JP3718242B2 - テトラゾリウム塩指示薬を含有する診断用試験片の調製 - Google Patents

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
テトラゾリウム塩、たとえば２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−フェニルテトラゾリウム（ＩＮＴ）は、等濃度のＮＡＤＨにより、そのテトラゾリウム陽イオンの還元によって、比色法により還元が正確に測定され得る、相当するホルマザンに変換させ得る被検体の測定に有効である。
【０００２】
体液中の、グルコースのような被検体の濃度を測定するための典型的な試薬系は、還元的化学反応を基礎として構成されている。その試薬系において、主要な成分は、ヘキソキナーゼ（ＨＫ）、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ−６−ＰＤＨ）、ジアホラーゼ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）および指示薬としてのテトラゾリウム塩である。反応工程の中で、ヘキソキナーゼは、例えばグルコースのような被検体およびマグネシウムのような酵素活性剤の存在下において、リン酸ラジカルがＡＴＰから離れ、それによりＡＴＰをアデノシンニリン酸に変換し、結果としてＮＡＤおよびＧ−６−ＰＤＨの存在下において酸化されるグルコース−６−リン酸を形成し、それによりＮＡＤをＮＡＤＨに還元する、という反応を促進させる。電子受容体としてのジアホラーゼの存在下に、ＮＡＤＨは、無色のテトラゾリウム塩を、有色の対応するホルマザンに還元する。それにより、ＮＡＤＨの検出にとって直接的に定量的な、またその存在がＮＡＤＨへのＮＡＤの還元のきっかけとなる被検体にとって、間接的に定量的な検出可能な応答が得られる。
【０００３】
テトラゾリウム塩指示薬は一般に、色発生段階において、ジアホラーゼもしくは化学的媒介物を用いている乾燥試薬組成物と共に使用される。指示薬の適切な量は、グルコースのような被検体の試薬系中への流入から生じる、ある当量の還元性物質を完全に消費する適当量存在していなくてはならない。
【０００４】
米国特許３，６５５，３８２号公報には、対陰イオンが塩化物イオン、ヨウ化物イオン、臭化物イオン、チオシアン酸イオン、チオ硫酸イオン、硫酸イオン、パラトルエンスルホン酸イオン、硫酸メチルイオン、硫酸エチルイオン、硝酸イオン、酢酸イオン、過塩素酸イオン、過ホウ酸イオン、亜硫酸イオン、または炭酸イオンであるテトラゾリウムおよびチアゾリウム塩が開示されている。
【０００５】
米国特許４，２２１，８６４号において特許権者らは、自身の発明の目的のひとつは、テトラゾリウム化合物を含有する、顕著な光感受性を示す写真材料を提供することであると述べている。彼らは、これおよび他の目的は、支持体、並びに支持体上に塗布された少なくとも１の光感受性ハロゲン化銀層および親水性のコロイド状の層であって、これらの１の層はテトラゾリウム塩を含有する層を含む写真材料を調製することにより達成され得ると指摘している。彼らは、テトラゾリウム化合物の塩を非拡散性成分として用いる場合に、このような塩は、テトラゾリウム陽イオンと、選択された化合物を非拡散性にさせ得る陰イオンとを反応させることによって合成され得ると指摘している。高級アルキルベンゼンスルホン酸に由来する、たとえばドデシルベンゼンスルホン酸や、高級硫酸アルキルに由来する、たとえばラウリル硫酸塩が開示されている。
【０００６】
同時係属米国出願０７／８９８，３１７号には、予想外にも極性溶媒に対して高い溶解性を示すテトラゾリウム化合物のスルホン酸塩およびホスホン酸塩が開示されている。この出願にはまた、最初にテトラゾリウム指示薬化合物のベンゼンスルホン酸塩のメタノール溶液に基体を浸し、その後アデノシン三リン酸水溶液を接触させることによる試験片の製造が開示されている。
【０００７】
本発明は、指示薬としてのテトラゾリウム塩を分散させた、基体としてのマトリックス材料と、装置を所定の被検体を含む溶液に接触させるとき、テトラゾリウムを、相当するホルマザンに変える試薬系を含む診断装置の調製法である。この方法は、
ａ）マトリックスを、有機溶媒に溶解したテトラゾリウム塩を含有する溶液に接触させ、マトリックスを乾燥させ、それによりその中にテトラゾリウム塩が均一に分散したマトリックスを得る工程；および
ｂ）テトラゾリウム塩が均一に分散したマトリックスを、５〜７直鎖炭素原子のアルキルスルホネートを含む試薬系の水溶液に接触させ、マトリックスを乾燥させ、それによりそこから有意な量のテトラゾリウム塩を溶離させることなくマトリックス上に試薬系を沈着させ、テトラゾリウム塩と試薬系がその中に均一に分散したマトリックスを得る工程を含む方法である。
【０００８】
本発明における使用に好適なテトラゾリウム塩は、式：
【０００９】
【化２】

【００１０】
（式中、Ｘ^- は、例えば塩化物イオン、臭化物イオンまたはヨウ化物イオンのような対陰イオンである）で示される。典型的には、Ｒ¹ およびＲ³ はフェニル基であり、Ｒ² はフェニルまたは２−チアゾリル基である。フェニル基および場合によってチアゾリル基は、置換または非置換され得る。より明確には、Ｒ¹ 、Ｒ³ および場合によってＲ² は、式：
【００１１】
【化３】

【００１２】
〔式中、それらが同一または異なっているＹ基（Ｙ¹ 、Ｙ² 、Ｙ³ 、Ｙ⁴ ）は、例えばアルコキシ、アリールオキシ、アルキル、アミド、アルキルアミド、アリールアミド、アルキルチオ、アリールチオ、ハロ、水素、ヒドロキシ、カルバモイル、カルバルコキシ、カルボキシル、シアノ、ニトロ、スルホ、スルホンアミド、スルファモイル、トリアルキルアンモニオまたはウレイド基である〕で示されるが、この式に限定されるものではない。好ましくは、アルキル基はそれぞれ１〜６炭素原子を含み、アリール基はフェニル、ナフチル、ピリジル、オキサゾリル、キノリル、チアゾリル、チエニルおよびフラニル基である。
【００１３】
Ｒ² がチアゾリル基である場合、それは置換または非置換され得る。例えば、チアゾリル基は式：
【００１４】
【化４】

【００１５】
（式中、Ｒ⁴ およびＲ⁵ は水素または何れかの別の置換基である）で示される。本発明の好適な実施態様においては、テトラゾリウム塩のＲ¹ およびＲ³ 部分は上述の通りであり、またＲ² は、Ｒ⁴ とＲ⁵ が一緒になって、置換または非置換されているベンゾ環を形成するチアゾリル基である。または、Ｒ⁴ はカルボキシル、カルバルコキシ、カルバモイルもしくはシアノ基であり、Ｒ⁵ は、アルキルもしくはクロロ基である。または、Ｒ⁴ はアルキルもしくはアリール基であり、Ｒ⁵ は、カルボキシル、カルバルコキシ、カルバリールオキシ、カルバモイルもしくはシアノ基である。または、Ｒ⁴ はジもしくはトリフルオロアルキル基であって、そのフルオロ置換基がチアゾリル残基に隣接する炭素上にある基である。または、Ｒ⁴ とＲ⁵ の両方もしくは一方が、置換もしくは非置換されたフェニル基であり、一方のみが置換されたフェニル基である場合、他は水素もしくはアルキル基である。これらテトラゾリウム陽イオンの中で、本発明において特に有益なものは、Ｒ⁴ とＲ⁵ が一緒になってベンゾ環を形成し、式：
【００１６】
【化５】

【００１７】
で示される基を有するベンズチアゾリル残基を与えるべく、置換または非置換され得るテトラゾリウム陽イオンである。式中、（ｉ）Ｒ⁶ とＲ⁷ 、Ｒ⁷ とＲ⁸ 、またはＲ⁸ とＲ⁹ は一緒になって、アルコキシ、アリールオキシ、アルキル、アミド、アルキルアミド、アリールアミド、アルキルチオ、アリールチオ、アミノ、カルバモイル、カルバルコキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシル、スルホ、スルホンアミド、スルファモイル、トリアルキルアンモニオもしくはウレイド基で置換もしくは非置換されているベンゾまたはシクロヘキシル環である。上記中、Ｒ⁷ とＲ⁸ が一緒になってベンゾまたはシクロヘキシル環を形成し、Ｒ⁶ が水素でない場合には、同一または異なっていてもよいその他の置換基は、水素、アルコキシ、アリールオキシ、アルキル、アミド、アルキルアミド、アリールアミド、アルキルチオ、アリールチオ、アミノ、カルバモイル、カルバルコキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシル、スルホ、スルホンアミド、スルファモイル、トリアルキルアンモニオもしくはウレイド基である。または、（ｉｉ）Ｒ⁶ 、Ｒ⁷ 、Ｒ⁸ およびＲ⁹ の１以上は、いずれかが水素である場合には、アルコキシ、アリールオキシ、アルキル、アミド、アルキルアミド、アリールアミド、アルキルチオ、アリールチオ、アミノ、カルバモイル、カルバルコキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシル、スルホ、スルホンアミド、スルファモイル、トリアルキルアンモニオもしくはウレイド基等である。
【００１８】
本発明において使用される適当なマトリックス材料は、当該技術分野において公知であり、吸着紙、織布および不織布、ガラス繊維フィルタ、並びに高分子膜およびフィルムを含む。好ましいマトリックス材料は、０．４５〜０．８μの範囲である孔径を有する両性イオン帯電ナイロン布を含む。フィルタ紙、吸収性ガラス繊維フィルタまたは合成不織布のような、吸収性または膨張可能な担体に、テトラゾリウム塩／有機溶媒溶液を含浸させ、または吹き付ける。その後乾燥させ、マトリックスを試薬系の水溶液で処理し、再び乾燥させ、診断試験装置を得る。この装置は、適当な被検体を含む溶液に接触させると、テトラゾリウム塩が有色の、対応するホルマザンに変わることにより検出可能な応答を供給するだろう。
【００１９】
テトラゾリウム塩は、典型的にはほとんど水に溶けず、それゆえマトリックス材料上へのそれの沈着のためには有機溶媒の使用が必要とされる。好適な有機溶媒は、例えばメタノールやアセトンを含む。典型的に、濃度が５０〜１００mM、好ましくは７０〜９０mMの範囲のテトラゾリウム塩溶液が、マトリックス材料基材上へのテトラゾリウム塩の沈着のために用いられる。
【００２０】
試薬系は、典型的には、例えばヘキソキナーゼ（ＨＫ）やグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼのような１以上の酵素、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、マグネシウムのような補因子、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドのような酸化剤およびジアホラーゼのような電子受容体を含む。反応工程において、ヘキソキナーゼは、リン酸ラジカルがＡＴＰから離れ、ＮＡＤとグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼの存在下で酸化されるグルコース−６−リン酸を形成し、それによりＮＡＤをＮＡＤＨに還元する反応を促進する。電子受容体としてのジアホラーゼの存在下に、ＮＡＤＨは、無色のテトラゾリウム塩を、激しく色づいたホルマザン塩に還元する。以下の式で示される反応工程は、試験試料中のグルコース濃度を測定する間接的な手段として、ＮＡＤＨの測定を示す。
【００２１】
【化６】

【００２２】
試薬系成分において、代わりとなる酵素は、グルコースデヒドロゲナーゼを含む。グルコース以外の被検体、例えばコレステロールまたはトリグリセリドの存在または濃度を知るときには、特定の被検体または反応生成物にとって選択的な酵素が使用される。
【００２３】
試薬系は水溶液からマトリックスに塗布される。グルコース検出のための装置の調製にとっての典型的な実施において、溶液は以下の濃度を有する試薬を含む。
【００２４】
【表１】

【００２５】
加えて、試薬系は、色安定剤としてポリビニルアルコールおよび／またはカルボキシメチルセルロースのようなポリマー、ＨＥＰＥＳのような緩衝剤、酵素安定剤として牛血清アルブミンおよび外部からのいかなるラクテートデヒドロゲナーゼをも抑制するオキサミン酸を含有し得る。加えて、表面活性剤が、マトリックスへの試薬系の塗布を容易にするために求められる。理想的には、表面活性剤は以下の特性を示す。
【００２６】
１．乾燥したテトラゾリウムを含有するマトリックスの表面張力を下げることによって、マトリックス中への試薬系の素早いぬれをもたらす。
２．熱負荷後の膜のぬれ特性を維持する、すなわち診断装置の貯蔵寿命中、再水和における試薬系のぬれ能力を維持する。
３．水溶性含浸溶液中へ、指示薬の抽出をもたらさない。
【００２７】
種々の表面活性剤を試みたなかで、５〜７炭素原子のアルキルスルホネートのみがこれらすべての特性を持つことが分かった。ヘキサンスルホネートは、この点では特に有効である。試薬系組成物において、表面活性剤としてこれらアルキルスルホネートを用いることは、これら表面活性剤の大きさと親水性のために、かなり水層への乾燥した指示薬の浸出を防止することが分かった。これは、Ｃｒｏｄａ ＦＯＳ（リン酸化されたセチルエーテル）、Ｏｌｉｎ １０Ｇ（パラノニルフェノキシポリグリシドール）、Ｓｕｒｆｙｎｏｌ（３０モルのエチレンオキシドでエトキシ化されたテトラメチルデシンジオール）、Ｔｒｉｔｏｎ（オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）、Ｓｉｌｗｅｔ（ポリアルキレンオキシド変性ジメチルシロキサン）、メタンスルホネート、プロパンスルホネートのような短鎖アルキルスルホネートまたは８〜１０炭素原子を含む長鎖アルキルスルホネートのような他の表面活性剤では達成されなかった。ヘキサンスルホネートはまた、試薬系のぬれ特性をも高める。テトラゾリウム指示薬の逆抽出によってもたらされる問題、試薬系の乏しいぬれおよびロット間の変動をもまた最小にさせる。
【００２８】
式：
【００２９】
【化７】

【００３０】
で表されるヘキサンスルホネートは、市販されている。本発明の実施において、典型的に、０．５〜１．３％w/v 、好ましくは０．７〜１．１％w/v の量で、水溶性試薬系溶液に加えられる。最初にテトラゾリウム塩をマトリックスに含浸させ、蒸発によって有機溶媒を除去し、続いてヘキサンスルホネートぬれ試薬を含む水溶液を用いて色形成反応のための別の必須成分を含む試薬系を塗布することによって、マトリックスの再水和における試薬系の再ぬれ能力を確保しつつ、水溶液中へのテトラゾリウム指示薬の逆抽出が実質的に防止される。
本発明を、更に以下の実施例により説明する。
【００３１】
実施例Ｉ
テトラゾリウム指示薬である、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−フェニルテトラゾリウムクロリド（ＩＮＴ）または２、２’、５、５’−テトラフェニル−３、３’（３、３’−ジメトキシ−４、４’−ジフェニレン）ジテトラゾリウムクロリド（ＮＢＴ）を、メタノール溶液または５０部メタノール／５０部ジメチルホルムアミドに、濃度が８０mMになるよう溶かした。その溶液を、紙または膜（例えば、Pall Biodyne A membrane ）のような固形支持体上に含浸させ、約１０分間５０℃のオーブン中で乾燥させた。乾燥した指示薬マトリックスを、その後酵素、基質および表面活性剤（ヘキサンスルホネートおよび比較のために他の表面活性剤）を含有する水溶液に含浸させ、含浸させた支持体を再び乾燥させた。含浸混合物中の試薬濃度は以下の通りである。
【００３２】
試験１（ヘキソキナーゼを用いたグルコース試薬）
５．５％(w/w) テトラゾリウム指示薬
４％(w/w) ｐＨ７．５のＨＥＰＥＳ緩衝剤
２％(w/w) ＮＡＤ
６％(w/w) ＡＴＰ
１％(w/w) 表面活性剤
１％(w/w) Ｍｇ²⁺
２５００単位／mL ヘキソキナーゼ
１０００単位／mL グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ
８００単位／mL ジアホラーゼ
３％(w/w) 不活性成分
【００３３】
試験２（グルコースデヒドロゲナーゼを用いたグルコース試薬）
３．５％(w/w) テトラゾリウム指示薬
４％(w/w) ｐＨ７．５のＨＥＰＥＳ緩衝剤
２％(w/w) ＮＡＤ
１％(w/w) 表面活性剤
２０００単位／mL グルコースデヒドロゲナーゼ
８００単位／mL ジアホラーゼ
３％ 不活性成分
【００３４】
試験３（コレステロール試薬）
１．５％ 塩酸テトラメチルベンジジン指示薬
４％ ｐＨ７．０のＰｉｐｅｓ緩衝剤
２４０単位／mL ペルオキシダーゼ
２４０単位／mL コレステロールエステラーゼ
１２０単位／mL コレステロールオキシダーゼ
１％ 表面活性剤
３％ 不活性成分
【００３５】
試験４（トリグリセリド試薬）
１．１％ テトラゾリウム指示薬
２．４％ ｐＨ７．５のＨＥＰＥＳ緩衝剤
０．７％ Ｍｇ²⁺
２．７％ ＡＴＰ
７．１％ ＮＡＤ
２５０００単位／mL リパーゼ
８００単位／mL グリセロールキナーゼ
１０００単位／mL グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ
５００単位／mL ジアホラーゼ
１％ 表面活性剤
１．５％ 不活性成分
【００３６】
第２の含浸溶液（すなわち、水溶性媒体）中へ逆抽出した指示薬の量を測定するために、含浸中５分ごとに溶液から試料を採取した。そして、溶液中の指示薬の濃度をＨＰＬＣで測定した。
【００３７】
貯蔵寿命末期における試薬の性能を評価するために、高温下（典型的には６０℃）で、急速な負荷を与えた。特に、試薬が貯蔵寿命末期に達したときに乾燥試薬の素早い戻しを担保するために、表面活性剤をたびたび乾燥試薬組成物に加えた。典型的に、表面活性剤のない試薬は、再水和においての乏しいぬれが原因で熱負荷を生じた後、低下した量に対する応答および乏しい精度を示した。ヘキサンスルホネートのような表面活性剤を含む試薬では、熱負荷後も試薬性能において変化はなかった。しかしながら、この点に関し、すべての表面活性剤がヘキサンスルホネートと同様の成果を挙げたわけではなかった。試験１の組成物を用いて試薬性能における種々の表面活性剤の影響を調べ、その結果を表１に示した。
【００３８】
【表２】

【００３９】
実施例ＩＩ
ヘキサンスルホネート、ペンタンスルホネート、Ｃｒｏｄａ ＦＯＳまたはＯｌｉｎ １０Ｇを用いて調製された試薬では、負荷後の量に対する応答において著しい変化を示さなかった。しかしながら、ベンゼンスルホネート、Ｔｒｉｔｏｎ、ＳｉｌｗｅｔまたはＳｕｒｆｙｎｏｌを用いて調製された試薬は、熱負荷後に著しく減少した反応性を示した。最適な試薬反応性維持を示した表面活性剤である、Ｃｒｏｄａ ＦＯＳまたはＯｌｉｎ １０Ｇは、これらの表面活性剤の使用で直面するひどい逆抽出のため、テトラゾリウム指示薬と共に使用することは好ましくない。ヘキサンスルホネートと比較して、Ｃｒｏｄａ ＦＯＳまたはＯｌｉｎ １０Ｇによってもたらされたテトラゾリウム指示薬の逆抽出は、試薬含浸工程の間、ヘキサンスルホネートを用いて直面するそれの３〜４倍ひどかった。図１にこれを示す。第２の含浸溶液に使用した表面活性剤（ヘキサンスルホネート、Ｃｒｏｄａ ＦＯＳまたはＯｌｉｎ １０Ｇ）のうちいずれが最悪の指示薬の逆抽出をもたらすかを調べるために、これら表面活性剤を各々１％含有した３種の含浸溶液を、上記のように作成した。これらの溶液を、あらかじめ２−（４−ジフルオロメチル−５−クロロチアゾル−２−イル）−３−（３、４、５−トリメトキシフェニル）−５−（３、４−メチレンジオキシフェニル）テトラゾリウム塩を含浸させたナイロン基体、すなわちＰａｌｌ Ｂｉｏｄｙｎｅ Ａに含浸させた。第２の塗布溶液の試料を、第２の含浸開始後０、５、１０、２０分において採取した。そして、ＨＰＬＣを使用して、テトラゾリウム指示薬の濃度を測定した。図１に示すデータは、第２の含浸操作の間、第２の含浸溶液中へ逆抽出した指示薬の量を示している。
【００４０】
実施例ＩＩＩ
第２の含浸溶液中に、１％の各種有機スルホネート（メタン、プロパン、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、デカンおよびベンゼン）を有する試薬を調製した。そして、最初の含浸によるテトラゾリウム指示薬を含有するナイロン基材に、これを塗布した。第２の含浸溶液の大部分は、有機スルホネート添加後も透明のままであったが、メタン−、オクタン−およびデカンスルホネートの場合は、有機スルホネートによる酵素の沈殿により、濁りを生じた。乾燥した試薬の薬応答を、血漿グルコース濃度を５０、１００、２５０、４５０および６００mg/dL に調整した、解糖された４０％ヘマトクリット全血を用いて測定した。１試料あたり２０回の反復実験を、試薬反応性を計算するために用いられる、終点反射率を持つ５台の市販の反射率型グルコースメーター上で行った。種々の有機スルホネートを含む試薬の性能を、４０％ヘマトクリット全血サンプルを用いて評価した。その結果は、ペンタンスルホネート、ヘキサンスルホネートまたはヘプタンスルホネートを含有する試薬は高い反応性を示し（図２）、また熱負荷後にも優れた安定性を示した（表１）。短鎖（例えば、メタンスルホネートやプロパンスルホネートのようなＣ５未満のもの）、または長鎖（例えば、オクタンスルホネートやデカンスルホネートのようなＣ７を越えるもの）のアルキルスルホネートは、含浸の間、酵素を沈殿させ結果的に反応性を低下させるか、最終生成物の熱負荷に対する抵抗性を低下させる。
【００４１】
図２に示された結果が赤血球と試薬化学組成物との相互作用によらないことを証明するために、グルコース液体対照試料でもまたその試薬を試験した。これらの試験は、血液試料で観察された結果と同じ結果を示した。
【図面の簡単な説明】
【図１】含浸溶液中への指示薬の逆抽出における種々の表面活性剤の影響を示した図である。
【図２】試薬反応性において有機スルホネートの影響を示した図である。

Claims (11)

1. 指示薬／試薬系をマトリックス担持体に塗布する方法において、該試薬系が、ヘキソキナーゼを用いたグルコース試薬、グルコースデヒドロゲナーゼを用いたグルコース試薬、コレステロール試薬及びトリグリセリド試薬からなる群から選択され、該指示薬は、該試薬系と所定の被検体の存在下でレドックス反応を受け、それにより有色のホルマザンに還元されるテトラゾリウム塩を含み、該方法は、
   ａ）該マトリックスを、有機溶媒中に該テトラゾリウム塩を含む溶液と接触させ、該マトリックスを乾燥させ、それにより該テトラゾリウム塩がその中に均一に分散したマトリックスを得る工程；および
   ｂ）該テトラゾリウム塩がその中に均一に分散した該マトリックスを、５〜７直鎖炭素原子のアルキルスルホネートを含有する、該試薬系の水溶液と接触させ、該マトリックスを乾燥させ、それによりそこから有意な量の該テトラゾリウム塩を溶離することなく、該試薬系を該マトリックス上に沈着させ、その中に該テトラゾリウム塩と該試薬系が均一に分散したマトリックスを得る工程を含む方法。
2. 該試薬系が、ヘキソキナーゼ、アデノシン三リン酸、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチドからなる群から選択される１種以上の試薬を含む、請求項１記載の方法。
3. 該テトラゾリウム塩が、式：
   

   

   （式中、Ｘ^- は対陰イオンであり、Ｒ¹ とＲ³ は置換または非置換されたフェニル基であり、Ｒ² は置換または非置換されたフェニルまたは２−チアゾリル基である）で示される請求項１記載の方法。
4. 該マトリックス材料が吸収紙、織布もしくは不織布、ガラス繊維フィルタ、または高分子膜もしくはフィルムである請求項１記載の方法。
5. 該マトリックス材料が０．４５〜０．８μの範囲である孔径を有する多孔性の両性イオン帯電ナイロン布である請求項４記載の方法。
6. 該アルキルスルホネートが、０．５〜１．３％w/v の濃度で溶液内に存在する請求項１記載の方法。
7. 該アルキルスルホネートが、０．７〜１．１％w/v の濃度で溶液内に存在する請求項６記載の方法。
8. 指示薬／試薬系を、多孔性の両性イオン帯電ナイロン布のマトリックス担持体に塗布する方法において、該試薬系が、ヘキソキナーゼを用いたグルコース試薬、グルコースデヒドロゲナーゼを用いたグルコース試薬、コレステロール試薬及びトリグリセリド試薬からなる群から選択され、該指示薬は、レドックス反応を受けることができ、その結果該試薬系と所定の被検体の存在下で有色のホルマザンに還元されるテトラゾリウム塩を含み、該方法は、
   ａ）該マトリックスを、有機溶媒中に該テトラゾリウム塩を含む溶液と接触させ、該マトリックスを乾燥させ、それにより該テトラゾリウム塩がその中に分散したマトリックスを得る工程；および
   ｂ）該テトラゾリウム塩がその中に分散した該マトリックスを、５〜７直鎖炭素原子のアルキルスルホネートを含有する、該試薬系の水溶液と接触させ、該マトリックスを乾燥させ、それにより該マトリックスから該水溶液中に溶離する該テトラゾリウム塩の量を減少させながら、該試薬系を該マトリックス上に沈着させる工程を含む方法。
9. 該試薬系が、ヘキソキナーゼ、アデノシン三リン酸、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチドからなる群から選択される１種以上の試薬を含む、請求項８記載の方法。
10. 該アルキルスルホネートが、ヘキサンスルホネートであり、かつ、０．５〜１．３％w/v の濃度で水溶液中に存在する請求項８記載の方法。
11. 該ヘキサンスルホネートが、０．７〜１．１％w/v の濃度で水溶液中に存在する請求項１０記載の方法。

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