　　　　
　　　　Ｏ．６　　ｍＭホスホエノールピルベート　０
．５　　ｍＭＫＨＣＯ３　　　　　　　　　０．８　　
ｍＭチアミンピ口燐酸　　　　　０．２　　ｍＭＦＡＤ
　　　　　　　　　　　Ｏ．０１　　ｍＭＥＤＴＡ−Ｎ
ａｇ　　　　　　１．Ｏ　　ｍＭＭ　ｇ　Ｓ　０４　　
　　　　　　　１０　　　ｍＭｍＰＭＳ　　　　　　　
　　　０．０１　　ｍＭＮ　Ｔ　８　　　　　　　　　
　　１　　　ｍＭ上記の尿素分析用試薬組成物溶液３ｄ
に、光路長１０岨のフローセルを用いて、下記の尿素を
含有する検体を１０ｄ添加した。光路長１０ｍｍのフロ
ーセルを用いて、３７゜Ｃで６分間インキユベーション
して５７０ｎｍで発色光学濃度を透過測光したところ、
下記の結果が得られた。

尿素濃度　　透過光学濃度（５７０　ｎｍ）２３　　■
／ｄ１０．２８ ４６　　■／ｄ　　　　Ｏ．５７ ９２　　■／ｄｆｌ１．１３ １１５　　ｍｇ／ａ　　　　１．４０ 実施例２ 実施例ｌにおいてｍＰＭＳの替りに、Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ　　由来のジア
ホラーゼ１υ／ｍｌを添加した尿素分析用試薬組成物水
溶液に実施例ｌと同じ尿素含有液体を加えて発色反応さ
せたところ実施例１と同様の発色結果を得た。

実施例３ ゼラチン下塗層を有する厚さ１８５μｍの無色透明ポリ
エチレンテレフタレート（ＰＥＴ）フィルム支持体の上
に下記組成の尿素測定用検出試薬層を乾燥後の層厚が約
１５μｍになるようにして塗布し乾燥した。

検出試薬層の或分被覆量ｕｎｉ当り） ゼラチン　　　　　　　　　　　　１５ｇピルビン酸デ
ヒドロゲナーゼ　１５，ＯＯＯＵチアミンビ口燐酸　　
　　　　２２５　　ｍｇＦ　Ａ　Ｄ　　　　　　　　　
　　　　４５　　■Ｅ　ＤＴＡ−Ｎ　ａ　ｚ　　　　　
　　　７５０　　ｍｇＭ　ｇ　Ｓ　Ｏ　４９００　　■ ｍＰＭＳ　　　　　　　　　　　　４００　　ｍｇＮ　
Ｔ　Ｂ　　　　　　　　　　　　　６００　　■ノニル
フェノキシボリＩトキシエタノール（　平均１０才キシ
エチレン単位含有）　　　　５００　　■燐酸緩衝剤　
ｐｌｌ６．７　　　　　　　１０　ｇ次いで検出試薬層
の上に次の組戒から或る試薬層を乾燥膜厚１０μｍにな
るように塗布し乾燥した．試薬層の成分被Ｍ量（１ボ当
り） ゼラチン　　　　　　　　　　　Ｌｏｇ尿素アミドリア
ーゼ　　　　　　５０．　０００Ｕビルビン酸キナーゼ
　　　　　　４０．００００ＡＴＰ　　　　　　　　　
　　　　　ＩｇホスホエノールピルビンＭ　　　　８　
０　０ｒｎ　ｇＫ　Ｈ　Ｃ　０３　　　　　　　　　　
　　１．３ｇ燐酸緩衝液ｐＨ　６．７　　５００ｍＭ　
　　　１０ｇ次に、試薬層をノニルフエノキシポリエト
キシエタノール（平均１０オキシエチレン単位含有）２
％含有水で全面にわたりほぼ一様に湿らせておき、試薬
層の上に展開層としてセルロースアセチート製メンブレ
ンフィルター（孔径の最小値の平均３．０μｍ、空隙率
約８５％、厚さ１４０μｍ）をラミネートして尿素分析
用多層分析要素を作製した。この分析要素を１５ｍｍ　
Ｘ　１５Ｍの正方形チップに裁断し、特開昭５７　−　
６３４５２号記載のプラスチックマウントに収め、Ｆ　
Ｄ　Ｃ５０００アナライザー（富士写真フィルム■製）
を用いて要素内の発色光学濃度を波長５１０ｎｍの可視
光でＰＥＴ支持体側から反射測光したところ、下記の結
果が得られた。尚、試料は健常者の血清を用いた。

尿素含有血清　　尿素量　発色光学濃度（　５１０ｎｍ
）ＮＣＬ　　１　　　　　　１５　　ｍｇ／ａ　　　Ｏ
．３５３２　　　　　３２　■／ｄｉ　　　Ｏ．５２４
６０　　■／み　　０．９０２ １２５　　■／ａ　　　１．３４７ ３ ４ 実施例４ ゼラチン下塗層を有する厚さ１８５μｍの無色透明ＰＥ
Ｔフィルム支持体の上に下記組威の尿素測定用試薬層を
乾燥後の層厚が約１３μｍになるようにして塗布し乾燥
した。

尿素測定用試薬組或（１ボ当りの被覆量）尿素アξドリ
アーゼ　　　　　　５０．０００１１／ボピルビン酸キ
ナーゼ　　　　　　４０．　ＯＯＯＵ／ボＫＨＣ○３１
．３ｇ／ボ ホスホエノールピルビン酸　　　０．８ｇ／ｆｆｌＡ　
Ｔ　Ｐ　　　　　　　　　　　　　　３．０ｇ＃＋｛ピ
ルビン酸デヒドロゲナーゼ　　３３．００００／ｎｆチ
アミンビ口燐酸（Ｔ　Ｐ　Ｐ　）　　　　４６０ｍｇ／
　ｒｒｆＦ　Ａ　Ｄ　　　　　　　　　　　　　　５０
０■／ボＭｇ゜゛（硫酸マグネシウム）　　　　１５０
ｍｇ／ボジアホラーゼ　　　　　　　　　３３．ＯＯＯ
Ｕ／ボＮ　Ｔ　Ｂ　　　　　　　　　　　　　　７５０
ｍｇ／　ｎｆ燐酸緩衝剤（ｐＨ　７．０）　　　　　　
　０．２　ｍｏｌ脱イオンゼラチン　　　　　　　　１
０ｇ／ボノニルフエノキシポリエトキシエタノール（平
均１０オキシエチレン単位含有）　　０．３ｇ／％この
試薬層の上に０．２ｇのノニルフェノキシポリエトキシ
エタノール（平均１０オキシエチレン単位含有）、８ｇ
の二酸化チタン微粒子（ルチル型、粒子径０．２５〜０
．４０μｍ）および１ｇの脱イオンゼラチンの割合の水
分散液を塗布し乾燥して乾燥層厚が約５μｍの光遮蔽層
を設けた。

次いで、この光遮蔽層の上に下記組或の内囚性ピルビン
酸除去層を乾燥後の層厚がｌｏμｍになるようにして塗
布し乾燥した。

ピルビン酸除去層用試薬＆ＩＩ戒 ピルビン酸デカルボキシラーゼ （Ｂｒｅｗｅｒｓ　Ｙｅａｓｔ　　由来）　　　　　５
５　．　００００／　ｒｄｐｌ１　７．０燐酸緩衝剤　
　　　　　　０．２ｍｏｌ／ｒｒｆ脱イオンゼラチン　
　　　　　　１ｇ／ｎＴ更にこの内因性ピルビン酸除去
層の上に、２．７ｇｉｒｄの脱イオンゼラチンと１３５
ｍｇ／　ｒｄのノニルフェノキシポリエトキシエタノー
ル（平均１０オキシエチレン単位含有）の接着層を水溶
液から塗布し乾燥して設けた（乾燥層厚約２μｍ）。

一方、太さ約５０Ｄ相当のＰＥＴ紡績糸からなる厚さ約
２５０μｍの水洗脱脂済トリコント編生地で、その片面
を６０秒グロー放電処理（１．６ｋＷ／％，酸素濃度は
減圧）した編物生地を用意した。

次いで、接着層を水でほぼ均一に湿潤させ、その上に前
述のトリコット編物生地をグロー放電処理時の電極側表
面を接着層に向きあわせてかさね全体を加圧ローラー間
を通過させ接着層に均一にラξネートして編物展開層を
設けた。

ついで編物展開層の上から下記組威の編物展開層含浸処
理用水溶液を１％当り１５０　ｄの割合で塗布し乾燥し
て尿素分析用一体型多層分析要素を調製した。

織物展開層含浸処理用水溶液の組戒 メチルセルロース （２％水溶液の２０゜Ｃでの粘度５０ｃｐｓ　）　　２
０　ｇオクチルフェノキシボリエトキシエタノール（１
．１シエチレン単位の平均縮台数３０，　ＨＬＢ価１７
．４）　１０　ｇ水　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　１０００　ｇこの分析要素を１５ａｉＸ１
５ｍｍの正方形のチップに裁断し、特開昭５７　−　６
３４５２号公報に記載のプラスチックマウントに入れて
測定を行った。検体には、健康で正常な戒人の血液をヘ
パリン採血して用いた。この血漿に塩化アンモニウム及
びピルビン酸カリウムを各々添加し、各々アンモニア及
びピルビン酸濃度を自動分析装置（日立７０５０　）で
測定しておいた。測定は波長５１０ｎｍでＦ　Ｄ　Ｃ５
０００アナライザー（富士写真フィルム■製）を用いて
実施例３と同様にして行い、下記の結果を得た。

１　　　　　　１０　　　　　０．２２　　　　　　　
　０．２５０２　　　　　　１？　　　　　０．３５　
　　　　　　　０．３４５３　　　　　　２５　　　　
　０．２５　　　　　　　　．０．４６３４　　　　　
　４１　　　　　０．２３　　　　　　　　０．６２８
５　　　　　　５６　　　　　０．５２　　　　　　　
　０．７５１６　　　　　　６２　　　　　０．４１　
　　　　　　　０．８０２実施例５ 尿素アミドリアーゼをＩＯＯＯＵ／ｒｒｆとしたほかは
実施例４と同様の試薬層の上に実施例４と同じ光遮蔽層
を設け、その上に実施例４と同じ接着層及び展開層を順
次積層した。但し、ピルビン酸除去層は設けなか・った
。展開層の上から実施例４と同じ含浸処理用水溶液を塗
布して尿素分析用一体型多層分析要素を調製した。この
分析要素を実施例４と同様にして評価した。但し、点着
後３分と５分の反射光学濃度値の差を波長６００ｎｍで
測定したところ、下記の結果が得られた。

検体　尿素濃度　　光学濃度値の差（５分値−３分値）
３１　　■／ｄ１０．０４６ ６２　　　　　　　　　　　　０．０８１９２　　　　
　　　　　　　　０．１３２１２１　　　　　　　　　
　　　０．　１７７〔発明の効果〕 本発明の尿素分析用試薬組成物は安定性が高く、この試
薬ｍ戒物を一体型多層分析要素に組込むことにより尿素
を簡便な操作で高精度で定量分析することができる。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）尿素アミドリアーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ピル
   ビン酸デヒドロゲナーゼ、及び電子受容性指示薬組成物
   を含む尿素分析用試薬組成物。
2. （２）光透過性水平透過性支持体の上に少なくとも１層
   の試薬層及び展開層がこの順に積層されている一体型多
   層分析要素であって、前記試薬層に尿素アミドリアーゼ
   、ピルビン酸キナーゼ、ピルリン酸デヒドロゲナーゼ、
   及び電子受容性指示薬組成物を含む尿素測定試薬組成物
   が含有されていることを特徴とする尿素分析用一体型多
   層分析要素。