JPH08122331A - 両性電解質を含む乾式分析素子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 複数の水透過性層を有する乾式分析素子にお
いて各水透過性層に異なるｐＨを設定でき、それによっ
て各試薬成分を最適のｐＨに調整できる乾式分析素子を
提供する。 【構成】 支持体の上に少なくとも１層の水透過性の試
薬層と多孔性展開層がこの順に積層されている乾式分析
素子において、前記水透過性の試薬層、前記展開層又は
必要により設けられる少なくとも１層の水透過性層のい
ずれか少なくとも１層に両性電解質である水溶性多塩基
アミノカルボン酸が含有されていることを特徴とする乾
式分析素子。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、水性液体試料、特に血
液、髄液、リンパ液、唾液、尿等の生物体液の分析に適
する乾式分析素子に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】乾式分析素子は分析に必要な全て試薬が
積層シートに含まれており、被検試料を点着してインキ
ュベートするだけで被検成分（アナライト）を分析でき
るので最近急速に拡がっている分析手段である。

【０００３】この乾式分析素子は一般に多孔性展開層、
試薬層及び透明支持体の三層を基本構成とし、アナライ
トの種類等に応じ光遮蔽層、検出層、吸水層が更に追加
されてなっている。

【０００４】乾式分析素子に組み込まれる試薬組成物に
は反応至適ｐＨの異なる複数の成分が含まれていること
がある。例えば、特開平４−１５７３６３号公報に開示
されているクレアチニン分析用の分析素子にはクレアチ
ニンデイミナーゼとグルタミンデヒドロゲナーゼが組み
込まれており、この両酵素の至適ｐＨが異なっている。

【０００５】上記のような場合、両酵素を別々の層に含
有させてそれぞれの層のｐＨを各酵素の安定性と反応性
から最も好ましいｐＨに調整することが好ましい。とこ
ろが、厚さが全体で１ｍｍにも満たない薄い分析素子の
層の間で異なるｐＨを設定することは容易ではなく、特
に各層を水溶液あるいは水性懸濁液の形で塗布形成する
分析素子においては困難であった。そこで、乾式分析素
子の中の２つの異なる層のｐＨ値を予め定められた異な
る値に設定する場合には、１層を水溶液から塗布し、別
の１層を有機溶媒溶液から塗布して形成するなどの工夫
をして実現していた。あるいは、特開昭５９−１４３９
５９に記載のように、拡散しがたい高分子酸と拡散しが
たい高分子塩基を用いて乾式分析素子の中の２つの異な
る層のｐＨ値を予め定められた異なる値に設定すること
が行なわれていた。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】その結果、従来の分析
素子においては高価な酵素の添加量を増加せざるえず、
また、保存期間中の酵素の失活にも注意を払わなければ
ならなかった。

【０００７】本発明の目的は、複数の水透過性層を有す
る乾式分析素子において各水透過性層に異なるｐＨを設
定でき、それによって各試薬成分を最適のｐＨに調整で
きる乾式分析素子を提供することにある。

【０００８】本発明の他に目的は、複数の酵素を含有す
る乾式分析素子において酵素の添加量を減少できかつ保
存期間を延長できる乾式分析素子を提供することにあ
る。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明は上記目的を達成
した乾式分析素子を提供するものであり、かかる分析素
子は、支持体の上に少なくとも１層の水透過性の試薬層
と多孔性展開層がこの順に積層されている乾式分析素子
において、前記水透過性の試薬層、前記展開層又は必要
により設けられる少なくとも１層の水透過性層のいずれ
か少なくとも１層に両性電解質である水溶性多塩基アミ
ノカルボン酸が含有されていることを特徴としている。

【００１０】支持体としては、従来公知の乾式分析素子
に用いられている光透過性でかつ水不透過性出る支持体
を用いることができる。光透過性・水不透過性支持体の
例としては、ポリエチレンテレフタレート、ビスフェノ
ールＡのポリカルボネート、ポリスチレン、セルロース
エステル（例、セルロースジアセテート、セクロースト
リアセテート、セルロースアセテートプロピオネート
等）等のポリマーからなる厚さ約５０μｍから約１ｍ
ｍ、好ましくは約８０μｍから約３００μｍの範囲のフ
ィルムもしくはシート状の透明支持体を挙げる事ができ
る。

【００１１】支持体の表面には必要により下塗層を設け
て、支持体の上に設けられる試薬層と支持体との接着を
強固なものにすることができる。また、下塗層の代り
に、支持体の表面を物理的あるいは化学的な活性化処理
を施して接着力の向上を図ってもよい。

【００１２】支持体の上には（場合によっては下塗層等
の他の層を介して）試薬層が設けられる。試薬層は水性
液体中の被検成分と反応して光学的に検出可能な変化を
生じる後述の試薬組成物の少なくとも一部が親水性ポリ
マーバインダー中に実質的に一様に分散されている吸水
性で水浸透性の層である。この試薬層には指示薬層、発
色層なども含まれる。

【００１３】試薬層のバインダーとして用いることがで
きる親水性ポリマーは、一般には水吸収時の膨潤率が３
０℃で約１５０％から約２０００％、好ましくは約２５
０％から約１５００％の範囲の天然または合成親水性ポ
リマーである。そのような親水性ポリマーの例として
は、特開昭５８−１７１８６４号公報および特開昭６０
−１０８７５３号公報等に開示されているゼラチン
（例、酸処理ゼラチン、脱イオンゼラチン等）、ゼラチ
ン誘導体（例、フタル化ゼラチン、ヒドロキシアクリレ
ートグラフトゼラチン等）、アガロース、プルラン、プ
ルラン誘導体、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコ
ール、ポリビニルピロリドン等をあげることができる。

【００１４】試薬層は架橋剤を用いて適宜に架橋硬化さ
れた層とすることができる。架橋剤の例として、ゼラチ
ンに対する１，２−ビス（ビニルスルホニルアセトアミ
ド）エタン、ビス（ビニルスルホニルメチル）エーテル
等の公知のビニルスルホン系架橋剤、アルデヒド等、メ
タリルアルコールコポリマーに対するアルデヒド、２個
のグリシジル基含有エポキシ化合物等がある。

【００１５】試薬層の乾燥時の厚さは約１μｍから約１
００μｍの範囲であることが好ましく、より好ましくは
約３μｍから約３０μｍの範囲である。また試薬層は実
質的に透明であることが好ましい。

【００１６】上記試薬層の上に必要に応じて光遮蔽層を
設けることができる。光遮蔽層は、光吸収性または光反
射性（これらを合わせて光遮蔽性という。）を有する微
粒子が少量の被膜形成能を有する親水性ポリマーバイン
ダーに分散保持されている水透過性または水浸透性の層
である。光遮蔽層は試薬層にて発生した検出可能な変化
（色変化、発色等）を光透過性を有する支持体側から反
射測光する際に、後述する展開層に点着供給された水性
液体の色、特に試料が全血である場合のヘモグロビンの
赤色等、を遮蔽するとともに光反射層または背景層とし
ても機能する。

【００１７】光反射性を有する微粒子の例としては、二
酸化チタン微粒子（ルチル型、アナターゼ型またはブル
カイト型の粒子径が約０．１μｍから約１．２μｍの微
結晶粒子等）、硫酸バリウム微粒子、アルミニウム微粒
子または微小フレーク等を挙げることができ、光吸収性
微粒子の例としては、カーボンブラック、ガスブラッ
ク、カーボンミクロビーズ等を挙げることができ、これ
らのうちでは二酸化チタン微粒子、硫酸バリウム微粒子
が好ましい。特に好ましいのは、アナターゼ型二酸化チ
タン微粒子である。

【００１８】被膜形成能を有する親水性ポリマーバイン
ダーの例としては、前述の試薬層の製造に用いられる親
水性ポリマーと同様の親水性ポリマーのほかに、弱親水
性の再生セルロース、セルロースアセテート等を挙げる
ことができ、これらのうちではゼラチン、ゼラチン誘導
体、ポリアクリルアミド等が好ましい。なお、ゼラチ
ン、ゼラチン誘導体は公知の硬化剤（架橋剤）を混合し
て用いることができる。

【００１９】光遮蔽層は、光遮蔽性微粒子と親水性ポリ
マーとの水性分散液を公知の方法により試薬層の上に塗
布し乾燥することにより設けることができる。また光遮
蔽層を設ける代りに、後述する展開層中に光遮蔽性微粒
子を含有させてもよい。

【００２０】なお、試薬層の上に、場合によっては光遮
蔽層等の層を介して、後述する展開層を接着し積層する
ために接着層を設けてもよい。

【００２１】接着層は水で湿潤しているとき、または水
を含んで膨潤しているときに展開層を接着することがで
き、これにより各層を一体化できるような親水性ポリマ
ーからなることが好ましい。接着層の製造に用いること
ができる親水性ポリマーの例としては、試薬層の製造に
用いられる親水性ポリマーと同様な親水性ポリマーがあ
げられる。これらのうちではゼラチン、ゼラチン誘導
体、ポリアクリルアミド等が好ましい。接着層の乾燥膜
厚は一般に約０．５μｍから約２０μｍ、好ましくは約
１μｍから約１０μｍの範囲である。

【００２２】なお、接着層は試薬層上以外にも、他の層
間の接着力を向上させるため所望の層上に設けてもよ
い。接着層は親水性ポリマーと、必要によって加えられ
る界面活性剤等を含む水溶液を公知の方法で、支持体や
試薬層等の上に塗布する方法などにより設けることがで
きる。

【００２３】多孔性展開層としては特開昭５５−１６４
３５６号公報、特開昭５７−６６３５９号公報等に記載
の織物布地展開層(例：ブロード、ポプリン等の平織布
地等)、特開昭６０−２２２７６９号公報等に記載の編
物布地展開層（例：トリコット編布地、ダブルトリコッ
ト編布地、ミラニーズ編布地等）、特開平１−１７２７
５３号公報に記載のアルカリエッチング液でエッチング
処理した織物布地又は編物布地からなる展開層、特開昭
５７−１４８２５０号公報に記載の有機ポリマー繊維パ
ルプ含有抄造紙からなる展開層；特公昭５３−２１６７
７号公報、米国特許３,９９２,１５８等に記載のメンブ
ランフイルタ（ブラッシュポリマー層）、ポリマーミク
ロビーズ、ガラスミクロビーズ、珪藻土が親水性ポリマ
ーバインダーに保持されてなる連続微空隙含有多孔性層
等の非繊維等方的多孔性展開層、特開昭５５−９０８５
９号公報に記載のポリマーミクロビーズが水で膨潤しな
いポリマー接着剤で点接触状に接着されてなる連続微空
隙含有多孔性層（三次元格子状粒状構造物層）からなる
非繊維等方的多孔性展開層等を用いることができる。

【００２４】多孔性展開層に用いられる織物布地、編物
布地又は抄造紙は特開昭５７−６６３５９に記載のグロ
ー放電処理またはコロナ放電処理に代表される物理的活
性化処理を布生地又は紙の少なくとも片面に施すか、ま
たは特開昭５５−１６４３５６、特開昭５７−６６３５
９等に記載の水洗脱脂処理、界面活性剤含浸又は親水性
ポリマー含浸等の親水化処理、またはこれらの処理工程
を適宜に組み合せて逐次実施することにより布地又は紙
を親水化し、下側（支持体に近い側）の層との接着力を
増大させることができる。

【００２５】本発明の多層分析要素には、支持体と試薬
層の間に吸水層を設けることができる。吸水層は水を吸
収して膨潤する親水性ポリマーを主成分とする層で、吸
水層の界面に到達または浸透した水性液体試料の水を吸
収できる層であり、全血試料を用いる場合には水性液体
成分である血漿の試薬層への浸透を促進する作用を有す
る。吸水層に用いられる親水性ポリマーは前述の試薬層
に使用されるもののなかから選択することができる。吸
水層には一般的にはゼラチンまたはゼラチン誘導体、ポ
リアクリルアミド、ポリビニルアルコール、特に前述の
ゼラチン又は脱イオンゼラチンが好ましく、試薬層と同
じ前述のゼラチンが最も好ましい。吸水層の乾燥時の厚
さは約３μｍから約１００μｍ、好ましくは約５μｍか
ら約３０μｍの範囲、被覆量では約３ｇ／ｍ²から約１
００ｇ／ｍ²、好ましくは約５ｇ／ｍ²から約３０ｇ／ｍ
²の範囲である。吸水層には後述するｐＨ緩衝剤、公知
の塩基性ポリマー等を含有させて使用時（分析操作実施
時）のｐＨを調節することができる。さらに吸水層には
公知の媒染剤、ポリマー媒染剤等を含有させることがで
きる。

【００２６】アンモニアを分析する場合には第１の試薬
層（指示薬層）の上に液体遮断層を設ける。この液体遮
断層は、多層分析素子の製造時及び／又は分析操作時に
おいて、塗布液、試料液等の液体及びこれらの液体に溶
解含有されている妨害成分（例えば、アルカリ性成分
等）が実質的に透過せずかつガス状アンモニアが透過で
きるような貫通空気孔を有する微多孔性物質で構成され
ている。この微多孔性物質は、液体、特に水による毛細
管現象が実質的に生じないような疎水性材料あるいは、
毛細管現象が実質的に生じない程度に疎水化処理（撥水
性処理）された材料で作られているのが好ましい。

【００２７】微多孔性材料の撥水化処理は、シリコーン
樹脂、シリコーンオイル、弗素樹脂、弗素オイルに代表
される、一般に疎水化処理剤又は撥水化処理剤として公
知の材料をそのまま、あるいは必要により溶剤（例え
ば、ヘキサン、シクロヘキサン、石油エーテル等）で固
形分含有量が約０．１〜約５重量％の範囲内になるよう
に希釈し、これを含浸、塗布又はスプレー等の方法によ
り、連続した空隙を有する微多孔性材料の少なくとも一
表面及びその近傍に適用することにより実施することが
できる。

【００２８】微多孔性物質の例としては、メンブランフ
ィルター；繊維状材料が相互にからみあわされてなる
か、あるいは接着又は結合されてなる微多孔性材料（例
えば、紙、濾紙、フェルト、不織布等）；及び織物生
地、編物生地又は細網状物からなる微多孔性材料を挙げ
ることができる。

【００２９】例えばセルロースアセテート、セルロース
ニトレート、再生セルロース、ポリアミド、ビスフェノ
ールＡのポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピ
レン、ポリテトラフルオロエチレン等のフッ素含有ポリ
マー等を用いて作られているメンブランフィルターある
いはこれらの材料を必要により撥水性処理したものが挙
げられる。本発明の一体型多層要素に用いる場合、上記
メンブランフィルターの厚さは、約３０μｍ〜約３００
μｍの範囲内、好ましくは約７０μｍ〜約２００μｍの
範囲内である。メンブランフィルターの気孔率（空隙
率）は、約２５％〜約９０％、好ましくは約６０〜約９
０％である。また、メンブランフィルターの平均孔径は
約０．０１〜約２０μｍ、好ましくは約０．１〜約１０
μｍの範囲内である。これらメンブランフィルターは、
既に多くのメーカーから様々な種類のものが市販されて
おり、これらの市販品の中から必要に応じて選択して用
いることができる。

【００３０】これら微多孔性材料は前述した指示薬層に
実用的な強度をもって接着する。接着は、指示薬層表面
をウェット状態にして貼り付け乾燥すればよい。ここに
ウェット状態とは、バインダーを溶解している溶媒が残
っているか、あるいは乾燥した膜が可溶性溶媒で濡らさ
れてバインダーが膨潤状態、分散状態又は溶液状態にあ
ることを意味する。

【００３１】液体遮断層の上に、アンモニア生成基質と
反応してアンモニアを生成させる試薬を含む第２の試薬
層を設ける。

【００３２】第２の試薬層の上に、この試薬層で生成し
たアンモニアが下記の内因性アンモニア捕捉層へ拡散す
ることを実質的に防止する機能を有し、アンモニア捕捉
およびアンモニア生成反応のいずれも実質的に行わない
アンモニア拡散防止層を設けることが好ましい。アンモ
ニア拡散防止層はアンモニア捕捉およびアンモニア生成
反応が実質的に行わない層であれば、他の機能を有する
層で代用することもできる。他の機能を有する層の例と
しては、硬化親水性ポリマー層、光遮蔽層、接着層等が
ある。

【００３３】分析素子がクレアチニンのようなアンモニ
ア生成物質定量用の場合にはアンモニア拡散防止層の上
に直接または前述した光遮蔽層または他の中間層を介し
て、水性液体試料中にすでに存在するアンモニア（内因
性アンモニア）に作用して内因性アンモニアを実質的に
前記反応層に到達しえない状態に変化させる試薬を含む
内因性アンモニア捕捉層（以下、単に内因性アンモニア
捕捉層と記す）を設けることが好ましい。内因性アンモ
ニア捕捉層は、アナライト（被検成分）であるクレアチ
ニンまたは尿素窒素等のアンモニア生成物質が反応層に
到達してアンモニアが生成する反応が生起するに先立っ
て、併存する内因性アンモニアを捕捉する機能を有する
層である。

【００３４】内因性アンモニア捕捉試薬としては、アン
モニアを基質として他の物質に変化させる触媒能を有す
る酵素を含む試薬組成物を用いるのが好ましい。内因性
アンモニア捕捉試薬の具体例としては、ＮＡＤＨ（ニコ
チンアミド・アデニン・ジヌクレオチド還元型）、およ
び／またはＮＡＤＰＨ（ニコチンアミド・アデニン・ジ
ヌクレオチド・ホスフェート還元型）、グルタミン酸デ
ヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．４．１．３；以下ＧｌＤＨと
記す）およびα−ケトグルタル酸（またはそのニナトリ
ウム塩：以下、α−ＫＧと記す）を含む試薬組成物を挙
げることができる。また、アスパルターゼ（ＥＣ４．
３．１．１）とフマル酸 またはフマル酸塩を含む試薬
組成物を用いてもよい。本発明の乾式分析素子において
は、ＮＡＤＨ、ＧｌＤＨおよびα−ＫＧを含む試薬組成
物を内因性アンモニア捕捉試薬として用いることが好ま
しい。また、ＧＬＤＨを含む試薬組成物またはアスパル
ターゼを含む試薬組成物を用いる場合には、内因性アン
モニア捕捉層のｐＨ値を通常１０．０以下、好ましくは
７．０〜９．５の範囲内に維持できるように、適当な緩
衝剤を用いることが好ましい。

【００３５】分析素子がアンモニア定量用の場合には、
内因性アンモニア捕捉層を設けないことはいうまでもな
い。

【００３６】本発明の分析素子は上記のような乾式分析
素子において、少なくとも水透過性層の一層が、特定の
両性電解質を含有させたことを特徴としている。この両
性電解質としては、Ａｃｔａ Ｃｈｅｍｉｃａ Ｓｃａｎ
ｄｉｎａｖｉｃａ ２０巻，８２０頁(１９６６年)、同
誌２３巻，２６５３頁(１９６９年)、電気泳動学会編
「電気泳動実験法」(１９７６年改訂５版，東京 文光
堂)２４９〜２５２頁、特開昭６０−２３９４４８など
に記載の両性電解質がある。好ましい両性電解質とし
て、特開昭６０−２３９４４８に記載の両性電解質、Ｌ
ＫＢ Ｐｒｏｄｕｋｔｅｒ社のＡｍｐｈｏｌｉｎｅ ｃ
ａｒｒｉｅｒ ａｍｐｈｏｌｙｔｅｓ（アンフォライ
ン）などがある。特開昭６０−２３９４４８に記載の両
性電解質は少なくとも２つのアミノ基またはイミノ基を
有する有機化合物と、炭素−炭素二重結合を有するカル
ボン酸エステルとを、非水系溶媒中で反応させた後、エ
ステル部分を加水分解することにより合成された水溶性
多塩基性アミノカルボン酸をである。

【００３７】少なくとも２つのアミノ基またはイミノ基
を有する有機化合物は、次の一般式〔Ｉ〕で表わされ
る。 一般式〔Ｉ〕

【００３８】

【化１】 式中、Ｒは、一価以上の

【００３９】

【化２】 で表わされる基を含んでいてもよい二価の基を表わし、
Ｒ¹，Ｒ²，Ｒ³，Ｒ⁴，およびＲ⁵は、独立に水素原子、
アルキル基または置換アルキル基を表わす。ただし、Ｒ
¹，Ｒ²，Ｒ³，Ｒ⁴，およびＲ⁵のうち少なくとも１つは
水素原子である。

【００４０】Ｒ¹，Ｒ²，Ｒ³，Ｒ⁴およびＲ⁵は、好まし
くは水素原子、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、
イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｉ−ブチル基、ｔ−ブ
チル基、ヒドロキシメチル基、またはヒドロキシエチル
基から選ばれる。Ｒは好ましくは炭素数６以下のポリメ
チレングループまたは一価以上の

【００４１】

【化３】 で表わされる基を鎖中に含むポリメチレングループを表
わし、その中の１以上のメチレン基は、上記Ｒ¹からＲ⁵
で表わされる基で置換されていてもよい。

【００４２】一般式〔Ｉ〕で表わされる化合物として
は、例えば、ジエチレントリアミン、トリエチレンテト
ラミン、テトラエチレンペンタミン、ペンタエチレンヘ
キサミンおよびそれぞれに対応するプロピレンアミン等
が挙げられる。特に好ましいものは、ペンタエチレンヘ
キサミンである。

【００４３】炭素−炭素二重結合を有するカルボン酸エ
ステルは、次の一般式〔ＩＩ〕で表される。 一般式〔ＩＩ〕

【００４４】

【化４】

【００４５】式中、Ｒ⁶およびＲ⁷は独立に水素原子、ま
たは低級アルキル基を表わす。Ｒ⁸は水素原子、シアノ
基、または低級アルキル基を表わす。Ｘは単結合または
二価の低級アルキレン基を表わす。Ｒ⁶，Ｒ⁷，Ｒ⁸また
はＸの中に1価の−ＣＯＯＲ¹⁰基を有していてもよい。
Ｒ⁹およびＲ¹⁰は独立に置換されていてもよい低級アル
キル基を表わす。Ｒ⁹またはＲ¹⁰で表わされる基として
は、好ましくは、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル
基、イソプロピル基、ヒドロキシエチル、またはメトキ
シエチル基から選ばれる。

【００４６】一般式〔ＩＩ〕で表わされる化合物として
は、α，β−不飽和カルボン酸エステルが好ましく、例
えば、アクリル酸メチル、アクリル酸エチル、アクリル
酸ｎ−プロピル、アクリル酸メトキシエチル、およびそ
れらに対応するメタクリル酸エステル、マレイン酸また
はイタコン酸等が挙げられる。特に好ましいものは、ア
クリル酸メチルである。

【００４７】本発明で使用される多塩基性アミノカルボ
ン酸は、一般式〔Ｉ〕および一般式〔ＩＩ〕で表される
化合物を非水系溶媒中で反応させ、その後、エステル部
を加水分解することにより合成される。

【００４８】非水系溶媒としては、例えば、メタノー
ル、エタノール等のアルコール系、ジエチルエーテル、
テトラヒドロフラン、ジオキサンのようなエーテル系、
あるいはアセトニトリル、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミ
ドのような非プロトン性極性溶媒やハロゲン化炭化水素
等が挙げられるが、好ましくはアルコール系溶媒であ
る。

【００４９】反応温度および時間は、出発原料および反
応溶媒により適宣選択することができるが、可能な限り
低い方が目的物の着色に対して有利である。また、必要
に応じて触媒（有機または無機の酸や塩基）や重合防止
剤を用いてもよい。

【００５０】ここで得られるポリアミノポリカルボン酸
エステルの種類は、一般式〔Ｉ〕の化合物中の無置換ア
ミノ基の水素原子数の総和と、一般式〔ＩＩ〕の化合物
の数に応じて決まる。

【００５１】加水分解工程は、通常水を溶媒として行な
い、必要に応じて無機または有機の塩基等の触媒を用い
ることもできる。生成物の着色を防止するために、常圧
または加圧下で不活性気体(窒素ガス、アルゴンガス等)
中で反応することが好ましく、水素ガスとパラジウム−
炭素のような還元条件下で行なうことも有効である。

【００５２】多塩基アミノカルボン酸の具体例として
は、一般式

【００５３】

【化５】 式中、ＲはＨ又は

【００５４】

【化６】 ｍは１又は２；好ましくは２ ｎは３，４又は５；好ましくは５ で表わされるものを挙げることができる。

【００５５】こうして得られる多塩基性アミノカルボン
酸の酸性度あるいは塩基性度は、一般式〔Ｉ〕および一
般式〔ＩＩ〕で表わされる化合物の仕込みモル比を適当
に選ぶことによって調節することもできるが、加水分解
条件の選び方による加水分解率の変更によっても調節す
ることができる。そこで、この多塩基性アミノカルボン
酸の酸性度（又は塩基性度）をそれを含有させる層が求
める反応至適ｐＨに調整する緩衝剤として機能するよう
設定する。

【００５６】酸性度との調整は−ＣＯＯＨ基と−ＮＨ₂
基のモル比を変えて行なう。これは、多塩基アミノカル
ボン酸を合成する際に目的のｐＨ値になるように−ＣＯ
ＯＨ基と−ＮＨ₂基のモル比を調整して合成すればよ
い。すなわち、−ＣＯＯＨ：−ＮＨ₂比が１：６では約
ｐＨ９．５、２：６で約ｐＨ８．０、４：６では約ｐＨ
７．０、そして、６：６で約ｐＨ５．０となる。

【００５７】上記多塩基性アミノカルボン酸の含有量は
約０．５％〜約５０％程度、好ましくは約１．０％〜約
５．０％程度が適当である。

【００５８】多塩基性アミノカルボン酸を含有させる層
は反応至適ｐＨを制御したい成分を含む１以上の層であ
り、通常は試薬層（指示薬層、発色層ほか）である。他
の層に試薬層を兼用させた場合、その層も対象になるこ
とはいうまでもない。

【００５９】本発明の乾式分析素子には、被分析成分の
種類等に応じて試薬を含有させる。例えば、カルシウム
を分析する場合いは、試薬層に含有去れる試薬組成物中
の指示薬としては、公知のキレート指示薬が用いられ
る。カルシウム分析用のキレート指示薬の具体例とし
て、ｏ−クレゾールフタレインコンプレクソン（３，
３’−ビス〔〔ジ（カルボキシメチル）アミノ〕メチ
ル〕−ｏ−クレゾールフタレイン〔２４１１−８９−
４〕、以下〔 〕内の数字はＣｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓ
ｔｒａｃｔｓ Ｒｅｇｉｓｔｒｙ Ｎｕｍｂｅｒを表
す）、エリオクロームブラックＴ（１−（１−ヒドロキ
シ−２−ナフチルアゾ）−６−ニトロ−２−ヒドロキシ
ナフタレン−４−スルホン酸モノナトリウム塩〔１７８
７−６１−７〕）、メチルチモールブルーコンプレクソ
ン（３，３’−ビス〔〔ジ(カルボキシメチル)アミノ〕
メチル〕チモールスルホンフタレインテトラナトリウム
塩〔１９４５−７７−３〕)、チモールフタレインコン
プレクソン(３,３'−ビス〔〔ジ（カルボキシメチル）
アミノ〕メチル〕チモールフタレイン〔１９１３−９３
−５〕）、３，６−ビス〔（４−クロロ−２−ホスホノ
フェニル）アゾ〕−４，５−ジヒドロキシ−２，７−ナ
フタレンジスルホン酸ジナトリウム塩（クロロホスホナ
ゾ−III)〔１９１４−９９−４〕、３−〔（４−クロロ
−２−ホスホノフェニル）アゾ〕−４，５−ジヒドロキ
シ−２，７−ナフタレンジスルホン酸ジナトリウム塩
（クロロホスホナゾ−Ｉ）〔１９３８−８２−５〕等
「ドータイト試薬総合カタログ第１２版」（熊本市、同
仁化学研究所、１９８０年発行）等に記載の指示薬があ
る。これらの指示薬のうちではｏ−クレゾールフタレイ
ンコンプレクソン、クロロホスホナゾ−IIIが総カルシ
ウム及びカルシウムイオンのいずれについても最も正確
な定量分析が可能な点で好ましい。また、必要に応じて
試薬組成物を２層以上の別個の層に分けて(例えば試薬
層と吸水層)含有させることもできる。

【００６０】必要に応じてマグネシウムイオンを遮蔽す
るために８−ヒドロキシキノリン、８−ヒドロキシキノ
リン−５−スルホン酸、８−ヒドロキシキノリン−４−
スルホン酸、８−ヒドロキシキノリン硫酸塩等のマグネ
シウムイオンマスキング剤を含有させることが好まし
い。マグネシウムイオンマスキング剤を含有させる層は
試薬層及び／又はそれより上側（支持体から遠い側）の
中間層、接着層又は展開層である。マグネシウムイオン
マスキング剤の被覆量は指示薬被覆量の約１．５倍〜約
１０倍、好ましくは約２倍〜約５倍の範囲である。

【００６１】カルシウムを分析する場合には、水性液体
試料を点着しての分析操作実施時の環境ｐＨ値を約３．
０から約１２．０、好ましくは約４．０から約１１．５
の範囲の所望の値に緩衝できる公知の緩衝剤から適宜選
択して含有させる。ｐＨ緩衝剤は展開層より下側（支持
体に近い側）にある試薬層、吸水層、又は後述する中間
層、接着層のいずれか少なくとも１層に含有させる。そ
れらの層のうちで、試薬層及び／又は吸水層に含有させ
るのが好ましい。

【００６２】用いうる緩衝剤として日本化学会編「化学
便覧基礎編」（東京、丸善、1966年発行）１３１２〜１
３２０頁；Ｒ_.Ｍ_.Ｃ_.Ｄａｗｓｏｎ ｅｔ ａｌ編「Ｄａ
ｔａｆｏｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ」第２版（Ｏｘｆｏｒｄａｔ ｔｈｅ Ｃｌａｒｅｎ
ｄｏｎ Ｐｒｅｓｓ、１９６９年発行）４７６〜５０８
頁；「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」５、４６７〜４７７
頁(１９６６年)；「Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ」１０４、３００〜３１０頁（１９８０
年）等に記載のｐＨ緩衝剤組成物がある。ｐＨ３．０か
ら１２．０の範囲のｐＨ緩衝剤の具体例として、２−
（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸(ＭＥＳ)；３，３
−ジメチルグルタル酸；イミダゾール；トリス（ヒドロ
キシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）を含む緩衝剤；
燐酸塩を含む緩衝剤；硼酸塩を含む緩衝剤；炭酸塩を含
む緩衝剤；グリシンを含む緩衝剤；Ｎ，Ｎ−ビス（２−
ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）；４−
（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンプロパンス
ルホン酸（ＨＥＰＰＳ）、Ｎａ塩又はＫ塩等；４−(２
−ヒドロキシエチル)−１−ピペラジンエタンスルホン
酸（ＨＥＰＥＳ）、Ｎａ塩又はＫ塩等；３−〔〔２−ヒ
ドロキシ−１，１−ビス（ヒドロキシメチル）エチル〕
アミノ〕−１−プロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、Ｎａ
塩又はＫ塩等；β−ヒドロキシ−４−（２−ヒドロキシ
エチル）−１−ピペラジンプロパンスルホン酸（ＨＥＰ
ＰＳＯ）、Ｎａ塩又はＫ塩等；３−（シクロヘキシルア
ミノ）−１−プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、Ｎａ塩
又はＫ塩等；及びこれらのいずれかと必要により組合せ
られる酸、アルカリまたは塩がある。好ましい緩衝剤の
具体例として、ＭＥＳ；３，３−ジメチルグルタル酸；
イミダゾール；Ｔｒｉｓ−硼酸ナトリウム；Ｂｉｃｉｎ
ｅ；ＨＥＰＰＳ；ＨＥＰＰＳナトリウム塩；ＨＥＰＰＳ
Ｏ；ＨＥＰＰＳＯナトリウム塩；ＴＡＰＳ；ＴＡＰＳナ
トリウム塩；ＣＡＰＳ；ＣＡＰＳナトリウム塩；ＣＡＰ
Ｓカリウム塩等である。

【００６３】また、アンモニアを分析する場合には、呈
色性アンモニア指示薬として、たとえばロイコシアニン
染料、ニトロ置換ロイコ染料およびロイコフタレイン染
料のようなロイコ染料（米国再発行特許第３０２６７号
明細書または特公昭５８−１９０６２号公報記載）：ブ
ロムフェノールブルー、ブロムクレゾールグリーン、ブ
ロムチモールブルー、キノリンブルーおよびロゾール酸
のようなｐＨ指示薬（共立出版(株)、化学大辞典、第１
０巻６３〜６５頁参照）：トリアリールメタン系染料前
駆体: ロイコベンジリデン色素（特開昭５５−３７９号
および特開昭５６−１４５２７３号各公報に記載）：ジ
アゾニウム塩とアゾ染料カプラー：塩基漂白可能染料等
を挙げることができる。バインダーの重量に対する呈色
性アンモニア指示薬の配合量は約１〜２０重量％の範囲
内であることが好ましい。

【００６４】アンモニア生成物質と反応してアンモニア
を生成させる試薬は酵素または酵素を含有する試薬であ
ることが好ましく、アナライトであるアンモニア生成物
質の種類に応じて、分析に適した酵素を選択して用いる
ことができる。上記試薬として酵素を用いる場合には、
その酵素の特異性からアンモニア生成物質と試薬の組み
合わせが決定される。アンモニア生成物質と試薬として
の酵素の組合せの具体例としては、尿素：ウレアーゼ、
クレアチニン：クレアチニンデイミナーゼ、アミノ酸：
アミノ酸デヒドロゲナーゼ、アミノ酸：アミノ酸オキシ
ダーゼ、アミノ酸：アンモニアリアーゼ、アミン：アミ
ンオキシダーゼ、ジアミン：アミンオキシダーゼ、グル
コースおよびホスホアミダート：ホスホアミダートヘキ
ソースホスホトランスフェラーゼ、ＡＤＰ：カルバミン
酸塩キナーゼおよび燐酸カルバモル、酸アミド：アミド
ヒドロラーゼ、ヌクレオ塩基：ヌクレオ塩基デアミナー
ゼ、ヌクレオシド／ヌクレオシドデアミナーゼ、ヌクレ
オチド：ヌクレオチドデアミナーゼ、グアニン：グアナ
ーゼ等を挙げることができる。アンモニアを分析する場
合の試薬層に用いることができるアルカリ性緩衝剤とし
ては、ｐＨが７．０〜１２．０、好ましくは７．５〜１
１．５の範囲の緩衝剤を用いることができる。

【００６５】アンモニアを分析する場合の試薬層には、
アンモニア生成物質と反応してアンモニアを生成させる
試薬、アルカリ性緩衝剤およびフィルム形成能を有する
親水性ポリマーバインダー以外にも必要に応じて湿潤
剤、バインダー架橋剤(硬化剤)、安定剤、重金属イオン
トラップ剤（錯化剤）等を含有させることができる。重
金属イオントラップ剤は、酵素活性を阻害するような重
金属イオンをマスキングするために使用されるものであ
る。重金属イオントラップ剤の具体例としては、ＥＤＴ
Ａ・２Ｎａ、ＥＤＴＡ・４Ｎａ、ニトリロトリ酢酸（Ｎ
ＴＡ）、ジエチレントリアミンペンタ酢酸のようなコン
プレクサン（ｃｏｍｐｌｅｘａｎｅ）を挙げることがで
きる。

【００６６】試薬層、吸水層、アンモニア拡散防止層、
内因性アンモニア捕捉層、光反射層、接着層、展開層、
中間層、アンモニア捕捉試薬組成物を含有する展開層等
には界面活性剤を含有させることができる。その例とし
てノニオン性界面活性剤がある。ノニオン性界面活性剤
の具体例として、ｐ−オクチルフェノキシポリエトキシ
エタノール、ｐ−ノニルフェノキシポリエトキシエタノ
ール、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキ
シエチレンソルビタンモノラウレート、ｐ−ノニルフェ
ノキシポリグリシドール、オクチルグルコシド等があ
る。ノニオン性界面活性剤を展開層に含有させることに
より水性液体試料の展開作用（メータリング作用）がよ
り良好になる。ノニオン性界面活性剤を試薬層又は吸水
層に含有させることにより、分析操作時に水性液体試料
中の水が試薬層または吸水層に実質的に一様に吸収され
やすくなり、また展開層との液体接触が迅速に、かつ実
質的に一様になる。

【００６７】本発明の乾式分析素子は公知の方法により
調製することができる。多塩基性アミノカルボン酸は塗
布または含浸される試薬水溶液に予め加えておけばよ
い。他の方法としては、展開層に含浸させる場合には、
単独又は界面活性剤・展開面積制御のための親水性ポリ
マーなどを含む水溶液、有機溶媒（エタノール、メタノ
ールなど）溶液又は水−有機溶媒混合液溶液を展開層の
上から塗布して含浸させることもできる。これを用いた
アナライトの分析も公知の方法に従って行なうことがで
きる。

【００６８】

【実施例】

〔実施態様１〕支持体の上に少なくとも１層の水透過性
の試薬層と多孔性展開層がこの順に積層されている乾式
分析素子において、前記水透過性の試薬層、前記展開層
又は必要により設けられる少なくとも１層の水透過性層
のいずれか少なくとも１層に両性電解質である水溶性多
塩基アミノカルボン酸が含有されていることを特徴とす
る乾式分析素子。

【００６９】〔実施態様２〕前記両性電解質が、少なく
とも２つのアミノ基又はイミノ基を有する有機化合物
と、炭素−炭素二重結合を有するカルボン酸エステルと
を、非水系溶媒中で反応させた後、エステル部分を加水
分解することにより合成された水溶性多塩基アミノカル
ボン酸である実施態様項１に記載の乾式分析素子。

【００７０】〔実施態様３〕前記水溶性多塩基アミノカ
ルボン酸が下記一般式で表わされる化合物である実施態
様項２に記載の乾式分析素子。

【００７１】

【化７】 式中、ＲはＨ又は

【００７２】

【化８】 ｍは１又は２ ｎは３，４又は５

【００７３】〔実施態様４〕前記水溶性多塩基アミノカ
ルボン酸が下記一般式で表わされる化合物である実施態
様項３に記載の乾式分析素子。

【００７４】

【化９】 式中、ＲはＨ又は−ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＯＯＨ −ＣＯＯＨ対−ＮＨ−（又は−ＮＨ₂）の含有比が１：
６ないし６：６の範囲

【００７５】〔実施態様５〕前記両性電解質を含む層の
液体試料を点着された状態におけるｐＨ値が５．０から
９．５の範囲の予め定められた特定の値である実施態様
項１又は２に記載の乾式分析素子。

【００７６】〔実施態様６〕前記支持体が透明な水不透
過性支持体である実施態様項１又は２に記載の乾式分析
素子。

【００７７】〔実施態様７〕前記乾式分析素子が、透明
な水不透過性支持体の上に、順に、指示薬層、多孔性液
体遮断層、アンモニア生成反応試薬層、アンモニア拡散
防止層、内因性アンモニア捕捉層、展開層が積層一体化
された構成の乾式分析であり、前記内因性アンモニア捕
捉層に前記両性電解質が含有されている実施態様項１又
は２に記載の乾式分析素子。

【００７８】〔実施態様８〕前記アンモニア生成反応試
薬層にクレアチニン検出試薬組成物が含有されている実
施態様項７に記載の乾式分析素子。

【００７９】以下の実施例で使用したアンフォライト
は、特開昭６０−２３９４４８号公報の実施例−１に記
載の操作手順に準じて合成した。このものの等電点は
８．２であった。

【００８０】〔実施例１〕厚さ１８０ｍｍの無色透明ポ
リエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）平滑フィルムシー
ト（支持体）上に、表１記載の被覆量になるように塗布
・乾燥して指示薬層を設けた。

【００８１】

【表１】

【００８２】その上から平均孔径０．２ｍｍ、空隙率７
５％、厚さ１００ｍｍのポリエチレン製メンブランフィ
ルターを均一に圧着して液体遮断層を設けた。

【００８３】ついで、液体遮断層の上に表２記載の被覆
量になるように塗布・乾燥し、アンモニア生成反応試薬
層を設けた。

【００８４】

【表２】

【００８５】反応試薬層の上に下記の被覆量になるよう
に塗布・乾燥し、アンモニア拡散防止層を設けた。ヒド
ロキシプロピルセルロース（メトキシ基２８〜３０％、
ヒドロキシプロポキシ基７〜１２％含有；２％水溶液の
２０℃での粘度５０ｃｐｓ) ２０ｇ／ｍ²

【００８６】アンモニア拡散防止層の上に表３記載の被
覆量になるように塗布・乾燥し、内因性アンモニア捕捉
層を設けた。

【００８７】

【表３】 ＊：

【００８８】

【化10】 式中、ＲはＨ又は−ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＯＯＨ −ＣＯＯＨ対−ＮＨ−（又は−ＮＨ₂）比は２：６

【００８９】ついで、この内因性アンモニア捕捉層の上
に、３０ｇ／ｍ²の割合で水を供給して湿潤させた後、
純ポリエチレンテレフタレート製トリコット編物布地
（１００Ｓ相当の紡績糸製で厚さ約２５０μｍ）をほぼ
一様に軽く圧力をかけてラミネートした。

【００９０】さらに、この編物布地にポリビニルピロリ
ドン（平均分子量３６万）を７．８ｇ／ｍ²になるよう
に含浸塗布・乾燥し、展開層を設けた。こうしてクレア
チニン測定用乾式分析素子を作製した。

【００９１】〔比較例１〕比較対照として実施例１の内
因性アンモニア補足尺の組成（表３）の代わりに下記組
成（表４）を用い、他は実施例１と同様にして、クレア
チニン測定用乾式分析素子を作製した。

【００９２】

【表４】

【００９３】〔測定例１〕本発明の実施例１及び比較例
１の分析素子の内因性、アンモニア捕捉性能を調べるた
めに以下の試験を実施した。表５に示した、各濃度のク
レアチニン含有コントロール血清を、実施例および比較
例の分析素子にそれぞれ１０ｍＬずつ点着した。

【００９４】各分析素子を３７℃にて６分間インキュべ
ーションした後、波長６００ｎｍにて支持体側からの反
射光学濃度（ＯＤｒ）を測定した。その結果を表５に示
す。

【００９５】

【表５】

【００９６】表５の結果を検量線としてグラフ化すると
図１のようになる。さらに、下記の表６に示す各濃度の
アンモニア水溶液を、前述同様点着測定した。その結果
を表６、図２に示す。

【００９７】

【表６】

【００９８】表６の数値は図１から得られた検量線を基
に６分後反射光学濃度（ＯＤｒ）をクレアチニン値（ｍ
ｇ／ｄＬ）に換算したデータから求めた。表６と図２か
ら本発明例である実施例１品は比較例１品に比べ、アン
モニア水溶液による正誤差をうけにくいつまりアンモニ
アを除去する能力が高いことが明らかである。

【００９９】〔実施例２〕ゼラチン下塗り層が設けられ
ている厚さ１８０ｍｍの無色透明ポリエチレンテレフタ
レート（ＰＥＴ）平滑フィルムシート（支持体）上に表
７記載の被覆量２なるように塗布・乾燥して発色層を設
けた。

【０１００】

【表７】

【０１０１】ついで、この発色層の上に３０ｇ／ｍ²の
割合で水を供給して湿潤させた後、純ポリエチレンテレ
フタレート製トリコット編物布地（１００Ｓ相当の紡績
糸製で厚さ約２５０μｍ）をほぼ一様に軽く圧力をかけ
てラミネートして多孔性展開層を設けた。

【０１０２】この展開層の上から、下記の表８に記載の
被覆量になるように塗布・乾燥して、グルコース測定用
乾式分析素子を作成した。

【０１０３】

【表８】 ＊：

【０１０４】

【化11】 式中、Ｒは−ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＯＯＨ −ＣＯＯＨ対−ＮＨ−比は６：６

【０１０５】〔比較例２〕比較対照として実施例２の試
薬組成（表８）の代わりに下記組成（表９）を用い、他
は実施例と同様にして、グルコース−測定用分析素子
（比較例）、を作製した。

【０１０６】

【表９】

【０１０７】〔測定例２〕本発明の実施例２及び比較例
２の分析素子の定量性能を調べるために以下の試験を実
施した。

【０１０８】表１０に示した各濃度のグルコース水溶液
を、実施例２および比較例２の分析素子にそれぞれ１０
ｍＬずつ点着した。各分析素子を３７℃にて４分間イン
キュベーションした後、波長５０５ｎｍにて支持体側か
らの反射光学濃度（ＯＤｒ）を測定した。結果を表１０
と図３に示す。

【０１０９】

【表１０】

【０１１０】表１０，図３から、本発明である実施例２
は比較例２に比べ、定量感度が良好であり、分析素子と
して適当であることが明らかである。

【０１１１】

【発明の効果】本発明の分析素子は少量の酵素等の反応
試薬を用いて高感度で測定を行なうことができ、保存期
間も延長することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明の実施例品と比較例品を用いてクレア
チニンの濃度と反射光学濃度の変化の関係を測定した結
果を示すグラフである。

【図２】 本発明の実施例品と比較例品を用いて、アン
モニア濃度を変えて反射光学濃度を測定し、これを図１
のグラフを検量線としてクレアチンに濃度に換算して示
したグラフである。

【図３】 本発明の実施例品と比較例品を用いてクレア
チニンの濃度と反射光学濃度の変化の関係を測定した結
果を示すグラフである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 支持体の上に少なくとも１層の水透過性
   の試薬層と多孔性展開層がこの順に積層されている乾式
   分析素子において、前記水透過性の試薬層、前記展開層
   又は必要により設けられる少なくとも１層の水透過性層
   のいずれか少なくとも１層に両性電解質である水溶性多
   塩基アミノカルボン酸が含有されていることを特徴とす
   る乾式分析素子。