JP4361502B2 - 多層分析要素 - Google Patents

Description

本発明は、臨床検査、食品検査又は環境分析等に用いられる多層分析要素に関する。

臨床検査、食品検査及び環境分析の分野では、迅速・簡便に検体を処理する要求が年々高くなっており、そのニーズに応えた分析素子が汎用されている。分析要素の中で、血液の受容、展開、拡散を行わせる展開層には、特開昭５５−１６４３５６号公報、特開昭５７−６６３５９号公報、特開昭６０−２２２７６９号公報等に代表されるように、繊維質多孔性材料が用いられてきた。

この繊維質多孔性材料は、液体試料点着時の展開が速く、製造時の取り扱い性にも優れている。また、全血のような粘性のある試料に対しても適用性があり、広く使用されている。

しかし、この分野では、より高い精度（再現性）での測定が要求されるようになってきており、繊維質多孔性材料（布展開層）では、いくつか不具合がでてきている。その一つが、布自身のロット変動の問題である。通常、布展開層には、織物と編物があるが、その織り方、編み方にロット間差及びロット内差が見つかっている。具体的には、単位面積当たりの編目数、単位面積当たりの重量、厚みなどである。また、中間工程で、材料の洗浄工程があるが、その洗浄の程度により、布の親水性にロット間差、ロット内差がある。さらに、布展開層は、平滑ではないため、積層方式で、十分な接着力を確保して製造しようとすると、下層に展開層を食い込ませざるを得ない。これにより下層は乱れており、より高い精度での測定に対しては、好ましくない。また布は下層に布を接着する際に、その構造上伸びやすく、空隙体積の変化を起こしやすい。そのために液体試料点着時の展開面積が変化しやすく、ロット内差及び高精度測定が達成できない原因となっている。また近年、より少ない試料で測定することが望まれているが、布展開層では、試料液量を少なくしていくと、編目の影響による反射光量のバラツキが顕著になり、さらに展開層を接着する際の下層の不均一な乱れのために高精度の測定ができなくなる問題がある。

特開昭５５−１６４３５６号公報 特開昭５７−６６３５９号公報 特開昭６０−２２２７６９号公報

本発明は上記した従来技術の問題点を解消することを解決すべき課題とした。即ち、本発明の目的は、ロット間差及びロット内差が小さく、測定精度が高く、小型化が可能な多層分析要素を提供することである。本発明の別の目的は、展開層を下層と接着させる際の下層の乱れを軽減し、高精度の測定が可能となるような多層分析要素を提供することである。

本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、展開層を下層から剥がした時に下層の表面粗さＲａが１μｍ以下またはＲｚが８μｍ以下となるような非繊維性多孔膜を展開層として用いることによって、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明によれば、水不透過性平面支持体の片面上に、少なくとも１つの機能層と少なくとも１つの非繊維性多孔膜からなる多孔性液体試料展開層がこの順に積層一体化された液体試料分析用多層分析要素において、非繊維性多孔膜からなる多孔性液体試料展開層と接触する少なくとも１つの機能層の接触面の算術平均粗さ（Ｒａ）が１μｍ以下および／または十点平均粗さ（Ｒｚ）が８μｍ以下である液体試料分析用多層分析要素が提供される。

好ましくは、非繊維性多孔膜は有機高分子からなる多孔膜である。
好ましくは、有機高分子からなる多孔膜は非対称性多孔膜であり、非対称率は２．０以上であるか、あるいは有機高分子からなる多孔膜は対称性多孔膜であり、非対称率は２．０未満である。

好ましくは、有機高分子からなる多孔膜は６，６−ナイロン、６−ナイロン、アクリレート共重合体、ポリアクリレート、ポリアクリロニトリル、ポリアクリロニトリル共重合体、ポリアミド、ポリイミド、ポリアミドイミド、ポリウレタン、ポリエーテルスルホン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホンとポリスルホンの混合物、ポリエステル、ポリエステルカーボネート、ポリエチレン、ポリエチレンクロロトリフルオロエチレン共重合体、ポリエチレンテトラフルオロエチレン共重合体、ポリ塩化ビニル、ポリオレフィン、ポリカーボネート、ポリテトラフルオロエチレン、ポリビニリデンジフルオライド、ポリフェニレンスルフィド、ポリフェニレンオキシド、ポリフルオロカーボネート、ポリプロピレン、ポリベンズイミダゾール、ポリメタクリル酸メチル、スチレン−アクリロニトリル共重合体、スチレン−ブタジエン共重合体、エチレン−酢酸ビニル共重合体の鹸化物、ポリビニルアルコール、セルロースアセテート、セルロースアセテートの鹸化物、セルロースアセテートブチレート、セルロースアセテートブチレートの鹸化物またはこれらの混合物である。

さらに好ましくは、有機高分子からなる多孔膜は、６，６−ナイロン、６−ナイロン、ポリエーテルスルホン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホンとポリスルホンの混合物、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリオレフィン、ポリアクリロニトリル、ポリビニルアルコール、ポリカーボネート、ポリエステルカーボネート、ポリフェニレンオキシド、ポリアミド、ポリイミド、ポリアミドイミド、セルロースアセテート、セルロースアセテートの鹸化物またはこれらの混合物である。

特に好ましくは、有機高分子からなる多孔膜はポリエーテルスルホン、ポリスルホン、セルロースアセテート、セルロースアセテートの鹸化物またはこれらの混合物である。

本発明の多層分析要素においては、展開層を下層から剥がした時に下層の表面粗さＲａが１μｍ以下またはＲｚが８μｍ以下となるような非繊維性多孔膜を展開層として用いることによって、展開層と下層との接着時に生じる下層の乱れが軽減し、高精度の測定が可能となる。さらに分析要素の小型化も可能となる。さらに本発明の多層分析要素は、安定した製造が可能であり、かつロット間差及びロット内差を小さくすることができる。

以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明の液体試料分析用多層分析要素は、水不透過性平面支持体の片面上に、少なくとも１つの機能層と少なくとも１つの非繊維性多孔膜からなる多孔性液体試料展開層がこの順に積層一体化されたものであり、非繊維性多孔膜からなる多孔性液体試料展開層と接触する少なくとも１つの機能層の接触面の算術平均粗さ（Ｒａ）が１μｍ以下および／または十点平均粗さ（Ｒｚ）が８μｍ以下であることを特徴とする。

本発明においては、非繊維性多孔膜からなる多孔性液体試料展開層と接触する少なくとも１つの機能層の接触面の算術平均粗さ（Ｒａ）が１μｍ以下および／または十点平均粗さ（Ｒｚ）が８μｍ以下であるという特徴により、展開層と下層との接着時に生じる下層の乱れが軽減し、高精度の測定が可能となると同時に、多層分析要素の安定した製造が可能となり、かつロット間差及びロット内差を小さくすることができる。

本発明において、多孔性液体試料展開層と接触する機能層の接触面の算術平均粗さ（Ｒａ）は１μｍ以下であり、好ましくは０．８μｍ以下であり、さらに好ましくは０．６μｍ以下であり、特に好ましくは０．４μｍ以下である。算術平均粗さ（Ｒａ）とは、粗さ曲線から、その平均線の方向に基準長さだけ抜き取り、この抜き取り部分の方向にＸ軸、縦倍率の方向にＹ軸ｙ＝ｆ（ｘ）で表した時に次の式によって求められる値を言う。

本発明において、多孔性液体試料展開層と接触する機能層の接触面の十点平均粗さ（Ｒｚ）は８．０μｍ以下であり、好ましくは６．０μｍ以下であり、さらに好ましくは４．０μｍ以下であり、特に好ましくは２．０μｍ以下である。十点平均粗さ（Ｒｚ）とは、粗さ曲線から、その平均線の方向に基準長さだけ抜き取り、この抜き取り部分の平均値から縦倍率の方向に測定した最も高い山頂から５番目までの山頂の標高（Ｙｐ）の絶対値の平均値と、最も低い谷底から５番目までの谷底の標高（Ｙｖ）の絶対値の平均値を言う。

水不透過性平面支持体としては、従来公知の分析要素に用いられている水不透過性の支持体を用いることができる。水不透過性支持体の例としては、ポリエチレンテレフタレート、ビスフェノールＡのポリカルボネート、ポリスチレン、セルロースエステル（例、セルロースジアセテート、セルローストリアセテート、セルロースアセテートプロピオネート等）等のポリマーからなる厚さ約５０μｍから約１ｍｍ、好ましくは約８０μｍから約３００μｍの範囲のフィルムもしくはシート状の透明支持体を挙げることができる。

支持体の表面には必要により下塗層を設けて、支持体の上に設けられる機能層と支持体との接着を強固なものにすることができる。また、下塗層の代りに、支持体の表面を物理的あるいは化学的な活性化処理を施して接着力の向上を図ってもよい。

本発明の多層分析要素は、少なくとも１つの非繊維性多孔膜からなる多孔性液体試料展開層を含む。多孔性液体試料展開層は、水性の検体に含有されている成分を実質的に偏在させることなしに平面的に拡げ、単位面積当りほぼ一定量の割合で、機能層に供給する機能を有する層である。

多孔性液体試料展開層は、１層だけに限定する必要はなく、２層以上の非繊維性多孔膜を部分的に配置された接着剤により接着された積層物を用いることができる。また、少なくとも１つの非繊維性多孔膜からなる多孔性液体試料展開層は特開昭５７−６６３５９に開示の物理的活性化処理、好ましくはグロー放電処理またはコロナ放電処理を非繊維性多孔膜の少なくとも片面に施すか、あるいは特開昭５５−１６４３５６、特開昭５７−６６３５９等に開示の界面活性剤含浸処理、好ましくはノニオン性界面活性剤含浸処理、または親水性ポリマー含浸処理等の親水化処理、またはこれらの処理工程の二つ以上の組合せを逐次実施することにより非繊維性多孔膜を親水化し、下側（支持体に近い側）の機能層との接着力の強化、または展開面積のコントロールをすることができる。更に、目的とする検出反応を行うための試薬、該検出反応を促進するための試薬、あるいは干渉・妨害反応を低減又は阻止する為の各種試薬、もしくはこれらの試薬の一部を含ませることができる。

非繊維性多孔膜からなる多孔性液体試料展開層の厚さ、孔径、空隙率、透水速度などに特に制限は無いが、厚さについては５０〜５００μｍ、好ましくは５０〜３５０μｍ、更に好ましくは８０〜２００μｍであることが望ましい。孔径については好ましくは０．００１〜１００μｍ、更に好ましくは０．１〜５０μｍ程度の平均孔径を有するものが望ましい。空隙率については好ましくは５０〜９５％、更に好ましくは６０〜９０％が望ましい。また透水速度については２５℃で１Ｋｇ／ｃｍ²の圧力で水を通過させたときの透水量が好ましくは非繊維性多孔膜１ｃｍ２当たり１分間に１〜５０００ｍｌ、更に好ましくは５〜２０００ｍｌであることが望ましい。

本発明における多孔性液体試料展開層は、非繊維性多孔膜からなるものである。好ましくは、非繊維性多孔膜は有機高分子からなる多孔膜である。上記した有機高分子からなる多孔膜は、対称性膜又は非対称性膜の何れも使用することができる。非対称性多孔膜の場合、非対称率は好ましくは２．０以上であり、対称性多孔膜の場合、非対称率は好ましくは２．０未満である。本明細書で言う非対称性多孔膜とは、一方の表面の平均孔径が他方の表面の平均孔径よりも大きい多孔膜のことであり、非対称率とは、大きい方の平均孔径を小さい方の平均孔径で割った値のことである。

有機高分子からなる多孔膜の好ましい具体例としては、６，６−ナイロン、６−ナイロン、アクリレート共重合体、ポリアクリレート、ポリアクリロニトリル、ポリアクリロニトリル共重合体、ポリアミド、ポリイミド、ポリアミドイミド、ポリウレタン、ポリエーテルスルホン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホンとポリスルホンの混合物、ポリエステル、ポリエステルカーボネート、ポリエチレン、ポリエチレンクロロトリフルオロエチレン共重合体、ポリエチレンテトラフルオロエチレン共重合体、ポリ塩化ビニル、ポリオレフィン、ポリカーボネート、ポリテトラフルオロエチレン、ポリビニリデンジフルオライド、ポリフェニレンスルフィド、ポリフェニレンオキシド、ポリフルオロカーボネート、ポリプロピレン、ポリベンズイミダゾール、ポリメタクリル酸メチル、スチレン−アクリロニトリル共重合体、スチレン−ブタジエン共重合体、エチレン−酢酸ビニル共重合体の鹸化物、ポリビニルアルコール、セルロースアセテート、セルロースアセテートの鹸化物、セルロースアセテートブチレート、セルロースアセテートブチレートの鹸化物またはこれらの混合物などが挙げられる。上記の中でも、６，６−ナイロン、６−ナイロン、ポリエーテルスルホン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホンとポリスルホンの混合物、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリオレフィン、ポリアクリロニトリル、ポリビニルアルコール、ポリカーボネート、ポリエステルカーボネート、ポリフェニレンオキシド、ポリアミド、ポリイミド、ポリアミドイミド、セルロースアセテート、セルロースアセテートの鹸化物またはこれらの混合物がさらに好ましく、ポリエーテルスルホン、ポリスルホン、セルロースアセテート、セルロースアセテートの鹸化物またはこれらの混合物が特に好ましい。

また、試薬を含有する非繊維性多孔膜は、試薬を含有している膜を指すが、予め多孔膜を試薬溶液に浸漬後、乾燥させることにより試薬含有膜を作製できる。また、別法として多孔膜上に試薬溶液を塗布後乾燥させることにより試薬含有非繊維性多孔膜を作製できるが、特に手段は限定されない。

本発明の多層分析要素は、少なくとも１つの機能層を含む。機能層の数は１以上であれば特に限定されず、１層でもよいし、２層以上の複数の層とすることもできる。

機能層の具体例としては、展開層と機能層を接着する接着層、液状試薬を吸水する吸水層、化学反応により生成した色素の拡散を防止する媒染層、ガスを選択的に透過させるガス透過層、層間での物質移動を抑制・促進させる中間層、内因性物質を除去する除去層、反射測光を安定に行うための光遮蔽層、内因性色素の影響を抑制する色遮蔽層、血球と血漿を分離する分離層、分析対象物と反応する試薬を含む試薬層、発色剤を含む発色層などが挙げられる。

本発明の一例としては、例えば、支持体の上には、場合によっては下塗層等の他の層を介して、機能層として親水性ポリマー層を設けることができる。親水性ポリマー層としては、例えば、無孔性、吸水性かつ水浸透性の層であり、基本的に親水性ポリマーのみなる吸水層、親水性ポリマーをバインダーとし発色反応に直接関与する発色試薬の一部又は全部を含む試薬層、及び親水性ポリマー中に発色色素を固定し不動にする成分（例：媒染剤）を含有する検出層などを設けることができる。

（試薬層）
試薬層は水性液体中の被検成分と反応して光学的に検出可能な変化を生じる試薬組成物の少なくとも一部が親水性ポリマーバインダー中に実質的に一様に分散されている吸水性で水浸透性の層である。この試薬層には指示薬層、発色層なども含まれる。

試薬層のバインダーとして用いることができる親水性ポリマーは、一般には水吸収時の膨潤率が３０℃で約１５０％から約２０００％、好ましくは約２５０％から約１５００％の範囲の天然または合成親水性ポリマーである。そのような親水性ポリマーの例としては、特開昭６０−１０８７５３号公報等に開示されているゼラチン（例、酸処理ゼラチン、脱イオンゼラチン等）、ゼラチン誘導体（例、フタル化ゼラチン、ヒドロキシアクリレートグラフトゼラチン等）、アガロース、プルラン、プルラン誘導体、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン等をあげることができる。

試薬層は架橋剤を用いて適宜に架橋硬化された層とすることができる。架橋剤の例として、ゼラチンに対する１，２−ビス（ビニルスルホニルアセトアミド）エタン、ビス（ビニルスルホニルメチル）エーテル等の公知のビニルスルホン系架橋剤、アルデヒド等、メタリルアルコールコポリマーに対するアルデヒド、２個のグリシジル基含有エポキシ化合物等がある。

試薬層の乾燥時の厚さは約１μｍから約１００μｍの範囲であることが好ましく、より好ましくは約３μｍから約３０μｍの範囲である。また試薬層は実質的に透明であることが好ましい。

本発明の多層分析要素の試薬層やその他の層に含める試薬としては、被験物質に応じてその検出に適した試薬を選択することができる。
例えば、アンモニア（被験物質がアンモニア又はアンモニア生成物質である場合）を分析する場合には、呈色性アンモニア指示薬として、ロイコシアニン染料、ニトロ置換ロイコ染料およびロイコフタレイン染料のようなロイコ染料（米国再発行特許第３０２６７号明細書または特公昭５８−１９０６２号公報記載）：ブロムフェノールブルー、ブロムクレゾールグリーン、ブロムチモールブルー、キノリンブルーおよびロゾール酸のようなｐＨ指示薬（共立出版(株)、化学大辞典、第１０巻６３〜６５頁参照）：トリアリールメタン系染料前駆体: ロイコベンジリデン色素（特開昭５５−３７９号および特開昭５６−１４５２７３号各公報に記載）：ジアゾニウム塩とアゾ染料カプラー：塩基漂白可能染料等を用いることができる。バインダーの重量に対する呈色性アンモニア指示薬の配合量は約１〜２０重量％の範囲内であることが好ましい。

被験物質であるアンモニア生成物質と反応してアンモニアを生成させる試薬は、酵素または酵素を含有する試薬であることが好ましく、被験物質であるアンモニア生成物質の種類に応じて、分析に適した酵素を選択して用いることができる。上記試薬として酵素を用いる場合には、その酵素の特異性からアンモニア生成物質と試薬の組み合わせが決定される。アンモニア生成物質と試薬としての酵素の組合せの具体例としては、尿素：ウレアーゼ、クレアチニン：クレアチニンデイミナーゼ、アミノ酸：アミノ酸デヒドロゲナーゼ、アミノ酸：アミノ酸オキシダーゼ、アミノ酸：アンモニアリアーゼ、アミン：アミンオキシダーゼ、ジアミン：アミンオキシダーゼ、グルコースおよびホスホアミダート：ホスホアミダートヘキソースホスホトランスフェラーゼ、ＡＤＰ：カルバミン酸塩キナーゼおよび燐酸カルバモル、酸アミド：アミドヒドロラーゼ、ヌクレオ塩基：ヌクレオ塩基デアミナーゼ、ヌクレオシド／ヌクレオシドデアミナーゼ、ヌクレオチド：ヌクレオチドデアミナーゼ、グアニン：グアナーゼ等を挙げることができる。アンモニアを分析する場合の試薬層に用いることができるアルカリ性緩衝剤としては、ｐＨが７．０〜１２．０、好ましくは７.５〜１１.５の範囲の緩衝剤を用いることができる。

アンモニアを分析する場合の試薬層には、アンモニア生成物質と反応してアンモニアを生成させる試薬、アルカリ性緩衝剤およびフィルム形成能を有する親水性ポリマーバインダー以外にも必要に応じて湿潤剤、バインダー架橋剤（硬化剤）、安定剤、重金属イオントラップ剤(錯化剤)等を含有させることができる。重金属イオントラップ剤は、酵素活性を阻害するような重金属イオンをマスキングするために使用されるものである。重金属イオントラップ剤の具体例としては、ＥＤＴＡ・２Ｎａ、ＥＤＴＡ・４Ｎａ、ニトリロトリ酢酸（ＮＴＡ）、ジエチレントリアミンペンタ酢酸のようなコンプレクサン（ｃｏｍｐｌｅｘａｎｅ）を挙げることができる。

グルコース測定試薬組成物の例としては、米国特許３，９９２，１５８；特開昭５４−２６７９３；特開昭５９−２０８５３；特開昭５９−４６８５４；特開昭５９−５４９６２等に記載のグルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、４−アミノアンチピリン又はその誘導体、１，７−ジヒドロキシナフタレンを含む改良Ｔｒｉｎｄｅｒ試薬組成物がある。

（光遮蔽層）
前記試薬層の上に必要に応じて光遮蔽層を設けることができる。光遮蔽層は、光吸収性または光反射性（これらを合わせて光遮蔽性という。）を有する微粒子が少量の被膜形成能を有する親水性ポリマーバインダーに分散保持されている水透過性または水浸透性の層である。光遮蔽層は試薬層にて発生した検出可能な変化（色変化、発色等）を光透過性を有する支持体側から反射測光する際に、後述する展開層に点着供給された水性液体の色、特に試料が全血である場合のヘモグロビンの赤色等、を遮蔽するとともに光反射層または背景層としても機能する。

光反射性を有する微粒子の例としては、二酸化チタン微粒子（ルチル型、アナターゼ型またはブルカイト型の粒子径が約０．１μｍから約１．２μｍの微結晶粒子等）、硫酸バリウム微粒子、アルミニウム微粒子または微小フレーク等を挙げることができ、光吸収性微粒子の例としては、カーボンブラック、ガスブラック、カーボンミクロビーズ等を挙げることができ、これらのうちでは二酸化チタン微粒子、硫酸バリウム微粒子が好ましい。特に好ましいのは、アナターゼ型二酸化チタン微粒子である。

被膜形成能を有する親水性ポリマーバインダーの例としては、前述の試薬層の製造に用いられる親水性ポリマーと同様の親水性ポリマーのほかに、弱親水性の再生セルロース、セルロースアセテート等を挙げることができ、これらのうちではゼラチン、ゼラチン誘導体、ポリアクリルアミド等が好ましい。なお、ゼラチン、ゼラチン誘導体は公知の硬化剤（架橋剤）を混合して用いることができる。

光遮蔽層は、光遮蔽性微粒子と親水性ポリマーとの水性分散液を公知の方法により試薬層の上に塗布し乾燥することにより設けることができる。また光遮蔽層を設ける代りに、前述の展開層中に光遮蔽性微粒子を含有させてもよい。

（接着層）
試薬層の上に、場合によっては光遮蔽層等の層を介して、展開層を接着し積層するために接着層を設けてもよい。

接着層は水で湿潤しているとき、または水を含んで膨潤しているときに展開層を接着することができ、これにより各層を一体化できるような親水性ポリマーからなることが好ましい。接着層の製造に用いることができる親水性ポリマーの例としては、試薬層の製造に用いられる親水性ポリマーと同様な親水性ポリマーがあげられる。これらのうちではゼラチン、ゼラチン誘導体、ポリアクリルアミド等が好ましい。接着層の乾燥膜厚は一般に約０．５μｍから約２０μｍ、好ましくは約１μｍから約１０μｍの範囲である。

なお、接着層は試薬層上以外にも、他の層間の接着力を向上させるため所望の層上に設けてもよい。接着層は親水性ポリマーと、必要によって加えられる界面活性剤等を含む水溶液を公知の方法で、支持体や試薬層等の上に塗布する方法などにより設けることができる。

（吸水層）
本発明の多層分析要素には、支持体と試薬層の間に吸水層を設けることができる。吸水層は水を吸収して膨潤する親水性ポリマーを主成分とする層で、吸水層の界面に到達または浸透した水性液体試料の水を吸収できる層であり、全血試料を用いる場合には水性液体成分である血漿の試薬層への浸透を促進する作用を有する。吸水層に用いられる親水性ポリマーは前述の試薬層に使用されるもののなかから選択することができる。吸水層には一般的にはゼラチンまたはゼラチン誘導体、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、特に前述のゼラチン又は脱イオンゼラチンが好ましく、試薬層と同じ前述のゼラチンが最も好ましい。吸水層の乾燥時の厚さは約３μｍから約１００μｍ、好ましくは約５μｍから約３０μｍの範囲、被覆量では約３ｇ／ｍ²から約１００ｇ／ｍ²、好ましくは約５ｇ／ｍ²から約３０ｇ／ｍ²の範囲である。吸水層には後述するｐＨ緩衝剤、公知の塩基性ポリマー等を含有させて使用時（分析操作実施時）のｐＨを調節することができる。さらに吸水層には公知の媒染剤、ポリマー媒染剤等を含有させることができる。

（検出層）
検出層は、一般に、被検成分の存在下で生成した色素等が拡散し、支持体を通して光学的に検出され得る層で、親水性ポリマーにより構成することができる。媒染剤、例えばアニオン性色素に対してカチオン性ポリマーを、含んでもよい。吸水層は、一般に、被検成分の存在下で生成する色素が実質的に拡散しないような層を言い、この点で検出層とは区別される。

試薬層、吸水層、接着層、展開層等には界面活性剤を含有させることができる。その例としてノニオン性界面活性剤がある。ノニオン性界面活性剤の具体例として、ｐ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール、ｐ−ノニルフェノキシポリエトキシエタノール、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ｐ−ノニルフェノキシポリグリシドール、オクチルグルコシド等がある。ノニオン性界面活性剤を展開層に含有させることにより水性液体試料の展開作用（メータリング作用）がより良好になる。ノニオン性界面活性剤を試薬層又は吸水層に含有させることにより、分析操作時に水性液体試料中の水が試薬層または吸水層に実質的に一様に吸収されやすくなり、また展開層との液体接触が迅速に、かつ実質的に一様になる。

非繊維性多孔膜からなる多孔性液体試料展開層を試薬層、吸水層または接着層等の機能層にラミネートするには特開昭５５−１６４３５６、特開昭５７−６６３５９等に開示の方法に従うことができる。すなわち試薬層、吸水層または接着層等の機能層が塗布後未乾燥のうちに、または乾燥後の機能層に水、界面活性剤を含む水溶液、界面活性剤と親水性ポリマーを含む水溶液、有機溶媒または有機溶媒を含有する水溶液等をワイヤーバー塗布装置及びダイを用いた塗布装置等で実質的に均一に供給し、機能層を膨潤または溶解させ、ついで非繊維性多孔膜からなる多孔性液体試料展開層を膨潤または溶解している機能層の上に実質的に均一に軽く圧力をかけながらラミネートし、一体化する。機能層の膨潤または溶解に際しては、赤外線ヒーター等の輻射熱の照射による加温、支持体にヒーターを接触させ加温する方法等を用いることができる。

本発明の多層分析要素が対象とする被検物質は特に限定されず、任意の液体試料（例えば、全血、血漿、血清、リンパ液、尿、唾液、髄液、膣液などの体液；あるいは飲料水、酒類、河川水、工場廃水等）中の特定成分を分析することができる。例えば、アルブミン（ＡＬＢ）、グルコース、尿素、ピリルビン、コレステロール、タンパク質、酵素（例えば、乳酸脱水素酵素、ＣＰＫ（クレアチンキナーゼ）、ＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）、ＡＳＴ（アスパルテートアミノトランスフェラーゼ）、ＧＧＴ（γ−グルタミルトランスペプチダーゼ）等の血中酵素）などを分析することができる。

本発明の多層分析要素は、公知の方法により調製することができる。溶血試薬は塗布または含浸される試薬水溶液に予め加えておけばよい。他の方法としては、単独又は界面活性剤・展開面積制御のための親水性ポリマーなどを含む水溶液、有機溶媒（エタノール、メタノールなど）溶液又は水−有機溶媒混合液溶液を展開層の上から塗布して含浸させることもできる。これを用いた被験物質の分析も公知の方法に従って行なうことができる。

例えば、本発明の多層分析要素は、一辺約５ｍｍから約３０ｍｍの正方形またはほぼ同サイズの円形等の小片に裁断し、特公昭５７−２８３３３１号公報（対応米国特許４，１６９，７５１）、実開昭５６−１４２４５４号公報（対応米国特許４，３８７，９９０）、特開昭５７−６３４５２号公報、実開昭５８−３２３５０号公報、特表昭５８−５０１１４４号公報（対応国際公:ＷＯ０８３／００３９１）等に記載のスライド枠に収めて化学分析スライドとして用いることができ、これは製造，包装，輸送，保存，測定操作等の観点で好ましい。使用目的によっては、長いテープ状でカセットまたはマガジンに収めて用いたり、又は小片を開口のある容器内に収めて用いたり、又は小片を開口カードに貼付または収めて用いたり、あるいは裁断した小片をそのまま用いることなどもできる。

本発明の多層分析要素は、例えば約２μＬ〜約３０μＬ、好ましくは４μＬ〜１５μＬの範囲の水性液体試料液を、多孔性液体試料展開層に点着する。点着した多層分析要素を約２０℃〜約４５℃の範囲の一定温度で、好ましくは約３０℃〜約４０℃の範囲内の一定温度で１〜１０分間インキュベーションする。多層分析要素内の発色又は変色を支持体側から反射測光し、予め作成した検量線を用いて比色測定法の原理により検体中の被験物質の量を求めることができる。

測定操作は特開昭６０−１２５５４３号公報、特開昭６０−２２０８６２号公報、特開昭６１−２９４３６７号公報、特開昭５８−１６１８６７号公報（対応米国特許４，４２４，１９１）などに記載の化学分析装置により極めて容易な操作で高精度の定量分析を実施できる。なお、目的や必要精度によっては目視により発色の度合いを判定して、半定量的な測定を行ってもよい。

本発明の多層分析要素は、分析を行うまでは乾燥状態で貯蔵・保管されるため、試薬を用時調製する必要がなく、また一般に乾燥状態の方が試薬の安定性が高いことから、試薬溶液を用時調製しなければならないいわゆる湿式法より簡便性、迅速性に優れている。また、微量の液体試料で、精度の高い検査を迅速に行うことができる検査方法としても優れている。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。

実施例１：各種展開層素材を用いたＡＬＢ分析用分析要素の展開層下層の表面粗さと測定精度の比較
（１）ポリスルホン膜を展開層に用いたＡＬＢ分析用多層分析要素の作製方法
ゼラチン下塗りされている１８０μｍのポリエチレンテレフタレート無色透明平滑フィルムに下記組成の水溶液（ｐＨ＝２．８）を、下記の被覆量になるように塗布、乾燥し試薬層とした。
アクリルアミド-N-ビニルピロリドン−メタクリルアルコール共重合体 49.6ｇ／ｍ²
ＤＬ−リンゴ酸 4.8ｇ／ｍ²
ブロモクレゾールグリーン 0.7ｇ／ｍ²
グリセリン 4.8ｇ／ｍ²
ポリオキシ（２−ヒドロキシ）プロピレンノニルフェニルエーテル 1.5ｇ／ｍ²

次に上記試薬層上に約１５ｇ／ｍ²の供給量で水−エタノール（１：１）混合液を全面に供給して湿潤させた後、ポリスルホン膜（ＳＥ−２００：富士写真フイルム社製、以下ＰＳ膜とする）を軽く圧力をかけて積層し、乾燥させて、接着させた。
以上によりポリスルホン膜を展開層に用いたＡＬＢ分析用多層分析要素を作製した。

上記の多層分析要素を１２ｍｍ×１３ｍｍ四方のチップに裁断し、スライド枠（特開昭５７−６３４５２号公報に記載）に収めて、ＡＬＢ分析用スライド１を作製した。

（２）編物布地を展開層に用いたＡＬＢ分析用多層分析要素の作製方法
試薬層までは（１）ポリスルホン膜を展開層に用いたＡＬＢ分析用多層分析要素の作製方法と同様に作製し、試薬層上に約３０ｇ／ｍ²の供給量で水−エタノール（１：１）混合液を全面に供給して湿潤させた後、５０デニール相当のポリエチレンテレフタレート紡績糸を３６ゲージ編みしたトリコット編物布地（以下編物布地とする）を軽く圧力をかけて積層し、乾燥させて、接着させた。

上記布地上に、下記組成のエタノール溶液を下記の被覆量になるように塗布、乾燥させ、編物布地を展開層に用いたＡＬＢ分析用多層分析要素を作製した。
ポリビニルピロリドン 6.6ｇ／ｍ²
ＤＬ−リンゴ酸 6.6ｇ／ｍ²
ポリオキシエチレン（７）オレイルエーテル 3.3ｇ／ｍ²

上記の多層分析要素を１２ｍｍ×１３ｍｍ四方のチップに裁断し、スライド枠（特開昭５７−６３４５２号公報に記載）に収めて、ＡＬＢ分析用スライド２を作製した。

（３）展開層下層の表面粗さ比較
上記ＡＬＢ分析用スライド１、２より展開層を剥離し、展開層下層の表面粗さを蝕針式の表面粗さ計（小坂研究所製 ＳＥ３５００Ｋ）を用いて測定した時の、算術平均粗さ（Ｒａ）及び十点平均粗さ（Ｒｚ）の比較を行なった。結果を表１及び図１に示す。

（４）展開層下層の表面粗さと測定精度の関係
上記ＡＬＢ分析用スライド１、２にＡＬＢ濃度が１．７、３．９、６．０ｇ／ｄｌの管理血清を１０μＬ点着した。この後、各スライドを３７℃でインキュベーションし、支持体側から６２５ｎｍの反射光学濃度を測定し、点着後４分後の反射光学濃度を求め、測定精度（標準偏差＜ＳＤ＞ｇ／ｄｌ）を比較した。表２に測定精度比較結果を示す。

ＰＳ膜を展開層に用いたＡＬＢ分析用多層分析要素１は編物布地を展開層に用いたＡＬＢ分析用多層分析要素２に比べ、展開層下層の表面粗さが小さく、展開層接着による下層の乱れが非常に小さいことが確認された。また、その下層の乱れが非常に小さいＡＬＢ分析用多層分析要素１は、測定精度も改善することが確認された。

実施例２：各種展開層素材を用いた反射光量のムラ及び測光面積を小さくしたときの測定バラツキの比較
（１）ポリスルホン膜を展開層に用いた反射光量測定用多層分析要素の作製方法
ゼラチン下塗りされている１８０μｍのポリエチレンテレフタレート無色透明平滑フィルムに下記組成の水溶液（ｐＨ＝５．１）を、下記の被覆量になるように塗布、乾燥し吸水層とした。

ゼラチン 16.6ｇ／ｍ²
ポリオキシ（２−ヒドロキシ）プロピレンノニルフェニルエーテル 0.2ｇ／ｍ²

次に上記試薬層上に約１５ｇ／ｍ²の供給量で水を全面に供給して湿潤させた後、ポリスルホン膜（ＳＥ−２００：富士写真フイルム社製、以下ＰＳ膜とする）を軽く圧力をかけて積層し、乾燥させて、接着させた。以上によりポリスルホン膜を展開層に用いた反射光量測定用多層分析要素を作製した。

上記の多層分析要素を１２ｍｍ×１３ｍｍ四方のチップに裁断し、スライド枠（特開昭５７−６３４５２号公報に記載）に収めて、反射光量測定用スライド１を作製した。

（２）編物布地を展開層に用いた反射光量測定用多層分析要素の作製方法
試薬層までは（１）ポリスルホン膜を展開層に用いた反射光量測定用多層分析要素の作製方法と同様に作製し、試薬層上に約３０ｇ／ｍ²の供給量で水を全面に供給して湿潤させた後、５０デニール相当のポリエチレンテレフタレート紡績糸を３６ゲージ編みしたトリコット編物布地（以下編物布地とする）を軽く圧力をかけて積層し、乾燥させて、接着させた。以上により編物布地を展開層に用いた反射光量測定用多層分析要素を作製した。

上記の多層分析要素を１２ｍｍ×１３ｍｍ四方のチップに裁断し、スライド枠（特開昭５７−６３４５２号公報に記載）に収めて、反射光量測定用スライド２を作製した。

（３）反射光量のムラ比較
上記反射光量測定用スライド１、２を、図２に示すような光学配置の測光系を用いて支持体側から測定し、直径６ｍｍの測光面積を３３μｍ／ピクセルで反射測光したときの反射ＯＤの変動係数（ＣＶ（％））を比較した。結果を表３に示す。

光学系；倒立の実体顕微鏡の光学系を使用。ＣＣＤ受光部での倍率は、１倍；ＣＣＤ部分で１０μｍ／ピクセル、０．３３倍；ＣＣＤ部分で３３μｍ／ピクセル
光源；林時計工業株式会社製のルミナーエース ＬＡ−１５０ＵＸ
干渉フィルタ ６２５ｎｍ，５４０ｎｍ，５０５ｎｍで各々単色化
減光フィルタ；ＨＯＹＡ株式会社製のガラスフィルタ ＮＤ−２５およびステンレス板に孔をあけた自家製フィルタを使用。
ＣＣＤ；ＳＯＮＹ株式会社製の８ビット白黒カメラモジュール ＸＣ−７５００を使用。
データ処理；株式会社ニレコ製の画像処理装置 ＬＵＺＥＸ−ＳＥを用いて、得られた画像を処理して計測。

反射光学濃度を校正するための手段として、富士機器工業株式会社製の標準濃度板（セラミック仕様）を使用。標準濃度板は、Ａ００（反射光学濃度〜０．０５）、Ａ０５（同０．５）、Ａ１０（同１．０）、Ａ１５（同１．５）、Ａ２０（同２．０）、Ａ３０（同３．０）の６種類を使用した。

編物布地を展開層に用いた反射光量測定用スライド２は編目の影響で反射ＯＤのＣＶが非常に大きいのに対し、ＰＳ膜を用いた反射光量測定用スライド１は反射ＯＤのＣＶが極めて小さいことが確認できた。

（３）測光面積を小さくしたときの測定バラツキの比較
上記反射光量測定用スライド１、２を図２に示すような光学配置の１０μｍ／ピクセルの測光系を用いて、支持体側から測光面積が直径３ｍｍから直径０．４ｍｍの場合で、各ｎ＝１０の出し入れを繰り返し反射測光し、各測光面積毎の標準偏差（ＳＤ）を比較した。このとき比較対照として標準濃度板Ａ０５についても同様の測定を実施した。結果を表４及び図３に示す。

編物布地を展開層に用いた反射光量測定用スライド２は測光面積を縮小すると反射ＯＤの標準偏差が大きくなるのに対し、ＰＳ膜を用いた反射光量測定用スライド１は標準偏差の変動が小さく、液体試料の微量化による測光面積の縮小化に際しても、高精度の測定が可能となる。

図１は、各種展開層素材を用いたＡＬＢ分析用分析要素の展開層下層の表面粗さを示す。 図２は、実施例で用いた測光系の光学配置を示す。 図３は、光学濃度の標準偏差（SD）と測光面積との関係を示す。

符号の説明

１００ 物質量測定装置
１ 検体設置部
２ 光源
３ 光可変部
４ 波長可変部
５ａ，５ｂ，５ｃ レンズ
６ エリアセンサ
７ コンピュータ

Claims (4)

1. 水不透過性平面支持体の片面上に、少なくとも１つの機能層と少なくとも１つの非繊維性多孔膜からなる多孔性液体試料展開層がこの順に積層一体化された液体試料分析用多層分析要素において、非繊維性多孔膜からなる多孔性液体試料展開層と接触する少なくとも１つの機能層の接触面の算術平均粗さ（Ｒａ）が０．４μｍ以下および十点平均粗さ（Ｒｚ）が２．０μｍ以下であり、非繊維性多孔膜が、６，６−ナイロン、６−ナイロン、ポリエーテルスルホン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホンとポリスルホンの混合物、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリオレフィン、ポリアクリロニトリル、ポリビニルアルコール、ポリカーボネート、ポリエステルカーボネート、ポリフェニレンオキシド、ポリアミド、ポリイミド、ポリアミドイミド、セルロースアセテート、セルロースアセテートの鹸化物またはこれらの混合物からなる多孔膜である、液体試料分析用多層分析要素。
2. 有機高分子からなる多孔膜が非対称性多孔膜であり、非対称率が２．０以上である、請求項１記載の液体試料分析用多層分析要素。
3. 有機高分子からなる多孔膜が対称性多孔膜であり、非対称率が２．０未満である、請求項１記載の液体試料分析用多層分析要素。
4. 非繊維性多孔膜が、ポリエーテルスルホン、ポリスルホン、セルロースアセテート、セルロースアセテートの鹸化物またはこれらの混合物からなる多孔膜である、請求項１から３の何れかに記載の液体試料分析用多層分析要素。

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