JP2008307048A - 膵リパーゼ測定用乾式分析要素の製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】膵リパーゼへの特異性が高く簡易に使用できる膵リパーゼ分析乾式分析要素を安定に精度よく作製するための製造方法と、その方法で作製した膵リパーゼ分析乾式分析要素を提供すること。
【解決手段】炭素数14から20の長鎖アルキル脂肪酸のジグリセリドまたはトリグリセリド、モノグリセリドリパーゼ、及びグリセリン測定試薬を含有する少なくとも１つ以上の展開層または試薬層を含む体液中の膵リパーゼ測定用乾式分析要素の製造方法において、低級アルコールまたはアセトンに溶解したグリセリドを上記展開層または試薬層に添加して乾燥する工程を含むことを特徴とする、上記乾式分析要素の製造方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、液体試料、特に、ヒトおよび動物の血清、血漿中のリパーゼ活性、特に、膵リパーゼ活性を測定するための、簡便で精度の高い乾式分析要素の製造方法に関するものである。本発明で製造される乾式分析要素は、特にヒトおよびイヌの膵疾患診断に有用である。

膵疾患の診断に有用な膵リパーゼ分析は、膵リパーゼが油水界面で作用することから、水中に基質がミセル状に分散された状態で測定されることが多い。界面活性剤などにより可溶化した基質やアルキル鎖長の短い脂肪酸のグリセリドでは、リポプロテインリパーゼ、肝リパーゼなどの非膵リパーゼやエステラーゼが反応することがあるからである。したがって、膵リパーゼ乾式分析要素を開発する際、重要な技術的ポイントは膵リパーゼに特異的な長鎖脂肪酸のグリセリド基質を膵リパーゼ特異的な状態で組み込むことと考えられる。

リパーゼを分析する乾式分析要素は、大きく２つに分類され、第一は、トリグリセリドを基質としグリセリン、過酸化水素を経由して色素に変換する方法を用いるものであり、最初に開示された方法は、α位のエステル位の一つに炭素数８個以上の長鎖のアルキル基を有し、他の２つのエステルは短鎖のアルキル基を有するトリグリセリドを基質に用い、検体中のリパーゼにより生成した１，２ジアセチルグリセリドをアセチナーゼというエステラーゼでグリセリンに変換し、グリセリンを色素に変換する多層乾式分析要素である（特開昭59-48098号公報）。この方法は、高精度で簡易なリパーゼ測定法であるが、膵リパーゼに対する選択性が高くなく膵疾患の診断には問題があると報告されている。

次に、トリオレインのような、炭素数１４〜２０の長鎖脂肪酸を有するトリグリセリドを基質に用いたトリグリセリドを基質とし、モノグリセリドリパーゼ、グリセリン測定試薬を含むドライケミストリー用膵リパーゼ分析試薬（特開平4-316500号公報）、さらに、この方法を応用し、精度が高い多層分析要素を作製し、さらに、微粒子を組み込むことでリパーゼの反応性を高めることを期した方法は特開2002-125699号公報に記載されている。特開平4-316500号公報記載の方法は、脂溶性が高い基質を組み込むためアラビアゴム等の保護コロイドを用い超音波分散の水系分散を行っており（特開平4-316500号公報の実施例）、基質の分散の再現性や粒度分布の均一性を保つことが要求され、また、支持体がないため、製造が困難であると考えられる。また、特開2002-125699号公報には、基質の添加方法については、言及されていない。

基質の添加方法については、例えば、特開平4-316500号公報では次のように記載されている。“トリオレインのような３つのエステル位全てに長鎖脂肪酸を有するトリグリセリドは乳化しにくい性質を持つため、ドライ試薬作製時に界面活性剤や保護コロイドの存在下でトリオレインを攪拌、超音波等の物理的な剪断力により均一に乳化分散した溶液として添加してもドライ状態にすると分散媒である水が無くなるために乳化物は凝集、合一し展開層表面に付着し、油水界面の表面積が極端に減少する。測定時に、このドライ試薬にリパーゼを含む検体（液体）を作用させても物理的な剪断力がないため、トリオレインは凝集、合一したまま元の分散状態には戻らない。リパーゼは油水界面が反応場であるため、油水界面の表面積の減少が反応速度を低下させる原因と考えられる。”

第２は、色素放出基質である１，２−Ｏ−ジラウリルーｒａｃ−グリセロ−３−グリタル酸・レゾルフィンエステルを用いる乾式分析要素である（特開平9-154598号公報）。この方法は、膵リパーゼ特異性が高く、かつ、グリセリン発色系が不要であるため、好ましい方法である。しかしながら、乾式分析要素に組み込まれた基質が極めて分解しやすく、低pＨのリパーゼ基質含有層と高pＨの他の試薬層を分離する試みをなされたものの実用化には至っていない。また、ここで、基質溶解に好ましいとされるエーテル系溶剤は、環境負荷が大きく環境考慮設計が求められる今日において、製造適性に深刻な問題がある。また、この基質が比較的高価なことも、実用化するのに問題となる。

上記の通り、現在に至っても、商品化されているリパーゼ分析用乾式分析要素は、膵リパーゼ特異性の高くない、特開昭59-48098号公報に記載の製品だけであり、市場から、膵疾患診断において、より信頼性の高い乾式分析要素が求められている。

特開昭59-48098号公報 特開平4-316500号公報 特開2002-125699号公報 特開平9-154598号公報

本発明の目的は、膵リパーゼへの特異性が高く簡易に使用できる膵リパーゼ分析乾式分析要素を安定に精度よく作製するための製造方法と、その方法で作製した膵リパーゼ分析乾式分析要素を提供することである。そのためには、溶液法では水系で微細分散使用するトリオレインなど長鎖脂肪酸ジグリセリドまたはトリグリセリドを、膵リパーゼの基質応答性を維持したまま乾式分析要素に組み込む方法を提供することが必要である。膵リパーゼ基質応答性とは、膵リパーゼ特異性が高いことと、その酵素反応性が分析精度を上げるだけ十分に高いことである。

かかる実状を踏まえ、本発明者らは鋭意研究を行った結果、膵リパーゼに特異性の高い基質を用い、簡易で精度が高い分析が実現できる乾式分析要素の構成を用い、再現性の高い発色が期待できる発色反応系を用い、基質添加方法としてトリオレインでこれまで採用されたことはなかった有機溶剤溶解による組み込み法を用いることによって、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明によれば、炭素数14から20の長鎖アルキル脂肪酸のジグリセリドまたはトリグリセリド、モノグリセリドリパーゼ、及びグリセリン測定試薬を含有する少なくとも１つ以上の展開層または試薬層を含む体液中の膵リパーゼ測定用乾式分析要素の製造方法において、低級アルコールまたはアセトンに溶解したグリセリドを上記展開層または試薬層に添加して乾燥する工程を含むことを特徴とする、上記乾式分析要素の製造方法が提供される。

好ましくは、グリセリドの乾燥方法は温風乾燥である。
好ましくは、グリセリドは、メタノール、エタノール、プロピルアルコールまたはアセトンに溶解されている。
好ましくは、グリセリドはトリグリセリドである。
好ましくは、トリグリセリドはトリオレインである。

好ましくは、モノグリセリドリパーゼはバチルス・ステアロサーモフィラスH-165由来のモノグリセリドリパーゼである。
好ましくは、グリセリン測定試薬は、グリセロールキナーゼとグリセロリン酸オキシダーゼと発色試薬を含む。

好ましくは、乾式分析要素の構成は、水不透過性支持体と試薬層と展開層からなる。
好ましくは、展開層は、布または多孔質膜からなるものである。
好ましくは、多孔質膜は、ポリスルホンもしくはアセチルセルロースからなる多孔質膜、または微小ビーズから形成される多孔質膜である。

好ましくは、展開層は、布からなるものである。
好ましくは、モノグリセリドリパーゼの添加量は8000U/m²から1000U/m²である。

本発明の別の側面によれば、上記した本発明の方法によって製造される、体液中の膵リパーゼ測定用乾式分析要素が提供される。

本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明の方法によって製造される体液中の膵リパーゼ測定用乾式分析要素に体液を適用して、該体液中の膵リパーゼを測定する方法が提供される。好ましくは、体液はイヌ血液である。

本発明によれば、膵リパーゼへの特異性が高く簡易に使用できる膵リパーゼ分析乾式分析要素を安定に精度よく作製することができる。

本発明の方法は、炭素数14から20の長鎖アルキル脂肪酸のジグリセリドまたはトリグリセリド、モノグリセリドリパーゼ、及びグリセリン測定試薬を含有する少なくとも１つ以上の展開層または試薬層を含む体液中の膵リパーゼ測定用乾式分析要素の製造方法において、低級アルコールまたはアセトンに溶解したグリセリドを上記展開層または試薬層に添加して乾燥する工程を含むことを特徴とする方法である。

本発明では、基質は、膵リパーゼの特異性が高い長鎖脂肪酸を有すジグリセリドまたはトリグリセリド、好ましくはトリグリセリドであり、より好ましくはトリオレインを用いる。また、実質的にジグリセリドに反応しないモノグリセリドリパーゼ、および、従来からある信頼性の高いグリセリン発色試薬を用いる。層構成は、少なくとも１つ以上の展開層または試薬層があればよく、1層の試験紙でもよい。好ましくは、より測定精度と強度を高めるために、支持体と少なくとも１層以上の試薬層からなる多層分析要素を用いる。基質はエタノールなどの有機溶剤にトリオレイン等のグリセリドを溶解し、乾式分析要素に組み込み、好ましくは、温風乾燥で乾燥させる。その結果、有機溶剤を加えてもグリセリン発色反応に関与する酵素を損なうことなく、膵リパーゼ特異性が高く膵リパーゼ反応性の十分高い、グリセリド油水界面を形成できる乾式分析要素を製造することが可能になった。

さらに、リポタンパク質を高濃度に含む、いわゆる乳び検体のなかで、比較的長期にわたり保存された検体の一部で、リポタンパク質の分解の影響と考えられる異常データが見られたが、この誤差は、本発明で共役酵素として添加したモノグリセリドリパーゼ量を制御することで、大きく軽減した。

本発明のリパーゼ測定用乾式分析要素の支持体層を構成するものとしては、光透過性でかつ水不透過性である支持体が用いることができる。光透過性・水不透過性支持体の例としては、ポリエチレンテレフタレート、ビスフェノールＡのポリカルボネート、ポリスチレン、セルロースエステル（例、セルロースジアセテート、セルローストリアセテート、セルロースアセテートプロピオネート等）等のポリマーからなる厚さ約５０μｍから約１ｍｍ、好ましくは約８０μｍから約３００μｍの範囲のフィルムもしくはシート状の透明支持体を挙げることができる。支持体は、リパーゼ測定用乾式分析要素の高速・安定製造のために有用である。

支持体の表面には必要により下塗層を設けて、支持体の上に設けられる試薬層と支持体との接着を強固なものにすることができる。また、下塗層の代りに、支持体の表面を物理的あるいは化学的な活性化処理を施して接着力の向上を図ってもよい。

支持体の上には（場合によっては下塗層等の他の層を介して）試薬層が設けられる。試薬層はアナライトであるリパーゼと反応して光学的に検出可能な変化を生じる後述の試薬組成物の少なくとも一部が親水性ポリマーバインダー中に実質的に一様に分散されている吸水性で水浸透性の層である。この層は、主にグリセリンを色素に変換する機能を有すため、反応層または発色層とも表現される場合もある。

試薬層のバインダーとして用いることができる親水性ポリマーは、一般には水吸収時の膨潤率が３０℃で約１５０％から約２０００％、好ましくは約２５０％から約１５００％の範囲の天然または合成親水性ポリマーである。そのような親水性ポリマーの例としては、特開昭５８−１７１８６４号公報および特開昭６０−１０８７５３号公報等に開示されているゼラチン（例、酸処理ゼラチン、脱イオンゼラチン等）、ゼラチン誘導体（例、フタル化ゼラチン、ヒドロキシアクリレートグラフトゼラチン等）、アガロース、プルラン、プルラン誘導体、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン等をあげることができる。

試薬層は架橋剤を用いて適宜に架橋硬化された層とすることができる。架橋剤の例として、ゼラチンに対する１,２−ビス(ビニルスルホニルアセトアミド）エタン、ビス（ビニルスルホニルメチル）エーテル等の公知のビニルスルホン系架橋剤、アルデヒド等、メタリルアルコールコポリマーに対するアルデヒド、２個のグリシジル基含有エポキシ化合物等がある。

試薬層の乾燥時の厚さは約１μｍから約１００μｍの範囲であることが好ましく、より好ましくは約３μｍから約３０μｍの範囲である。また試薬層は実質的に透明であることが好ましい。

展開層は、点着された体液を均一の拡散させる機能の他、体液中リパーゼの展開層中の基質との反応や中間生成物のその後の反応を行う機能などを有してよい。したがって、展開反応層とも表現される場合がある。
本発明では展開層に布製の展開層を用いることが好ましいが、ポリスルホン、アセチルセルロースからなる多孔質膜または、微小ビーズから形成する多孔質膜、ガラス繊維濾紙、濾紙など布以外の材質を使用することも可能である。

この布製の多孔性展開層としては特開昭５５−１６４３５６号公報、特開昭５７−６６３５９号公報等に記載の織物布地展開層（例：ブロード、ポプリン等の平織布地等）、特開昭６０−２２２７６９号公報等に記載の編物布地展開層（例：トリコット編布地、ダブルトリコット編布地、ミラニーズ編布地等）、特開平１−１７２７５３号公報に記載のアルカリエッチング液でエッチング処理した織物布地又は編物布地からなる展開層、等がある。好ましいものは編物布であり、特にトリコット編物が好ましい。布の材質としてはポリエステル、綿、ナイロン、絹、ビニロン、レーヨン、ポリアミド、アクリル、ウール、ポリプロピレン、麻等が用いられ、好ましいものはポリエステルである。展開層の厚さは５０〜４００μｍ程度、好ましくは２００〜３００μｍ程度が適当である。布の空隙率は２０〜９０％程度、好ましくは４０〜８５％程度である。

多孔性展開層に用いられる織物布地、編物布地は特開昭５７−６６３５９に記載のグロー放電処理またはコロナ放電処理に代表される物理的活性化処理を布生地の少なくとも片面に施すか、または特開昭５５−１６４３５６、特開昭５７−６６３５９等に記載の水洗脱脂処理、界面活性剤含浸又は親水性ポリマー含浸等の親水化処理、またはこれらの処理工程を適宜に組み合せて逐次実施することにより布地を親水化し、下側（支持体に近い側）の層との接着力を増大させることができる。

展開反応層として多孔性層を用いる場合、その多孔性媒体は繊維質であってもよいし、非繊維質であってもよい。繊維質材料としては、例えば濾紙、不織布、織物布地（例えば平織布地）、編物布地（例えばトリコット編物布地）、ガラス繊維濾紙等を用いることができる。非繊維質材料としては、特開昭４９−５３８８８等に記載の酢酸セルロース等からなるメンブランフィルター、特開昭４９−５３８８８、特開昭５５−９０８５９（対応米国特許４，２５８，００１）、特開昭５８−７０１６３（対応米国特許４，４８６，５３７）等に記載の無機物又は有機物微粒子からなる連続空隙含有粒状構造物層等のいずれでもよい。特開昭６１−４９５９（対応欧州公開ＥＰ０１６６３６５Ａ）、特開昭６２−１１６２５８、特開昭６２−１３８７５６（対応欧州公開ＥＰ０２２６４６５Ａ）、特開昭６２−１３８７５７（対応欧州公開ＥＰ ０２２６４６５Ａ）、特開昭６２−１３８７５８（対応欧州公開ＥＰ０２２６４６５Ａ）等に記載の部分接着された複数の多孔性層の積層物も好適である。

展開層への試薬添加のためには、展開層を形成させた後、反応試薬を塗布等の手段により添加してもよく、また、例えば紙、布、高分子からなる多孔質膜等に本発明の試薬を予め含浸又は塗布した後、支持体上に設けた他の水浸透性層の上に、特開昭55-164356 号のような方法で接着させるのも有用な方法である。

多孔性層は供給される液体の量にほぼ比例した面積に液体を展開する、いわゆる計量作用を有する展開層であってもよい。この機能の制御には、界面活性剤と親水性バインダーの使用が有用である。

本発明の乾式分析要素には上記以外の層も設けることができる。例えば、光遮蔽層、吸水層、接着層等である。

本発明で採用している測定反応系は、測定対象であるリパーゼによって基質であるジグリセリドまたはトリグリセリドが分解して生成するモノグリセリドをモノグリセリドリパーゼで分解する。このグリセロールをグリセロールキナーゼによってＬ−α−グリセロリン酸とし、Ｌ−α−グリセロリン酸をＬ−α−グリセロリン酸オキシダーゼによってジヒドロキシアセトンリン酸に変えるとともに過酸化水素を発生させ、この過酸化水素によりペルオキシダーゼの作用で発色色素を発色させるものである。

基質はジグリセリドまたはトリグリセリドを使用する。好ましくは天然の膵リパーゼ基質であるトリグリセリドである。ジグリセリドは、血液中のリポプロテインリパーゼなどの非膵リパーゼやエステラーゼの活性が高いため膵リパーゼへの特異性が低下しやすく、またモノグリセリドリパーゼにわずかながら反応し分析のバックグランドが高くなる弊害が生じやすいためである。

トリグリセリドは、３つのエステル位の全てに長鎖脂肪酸がエステル結合されているものである。膵リパーゼに選択性の高いものが好ましい。各長鎖脂肪酸は炭素数が１４〜２０程度、好ましくは１６〜２０程度であり、例えば、パルミチン酸、ステアリン酸等の飽和脂肪酸やオレイン酸、リノール酸、リノレン酸等の不飽和脂肪酸である。トリグリセリドの具体例としては、トリオレイン、トリシリスチン、トリパルミチン、トリステアリン、トリリノレチン、１−シリストジパルミチン、１−パルミトジステアリン、２−パルミトジステアリン、１−ステアロー２パルミト−３シリスチン等を挙げることができ、好ましいものは不飽和脂肪酸からなるトリグリセリドで、特に好ましいものはトリオレインである。飽和脂肪酸からなるトリステアリンは、作製したリパーゼ測定用乾式分析要素のリパーゼ反応性はトリオレインと比較し良好でなかった。

本発明の乾式分析要素に組み込まれる試薬系には、モノグリセリドリパーゼを加える。モノグリセリドリパーゼは、トリグリセリドおよびジグリセリドと実質的に反応せず、長鎖脂肪酸のモノグリセリドに反応するものが好ましい。特に好ましいのは、特開昭63-245672、特開平4-316500号公報に記載の、バチルス・ステアロサーモフィラスH-165由来のモノグリセリドリパーゼである。

グリセロールキナーゼはグリセロールとＡＴＰを反応させてＬ−α−グリセロリン酸（Ｌ−グリセロール−３−リン酸）とＡＤＰに変えるものであり、Ｍｇ²⁺、Ｍｎ²⁺等を補酵素としている。

Ｌ−α−グリセロリン酸オキシダーゼ（グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ）はＬ−グリセロリン酸を酸化してジヒドロキシアセトンリン酸に変えるとともに過酸化水素を発生させるものである。

この過酸化水素によりペルオキシダーゼの作用で発色させる発色系は乾式分析要素用として種々開発されており、そのなかから適宜選択して使用することができる。その多くはロイコ色素であり、代表的なものはｏ−トルイジンである。ジアリルイミダゾールロイコ色素が好ましいが、トリンダー試薬を使用することもできる。

本発明の乾式分析要素に組み込まれる試薬系には、また、本発明の測定対象は主に血液に含まれる膵リパーゼの反応性を高めるため、コリパーゼを加えることが好ましい。コリパーゼはブタ膵臓由来のコリパーゼが好ましい。また、膵リパーゼの活性を高め、膵リパーゼ以外のリパーゼ活性を軽減するため、デオキシコール酸やタウロコール酸を活性化剤として加えることによって、エステラーゼ、肝リパーゼ、リポプロテインリパーゼの影響を排除して、高い特異性で膵リパーゼを測定できる。

上記各試薬の含有量としては、トリグリセリドが０．１〜１５ｇ／ｍ²程度、好ましくは０．５〜１０ｇ／ｍ²程度、グリセロールキナーゼが０．５〜１００ＫＵ／ｍ²程度、好ましくは１〜１０ＫＵ／ｍ²程度、Ｌ−α−グリセロリン酸オキシダーゼが２〜２００ＫＵ／ｍ²程度、好ましくは５〜５０ＫＵ／ｍ²程度、ペルオキシダーゼが１〜２００ＫＵ／ｍ²程度、好ましくは５〜５０ＫＵ／ｍ²程度、モノグリセリドリパーゼが２〜１００ＫＵ／ｍ²程度、好ましくは３〜３０ＫＵ／ｍ²程度、発色色素が０．０５〜２．００ｇ／ｍ²程度、好ましくは０．１〜１．００ｇ／ｍ²程度、コリパーゼが0.010〜0.400ｇ／ｍ² （５〜２００ＫＵ／ｍ²）程度、デオキシコール酸が０．１〜１０ｇ／ｍ²程度が適当である。

ここで、モノグリセリドリパーゼは、好ましくは、8000U/ｍ²から1000U/ｍ²、さらに好ましくは6000U/ｍ²から2000U/ｍ²、最適には4300U/ｍ²から2000U/ｍ²である。モノグリセリドリパーゼは共役酵素であるものの、過剰量を添加することは好ましくない。ジグリセリドを基質に使用するとバックグランドが高くなることがある。また、トリグリセリドを基質として使用した場合でも、モノグリセリドリパーゼ量が多くなるに従い、血液中の一部のリポプロテインが反応し、測定誤差を生じる場合があるためである。

この試薬組成物は全てを試薬層又は展開層に含有させてもよく、また、両層に振り分けて含有させてもよく、一部を他の層に含有させてもよい。

本発明の乾式分析要素には、その他の試薬も加えることができる。このような試薬には緩衝剤、界面活性剤等がある。

本発明の乾式分析要素に含有させることができる緩衝剤の例としては、炭酸塩、ホウ酸塩、燐酸塩、トリス塩およびグッド（Ｇｏｏｄ）の緩衝剤などの公知の緩衝剤を挙げることができる。これらの緩衝剤は「蛋白質・酵素の基礎実験法」（梶尾武一他，南江堂，１９８１）等の公知文献を参考にして選択し、使用することができる。含有量は一体型多層分析要素で通常使用されている量と同程度でよく、約１００ｍｇ／ｍ²〜約５．０ｇ／ｍ²の範囲、好ましくは約５００ｍｇ／ｍ²〜約３．０ｇ／ｍ²の範囲である。

本発明の分析要素の展開層又は試薬層には、界面活性剤、例えばノニオン性界面活性剤を含有させることができる。親油基としてアルキル基、アルキルフェニル基、スチレン化フェニル基、ベンジルフェニル基、ソルビタンアルキル基など、親水基はポリオキシエチレン基、ポリグリセロール基、ポリオキシエチレンポリプロピレン重合体などを組み合わせた界面活性剤を用い、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレン分岐アルキルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、アルキルフェニルポリグリセリド等が挙げられる。具体的には、ポリオキシエチレントリデシルエーテル、ポリオキシエチレン分岐デシルエーテル、ポリオキシエチレンｐ−オクチルフェノニルエーテル、ポリオキシエチレンｐ−オクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンｐ−ノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ｐ−ノニルフェノキシポリグリシドール、オクチルグルコシド等がある。これらのノニオン性界面活性剤のうちでは、ポリオキシエチレントリデシルエーテル、ポリオキシエチレン分岐デシルエーテル、ｐ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール、ｐ−ノニルフェノキシポリエトキシエタノール、ｐ−ノニルフェノキシポリグリシドールなどが好ましい。ノニオン性界面活性剤を展開層に含有させることにより水性液体試料の展開作用（メータリング作用）がより良好になる。ノニオン性界面活性剤を試薬層に含有させることにより分析操作時に水性液体試料中の水が試薬層に実質的に一様に吸収されやすくなり、また展開層との液体接触が迅速にかつ実質的に一様になる。

また、展開層には親水性ポリマーも含有させることができる。この親水性ポリマーには、澱粉、セルロースおよびセルロース誘導体（メチル化セルロース、ヒドロキシエチル化セルロース、ヒドロキシプロピル化セルロース等）、アガロース、ゼラチン（例、酸処理ゼラチン、脱イオンゼラチン等）、ゼラチン誘導体（例、フタル化ゼラチン、ヒドロキシアクリレートグラフトゼラチン等）、アクリルアミド重合体、アクリルアミドと各種ビニル性モノマーとの共重合体、ビニルピロリドン重合体、ビニルピロリドンと各種ビニル性モノマーとの共重合体、アクリレート重合体およびアクリレートと各種ビニル性モノマーとの共重合体等を挙げることができる。上記親水性ポリマーのうちではビニルピロリドン誘導体とセルロース誘導体が好ましい。

好ましい製造方法を記す。支持体にゼラチン等のバインダーと界面活性剤を加え、製膜性を向上した水溶液である塗布液を塗布し乾燥することで、試薬層を作製する。展開層は、例えば、布やすでに形成された多孔質膜を展開層膜として用いる場合には、試薬層に水を付着させ一部可溶化したのち、必要なら加温しバインダーをさらに軟化させ、展開層膜と支持体上の試薬層に圧着し乾燥する。

従来、トリオレインをリパーゼ分析液や乾式分析具に添加する方法として使用されてきた水への分散法は、界面活性剤や保護コロイドで安定化されているとはいえ、試薬添加のタイミング、攪拌効率、液温の変動等によりグリセリド粒子径は安定せず、ロット内、ロット間のバラツキは大きく、精度がよいリパーゼ乾式分析具を製造するのは困難である。さらに、この分散や乳化には、高度で高価な分散装置が必要とされる。また、分散粒径が小さくならない限り、粒子の沈降が発生する。この沈降は、均一な分析具を作製するためには問題となる。

トリグリセリドやジグリセリドを界面活性剤の水溶液として可溶化して乾式分析具に添加する方法は、膵リパーゼだけでなく、非膵リパーゼやエステラーゼのこれらの基質への反応性を向上させることがあり、また、界面活性剤が共役酵素を失活させることがあるので、好ましくない。

そこで、トリオレイン等のグリセリド（リパーゼ基質）を低級アルコールまたはアセトンに溶解し、塗布性を向上させるために必要な場合はポリビニルピロリドン等のバインダーを加え粘度を調整する。低級アルコールまたはアセトンとしては、炭素数１〜６の低級アルコール系溶媒またはアセトンが好ましく、特にメタノール、エタノール、プロピルアルコール、アセトンが好ましく、特にエタノールが好ましい。テトラヒドロフラン、ジオキサン等のエーテル系溶剤の使用は好ましくない。この理由のひとつは、塗布性の向上、体液の展開性向上のために有用な、ポリビニルピロリドン等の水溶性ポリマーの溶解性が良好でないためである。クロロホルム、塩化メチレンは、グリセリドの溶解性がよいので有用であるが、近年、発ガン性等の環境毒性が問題になっているので使用には注意が必要で好ましくない。

上記グリセリドと溶剤の量比は、例えば、トリオレインをエタノールに溶解する場合、トリオレイン１ｇに対しエタノールは50〜300ｇが好ましい。より好ましくは、トリオレイン1ｇに対しエタノール100〜200ｇである。トリオレイン濃度が高いとエタノールに溶解しないため、均一なトリオレインの添加が困難になる。グリセリドの溶剤液の添加方法は、塗布または含浸が使用することができる。これらの添加方法の中で、ギーサーにより塗布し乾燥する工程が均一で効率の高い生産方法を与える。この工程において、乾燥は温風乾燥が好ましい。乾燥風は温度２０〜６０℃が好ましく、特に、２５〜４０℃が好ましい。露点は０℃から１０℃が好ましい。風量は0.5〜10ｍ/秒が好ましい。乾燥時間は溶剤が実質的に乾燥すればよく、一方、長時間の乾燥では、共役酵素が失活する場合があるので、１分から６０分が好ましい。複数の乾燥ゾーンを用い、それぞれのゾーンで、乾燥風の温度、露点、風速、風向、時間を制御し、良好な乾燥条件を設定することもできる。

塩化カルシウム（ＣａＣｌ₂）は、どの塗布液に添加してもよいがデオキシコール酸と反応して凝集物を形成する場合もあるので、また、エタノールに溶解するので、基質液に溶解して添加するのが好ましい。

有機溶剤に溶解しない反応試薬は、別途、水溶液として塗布により添加する。塗布適性、血液の展開性を向上させるために、バインダーおよび界面活性剤を加えると良い。ｐＨ緩衝剤、リパーゼ反応促進剤であるコリパーゼ、デオキシコール酸はこの液に加えるとよい。同様、塗布と乾燥により、展開層中に試薬を添加する。

反応試薬は、検体中のリパーゼが反応するとき、溶解・拡散することで反応に適した試薬環境を設定できればよいので、各試薬は、製造において基本的にどの層に加えてもよい。

試薬の添加方法は、均一な試薬量を設定できれば、含浸してもよく、またスプレーを用いてもよい。各層の作製順序は、均一で試薬が分解しない方法であればよい。場合によれば、支持体を使用せず、ガラス繊維濾紙や濾紙のような多孔質膜を使用し、上記の製造方法で作製することもできる。この場合も、基質を有機溶剤に溶解した液は、温風乾燥で乾燥することが好ましい。

本発明の一体型多層分析要素は、一辺約１０ｍｍから約３０ｍｍの正方形または、ほぼ同サイズの円形等の小片に裁断し特開昭５７−６３４５２号、特開昭５４−１５６０７９号、実開昭５６−１４２４５４号、実開昭５８−３２３５０号および特開昭５８−５０１１４４号各公報等に開示のスライド枠等に納めて分析スライドとして用いるのが製造、包装、輸送、保存および測定操作等の全ての観点で好ましい。

本発明の一体型多層分析要素は、前述の諸公報に開示の方法に従い約５μｌから約３０μｌ、好ましくは約８μｌから約１５μｌの水性液体試料を多孔性展開層に点着供給し、必要に応じて約２０℃から約４５℃の範囲の実質的に一定の温度でインキュベーションの後に、光透過性支持体側から一体型多層分析要素内の色変化、発色等の検出可能な変化を反射測光し比色法の原理により液体試料中の測定対象成分を分析する。

以下の実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。

実施例１：トリオレインを基質とする乾式分析要素の作製：
（１）グリセリン発色試薬の添加：
ゼラチン下塗りがされている厚さ180μｍのポリエチレンテレフタレート無色透明平滑フイルム上に下記の組成の試薬を水溶液として塗布、乾燥させたのち、続いて、水を均一供給し湿潤させ、その上に50デニール相当のポリエチレンテレフタレート紡績糸を36ゲージ編みしたトリコット編み物布地を軽く圧力をかけて積層し、乾燥温度２０℃でゼラチンを固めたのち、４５℃で乾燥させた。なお、pＨ緩衝剤PIPESを含む塗布液は1N-NaOH水溶液でpＨ6に調整したものを用いた。

ゼラチン 12 g/ｍ²
PIPES（同仁化学） 22 g/ｍ²
塩化マグネシウム（和光純薬工業）0.52 g/ｍ²
ATP−２ナトリウム塩（オリエンタル酵母）1.4 g/ｍ²
ポリオキシエチレントリデシルエーテルHLB14.8（第一工業製薬）0.55 g/ｍ²
ポリエチレンアルキル分岐デシルエーテルHLB15.9 （第一工業製薬）0.059 g/ｍ²
ロイコ色素 0.21 g/ｍ²
ワサビペルオキシダーゼ（東洋紡）14 KU/ｍ²
グリセロールキナーゼ（旭化成）3.8 kU/ｍ²
L-α-グリセロリン酸オキシダーゼ（旭化成）19 kU/ｍ²
１,２−ビス(ビニルスルホニルアセトアミド）エタン 3.3 g/ｍ²

（２）基質の添加：
上記の布地上に下記組成の試薬をエタノールに溶解し塗布し、乾燥温度32℃、露点０℃の風で、１５分間、温風乾燥させた。風速は0.5ｍ/分で1分、5ｍ/分で１５分であった。ここで、トリオレイン1.1ｇに対し、エタノールを175ｇ加えることで溶解した。

塩化カルシウム（和光純薬）0.18 g/ｍ²
ポリビニルピロリドンK90（ＢＡＳＦ社製）2.0 g/ｍ²
トリオレイン（95％、ICN-Biochemical）1.1 g/ｍ²

（３）リパーゼ反応補助剤の添加
さらに、下記試薬を水に溶解し、塗布、乾燥し、膵リパーゼ乾式分析要素を作製した。なお、pＨ緩衝剤HEPESを含む塗布液は1N-NaOH水溶液でpＨ8.0に調整したものを用いた。

HEPES（同仁化学） 6.1 g/ｍ²
デオキシコール酸ナトリウム（和光純薬） 4.6 g/ｍ²
タウロデオキシコール酸ナトリウム 1.5 g/ｍ²
メトロース 2.1 g/m2
モノグリセリドリパーゼ(旭化成) 4300 U/ｍ²
ブタコリパーゼ（ロシュ）0.051 g/ｍ²
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡）8500 U/ｍ²

（測定）
ヒトリパーゼ（旭化成ファーマ）を血清に添加した液１０μｌを実施例１で作製した膵リパーゼ乾式分析要素に点着し、37℃で加温し発色濃度の変化を調べた。測定装置は、市販の富士ドライケム５５００を用いた。測定の結果を図１に示す。膵リパーゼ濃度に依存し、発色反応が起きることが確認された。

実施例２：ジグリセリドを基質とする乾式分析要素の作製：
実施例１の実験において、基質の添加の部のトリオレインを、以下のように1,2-ジグリセリドに変更した以外は、実施例１と同様にして膵リパーゼ乾式分析要素を作製した。実施例２では、実施例１のアスコルビン酸オキシダーゼは添加しなかった。

（２）基質の添加：
上記の布地上に下記組成の試薬をエタノールに溶解し塗布し、乾燥温度32℃、露点０℃の風で、温風乾燥させた。
塩化カルシウム（和光純薬）0.18 g/ｍ²
ポリビニルピロリドンK90 2.0 g/ｍ²
1,2-ジリノイルグリセロール（旭化成ファーマ）1.1 g/ｍ²

（測定）
ヒトリパーゼ（旭化成ファーマ）を血清に添加した液１０μｌを実施例２で作製した膵リパーゼ乾式分析要素に点着し、37℃で加温し発色濃度の変化を調べた。測定装置は、市販の富士ドライケム５５００を用いた。測定の結果を図２に示す。図２の通り、トリオレインと同様に、ジグリセリドであるリノリルジグリセリドでも膵リパーゼによる発色が確認された。ただし、反応のバックグランド（７％ヒトアルブミン液での発色）が高い結果を得た。

実施例３．基質の溶剤、および乾燥条件の比較
基質の溶剤、および乾燥条件を調べるため、実施例１の実験のグリセリン発色試薬を添加した布ラミネートシートに、下記の通りの溶剤を加えた後（添加量は実施例１と同等）、すぐに、または３〜２０分室温に放置した後、乾燥方法として室温での真空乾燥と温風乾燥（実施例１と同等）を行い乾燥した。評価として、３mＭグリセリンの７％ヒトアルブミン液を１０μｌ点着し、37℃で加温し650nmの反射濃度を測定することで、グリセリンの色素への変換反応を測定した。測定装置は、市販の富士ドライケム５５００を用いた。

エタノールを溶剤として用い、温風乾燥と真空乾燥を比較した測定結果の一例を図３に示す。エタノールを使用した場合、真空乾燥では乾燥までの放置時間によりグリセリン発色反応が著しく劣化するのに対し、温風乾燥は少なくとも10分放置後乾燥しても影響が見られなかった。

表１に、実施可能な溶剤を使用したグリセリン発色試薬への影響を示す。エタノール、メタノール、イソプロピルアルコール、アセトンが使用でき、特に、エタノール、メタノールは、温風乾燥が好ましいことが示された。

実施例４；モノグリセリドリパーゼ（ＭＧＬＰ）量の軽減による乳び検体の影響の軽減
解析のため、実施例１で基質であるトリオレインを加えず、モノグリセリドリパーゼ量を下表の通り変更し、乾式分析要素を作製した。

（測定）
リパーゼをほとんど含まないイヌ乳び検体１０μｌを実施例３で作製した膵臓リパーゼ乾式分析要素に点着し、37℃で加温し発色濃度の変化を調べた。測定装置は、市販の富士ドライケム５５００を用いた。測定の結果を図４に示す。

結果は、明らかに、ＭＧＬＰが多すぎると、イヌ乳び検体での非リパーゼによる発色反応が見られ、リパーゼ活性測定を行う180〜300秒で緩やかなＯＤ上昇を起こし正誤差が発生することが確認された。ＭＧＬＰ添加量は８ｋＵ/ｍ²が好ましいことが確認された。

実施例５．トリステアリンを基質とする乾式分析要素の作製：
実施例１の基質トリオレインの代わりに、トリステアリンを使用し、基質液の成分の塗布量は以下に示した条件で、他は実施例１と同じ条件でリパーゼ測定用乾式分析要素を作製した。基質の溶剤は、実施例と同じくエタノールを用い、トリステアリン１．１４ｇに対しエタノール１７４ｇを加えたが、基質の溶解性が悪かったため懸濁液として塗布した。このため、塗布液の凝集を抑制するため、ポリビニルピロリドンK90は増やした。
塩化カルシウム（和光純薬）0.18 g/ｍ²
ポリビニルピロリドンK90（ＢＡＳＦ社製）10.0 g/ｍ²
トリステアリン（シグマ社）1.1 g/ｍ²

（測定）
ヒトリパーゼ（旭化成ファーマ）をイヌ血清に添加した液１０μｌを実施例４で作製した膵リパーゼ乾式分析要素に点着し、37℃で加温し発色濃度の変化を調べた。測定装置は、市販の富士ドライケム7000を用いた。測定の結果を図５に示す。膵リパーゼ濃度に依存し、発色反応が起きることが確認された。しかし、リパーゼの反応性はトリオレインより低かった。

実施例６．イヌ血清を用いる多検体相関
イヌ血清（Ｎ＝105）１０μｌを実施例１で作製した膵リパーゼ乾式分析要素に点着し、37℃で加温し３分から５分の２分間の発色濃度の変化からリパーゼ濃度を算出した。測定装置は、市販の富士ドライケム7000を用いた。対照法は、１，２−Ｏ−ジラウリルーｒａｃ−グリセロ−３−グリタル酸・レゾルフィンエステルを基質とする溶液法（ロシュ社）を用いた。結果を図６に示す。Ｒ＝0.95と良好であった。

実施例７．同時再現性の測定
実施例１で作製した膵リパーゼ乾式分析要素にイヌ血清１０μｌをＮ＝20で点着し、37℃で加温し３分から５分の２分間の発色濃度の変化からリパーゼ濃度(U/L)を算出し、同時再現性（ＣＶ）、標準偏差（ＳＤ）を求めた。測定装置は、市販の富士ドライケム7000を用いた。結果を表３に示すが、良好な結果を得た。

図１は、実施例１のスライドの膵リパーゼ液の反応タイムコースを示す。 図２は、実施例２で作製したトリオレイン、リノリルジグリセリドを使用したリパーゼ分析要素に、500U/Lのヒト膵リパーゼ液（7％ヒトアルブミン液に溶解、○）、と７％ヒトアルブミン液（●）を10μｌ点着し、37℃で加温し650nmで測定した場合の反応タイムコースを示す。 図３は、エタノール液をグリセリン発色系を含む乾式分析要素に添加した後、図に記載の一定時間（０〜２０分）室温で静置後、真空乾燥（左図）および温風乾燥（右図）することで処理し、３ｍＭグリセリンを１０μｌ点着し、３７℃で加温しつつ、６５０ｎｍの反射ＯＤを測定した結果を示す。 図４は、モノグリセリドリパーゼ（ＭＧＬＰ）量の軽減による乳び検体の影響を調べた結果を示す。 図５は、トリステアリンを基質として使用した結果を示す。 図６は、実施例１の乾式分析要素の、イヌ血清を用いた多検体相関を示す。対照法は、１，２−Ｏ−ジラウリルーｒａｃ−グリセロ−３−グリタル酸・レゾルフィンエステルを基質とする溶液法（ロシュ社）を用いた。

Claims (15)

1. 炭素数14から20の長鎖アルキル脂肪酸のジグリセリドまたはトリグリセリド、モノグリセリドリパーゼ、及びグリセリン測定試薬を含有する少なくとも１つ以上の展開層または試薬層を含む体液中の膵リパーゼ測定用乾式分析要素の製造方法において、低級アルコールまたはアセトンに溶解したグリセリドを上記展開層または試薬層に添加して乾燥する工程を含むことを特徴とする、上記乾式分析要素の製造方法。
2. グリセリドの乾燥方法が温風乾燥である、請求項１に記載の乾式分析要素の製造方法。
3. グリセリドが、メタノール、エタノール、プロピルアルコールまたはアセトンに溶解されている、請求項１又は２に記載の乾式分析要素の製造方法。
4. グリセリドがトリグリセリドである、請求項１から３の何れかに記載の乾式分析要素製造方法。
5. トリグリセリドがトリオレインである、請求項１から４の何れかに記載の乾式分析要素の製造方法。
6. モノグリセリドリパーゼがバチルス・ステアロサーモフィラスH-165由来のモノグリセリドリパーゼである、請求項１から５の何れかに記載の乾式分析要素の製造方法。
7. グリセリン測定試薬が、グリセロールキナーゼとグリセロリン酸オキシダーゼと発色試薬を含むことを特徴とする、請求項１から６の何れかに記載の乾式分析要素の製造方法。
8. 乾式分析要素の構成が、水不透過性支持体と試薬層と展開層からなる、請求項１から７の何れかに記載の乾式分析要素の製造方法。
9. 展開層が、布または多孔質膜からなるものである、請求項１から８の何れかに記載の乾式分析要素の製造方法。
10. 多孔質膜が、ポリスルホンもしくはアセチルセルロースからなる多孔質膜、または微小ビーズから形成される多孔質膜である、請求項９に記載の乾式分析要素の製造方法。
11. 展開層が、布からなるものである、請求項９に記載の乾式分析要素の製造方法。
12. モノグリセリドリパーゼの添加量が8000U/m²から1000U/m²である、請求項１から１１の何れかに記載の乾式分析要素の製造方法。
13. 請求項１から１２の何れかに記載の方法によって製造される、体液中の膵リパーゼ測定用乾式分析要素。
14. 請求項１から１２の何れかに記載の方法によって製造される体液中の膵リパーゼ測定用乾式分析要素に体液を適用して、該体液中の膵リパーゼを測定する方法。
15. 体液がイヌ血液である、請求項１４に記載の体液中の膵リパーゼを測定する方法。