JPS6125063A - リパ−ゼ定量用試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、リパーゼ定量用試薬に関し、特に濁り測定に
よるリパーゼ定量用試薬に関する。

［従来技術１ 臨床診断において血清中あるいは尿中のリパーゼ活性を
定量することは膵臓炎等の診断に有用である。

リパーゼは、脂肪酸残基を有するトリグリセリドのエス
テル結合を切断してジグリセリド、モノグリセリドおよ
び脂肪酸に分解する酵素である。

このリパーゼの測定法としては、滴定による方法、濁り
測定のいわゆる比濁による方法、合成基質を用いる比色
による方法等種々の方法が知られており、実際に利用さ
れている。しかしながら、滴定による方法は、部分的な
取り扱いの困難性、長い反応時間および多量の試料の必
要なこと等のために、日常の臨床化学検査には汎用され
ていない。

合成基質を用いる比色による方法は、特異性、定量性等
に欠けるという欠点がある。一方、トリグリセリド−水
エマルジョンの濁りの清２’ｆｌ化を光度測定してリパ
ーゼ活性を追跡する比濁による方法は、」二記の欠点を
ほとんど回避できる。しかし、比濁による方法において
は、必須成分としてコリパーゼと尿素が共存しなければ
ならない。該成分は、高含量の胆汁酸塩により惹起され
る酵素の阻害を取り除外かつ反応の進行の直線性を改良
すること、およびエマルジョンの水−油表面に対して影
響を及ぼしかつエマルジョンを安定化させることによっ
て、反応動力学的に直線状に反応を経過させる作用が考
えられるＥ特公昭５７−２８２７５号公報参照１゜すな
わち、該成分が存在しなければ、反応が直線的に進行せ
ず、酵素反応が阻害される現象がみられる。ところが、
コリパーゼを用いると２５〜３０℃という比較的低い温
度でしか測定を行なうことかで終ず、更にコリパーゼは
安定性が悪く、また高価であるという欠点も有している
。

［発明の目的１ 本発明の目的は、比濁によるリパーゼの測定に一３＝ おいて用いることができる、コリパーゼおよび尿素を含
まないリパーゼ定量用試薬を提供することにある。

［発明の構成１ 本発明の要旨は、（イ）液状トリグリセリド、（ロ）ア
ルキル硫酸塩およびアルキルスルホン酸塩から成る群か
ら選ばれた少なくとも１種のアニオン界面活性剤、 （ハ）胆汁酸もしくはそのアルカリ塩、（ニ）活性化剤
、 （ホ）ｐＨ７〜１０を保持する緩衝剤 を含んで成るリパーゼ定量用試薬に存する。

本発明の特徴は、トリグリセリド−水エマルジョンの濁
りの清澄化を光度測定してリパーゼ活性を追跡する比濁
による方法において、反応系中にアニオン界面活性剤を
存在させることにある。

ところで、Ｓ−アシルエステルを基質としてリパーゼ活
性を比色法にて定量する方法において、血清中のアルブ
ミンは一定過剰存在するとリパーゼ活性を阻止するが、
この阻止効果はアニオン界面活性剤（主に５ＤＳ）の添
加により回復されることが知られている［特公昭５８−
４５５９号公報１゜しかし、該公報の記載によれば、Ｓ
ＤＳ濃度０〜２．０ｍＭの範囲で、牛血清アルブミン（
ＢＳＡ）が０〜２Ｈ／ｍ（ｌ濃度存在する場合、リパー
ゼ活性はＢＳＡ濃度に依存して大軽く変化することが示
されている。従って、Ｓ−アシルエステルを基質として
リパーゼ活性を比色定量する方法においては、ＳＤＳの
添加によってリパーゼ活性に及ぼすアルブミンの影響を
解除したものではない。すなわち、ＳＤＳ無添加のと外
には、リパーゼ活性はＢＳＡ濃度添加のと外に比べてＢ
ＳＡｏ、２５νｇ／ｍｌの存在下で活性化されるが、Ｂ
ＳＡ濃度が０．５〜２ｍｇ／ｄにかけてリパーゼ活性が
今度はＢＳＡによって阻害される。しかしながら、ＳＤ
Ｓ添加によって、リパーゼ活性のＢＳＡ濃度依存の逆転
現象がみられなくなり、リパーゼ活性はＢＳＡ濃度の上
昇と共に増大することが示されている。

従って、本発明におけるアニオン界面活性剤の添加の効
果とＳ−アシルエステルを基質として用いる該公報記載
の方法におけるアニオン界面活性剤の添加の効果は、明
らかに異なるものであると考えられる。

本発明の定量用試薬を用いてリパーゼを定量するには、
まず、トリス緩衝液の始終公知の緩衝液に胆汁酸もしく
はそのアルカリ塩、アニオン界面活性剤、活性化剤、要
すれば保存剤を添加した溶液に、攪拌下でトリグリセリ
ドの溶液（水溶性有機溶媒溶液）を加えてエマルジョン
を形成させ、基質を調製する。

基質液を一定時間（通常５〜１０分）、室温よりやや高
温（たとえば３０〜４０℃）に保った後、血清または尿
の始終検体を加えて、光度計によって吸光度の変化を測
定することにより行える。

トリグリセリドとしては、炭素原子数的４〜２２の脂肪
酸残基を有する天然並びに合成のトリグリセリドが好ま
しい。これらのトリグリセリドの中でも、カルボキシエ
ステラーゼや他のエステラーゼによって加水分解を受け
ず、リパーゼによって特異的に加水分解される長鎖の不
飽和脂肪酸残基を有するトリグリセリド、特にその脂肪
酸残基が炭素原子１０〜２０個を有し、かつ、炭素−炭
素二重結合１〜８個、特に好ましくは１〜３個を有する
トリグリセリドが好ましい。特にトリオレインとオリー
ブ油がトわめて好適である。

また、本発明で基質としで用いられるトリグリセリド溶
液は水溶性有機溶媒の溶液として調製され、トリグリセ
リドの濃度は５〜２０ｍＭが好適である。水溶性有機溶
媒としては、たとえばエタノールが好ましく用いられる
。

基質液エマルジョンの調製は、胆汁酸もしくは胆汁酸塩
、アニオン界面活性剤、活性化剤、要すれば保存剤を含
有する緩衝液にトリグリセリド溶液を攪拌下で添加する
ことによって行い得る。該基質液におけるトリグリセリ
ドの濃度は通常０゜１〜０．５ｍＭである。

胆汁酸としては、公知のデオキシコール酸、タウロデオ
キシコール酸もしくはそのアルカリ塩、例えばナトリウ
ム塩が該当する。その濃度は０゜１〜０．７（重量／容
量）％が好適である。

アニオン界面活１．性剤は、アルキル硫酸塩およびアル
キルスルホン酸塩、特にナトリウム塩およびリチウム塩
の中から選ばれる。就中、アルキル残基の炭素数が１０
〜２０であるものが好ましく。

特に、リパーゼの反応直線性を改良する効果が大軽く、
入手が容易であるラウリル酸ナトリウム（ＳＤＳ）の使
用が最も好ましい。アニオン界面活性剤の添加量は、０
．０１〜０．５（重量／容量）％が好適である。活性化
剤はカルシウムイオンであり、その濃度は０．０１〜０
．１ｍＭが好ましい。

緩衝剤としては、ｐＨ値を７〜１０に調節し得るすべて
の公知の緩衝剤を用いることができる。特に優れた緩衝
剤はトリス−緩衝剤であり、１０〜５０ｍＭ濃度が特に
好ましい緩衝剤の濃度である。

保存剤としては、本発明の範囲内ではリパーゼの酵素活
性を阻害しないアジ化アルカリが好適である。保存剤の
好ましい量は０．００５〜０．０１重量％である。

以上記述したリパーゼ定量用試薬は、それぞれ性状なら
びに使用目的に応じた形態で保存するのがよい。例えば
、トリグリセリドは水溶性有機溶媒の溶液として保存す
るのが良く、胆汁酸、アニオン界面活性剤、活性化剤、
保存剤は緩衝液中に溶解させて保存するのが良い。

［発明の効果］ 本発明によれば、従来の比濁による方法のリパーゼ定量
法において、反応の直線性を改良するための必要成分で
あったコリパーゼおよび尿素を用いることなしに、アニ
オン界面活性剤の添加および胆汁酸もしくはそのアルカ
リ塩の使用によって、反応の直線性を改良し、血清中ま
たは尿中リパーゼの活性を特異的にしかも高感度で定量
することが可能となる。

以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明する。

実施例１ 試薬の調製 （、）基質原液（１０ｍＭ）リオレイン）１０ｍＭ）リ
オレインの無水エタノール溶液を調製し、基質原液とす
る。

（ｂ）デオキシコール酸塩（０，１〜０．７％）、５Ｄ
Ｓ（０，０１〜０．５％）、塩化カルシウム（０，０１
〜０．１００Ｍ）およびアジ化ナトリウムｏ、ｏ　ｉ％
を含む２５ｍＭ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ９，２）を調
製して緩衝液とする。

これらをリパーゼの定量に供する為、以下のようにして
基質液を調製する。すなわち、緩衝液１５０ｍ１を攪拌
しながら、（、）基質原液５社を添加することによって
基質液を調製する。この基質液をリパーゼの定量に用い
る。なお、少数の検体を定量する場合には、緩衝液と基
質原液の必要量を分取し、前記に準じて基質液を調製し
、リパーゼの定量に供し、残りの緩衝液および基質原液
は２〜８℃で保存するのが望ましい。

実施例２ リパーゼの一般的定量法 ［試薬１ （ａ）基質原液（１０ＴｏＭ）ジオレイン）（ｂ）、緩
衝液 ［定量方法］ 光路長１ｃｉのキュベツト（３１容）に試薬（、）およ
び（Ｉ））から調製した基質液２．５ｍｌをとり３７℃
で５分間装置し、適量の検体（ヒトの血清なら１００μ
ｐ）を混合し、３４０ｎｍで３７°Ｃで水に対して光度
計により測定する。光度計で吸光度の変化を測定し、単
位時間当りの吸光度変化を求め、リパーゼ活性を測定す
る。

検体混合前の基質液の吸光度をＡ　ｓｕｌ＋、検体混合
後の吸光度をＡ。ｍｉｎ、そして５分後の吸光度をＡｓ
　ｍｉｎとすると、検体１リットル当りのリパーゼ活性
は次の式によって求められる：　ｓｕｂ ここで述べるリパーゼ活性の単位は、３７℃で１分間に
１μｍｏｌのトリオレインを分解する活性を１単位とし
ている。

比較例 ヒト血清にヒト膵臓より抽出し精製したリパーゼを一定
量添加し、その１００μｌを用い緩衝液中のＳＤＳの代
りに他の界面活性剤（トリトンＸ−１００、ブリージー
３５およびツイーン−２０）を加える他は実施例２と同
様にしてリパーゼ活性を測定した。

その結果、これらの界面活性剤はリパーゼの活性をむし
ろ阻害し、ＳＤＳ添加によって得られた反応の直線性の
改善は見られなかった。

実施例３ ヒト膵リパーゼの一定量をヒトプール血清中に添加した
ものならびに１０ｍＭ）リス緩衝液（ｐＨ８）中に添加
したものをそれぞれ検体とし、基質液中のＳＤＳ濃度を
Ｏもしくは０．０５％と変化させたこと以外は実施例２
と同様にリパーゼ活性を測定し、第１図の結果を得た。

第１図から明らかなように、１０ｍＭ）リス緩衝液検体
ではＳＤＳの添加の有無にかかわらず、吸光度の減少速
度すなわちリパーゼ活性はほぼ等しく、しかも、反応動
力学的に直線状に反応が進行している。しかし、血清検
体では、ＳＤＳを添加しない場合には反応の進行が直線
状ではなく、反応途中で吸光度の減少速度が急減し、リ
パーゼ活性が阻害されている。一方、”５Ｄ３０．０５
％添加した場合には、そのような反応途中での阻害が取
除かれ、直線状に反応が進行し、緩衝液検体と同等のリ
パーゼ活性を示しており、５ＤＳ０゜０５％添加により
血清中のリパーゼ活性を正確に定量し得ることが理解さ
れる。

また、リパーゼ血清を測定した試料をｎ−ヘキサンで抽
出し濃縮した後、シリカゲルＧによる薄層クロマトグラ
フィによって生成物を分析した。

その結果、ＳＤＳ濃度０．０５％の試料において、トリ
オレインのリパーゼによる分解産物であるジオレイン、
モノオレインおよび脂肪酸が確認され、血清を含まない
緩衝液検体で得られたＳＤＳ濃度０％のと鰺の分解産物
と同一であった。従って、ＳＤＳ添加によって認められ
る基質液の吸光度の減少は、リパーゼ活性を反映してい
ることが判った。

実施例４ ヒト膵リパーゼの一定量をヒトブール血清ならびに１０
ｍＭ）リス緩衝液検体（ｐＨ８）中に添加したものを検
体とし、ＳＤＳ濃度を変化させたことならびに３μｇの
コリパーゼを添加あるいは無添加したこと以外は、実施
例２と同様にしてリパーゼ活性を測定し、第２図の結果
を得た。

第２図から明らかなように、１）Ｓ　Ｄ　Ｓ濃度０％で
は血清検体のリパーゼ活性は１０ａＩＭ）リス緩衝液検
体のそれの約５０％に抑制されているが、ＳＤＳの添加
によって血清検体のリパーゼ活性の抑制は解除され、１
０ｍＭ）リス緩衝液検体と同等もしくはそれ以上のリパ
ーゼ活性が発現されること、２）コリパーゼの添加によ
ってＳＤＳ濃度０％での血清検体のリパーゼ活性の抑制
が解除されるのと同等に、ＳＤＳ添加によってリパーゼ
活性の抑制が解除されること、３）ＳＤＳ添加によって
回復したリパーゼ活性はコリパーゼの添加によっては、
もはやそれ以上には活性化され得ないこと、４）Ｓ　Ｄ
　Ｓ濃度が０．０１〜０．１％の範囲で最も効果的ｌこ
リパーゼ活性の抑制を回復させ得ることが判る。

実施例５ 種々のリパーゼ活性をもつヒト膵リパーゼをヒトプール
血清中あるいは１０ｍＭ）リス緩衝液検体（ｐｔ１８）
中に添加したものを検体とし実施例２と同様にしてリパ
ーゼ活性を測定し、第３図の結果を得た。

第３図から明らかなように、測定したリパーゼ活性は添
加したリパーゼ量に比例しでいること、ならびに血清検
体と１．０ｍＭ　　）　’）ス緩衝液検体との間でリパ
ーゼ活性の値に差がみられないことを考慮した場合、本
測定系においては、血清検体中のリパーゼを特異的ｔこ
しかも添加したリパーゼ活性を正確に、いわゆる理想的
な添加回収率で測定し得ることが判る。

実施例６ 一定量のヒト膵リパーゼをヒトプール血清もしくは１０
ｍＭ）リス緩衝液中に添加したものを検体とし、緩衝液
中のＳＤＳ濃度を０％もしくは０゜０５％とし、それぞ
れに牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を最終濃度でＯ〜２１
１ｇ／ｍ１濃度となるように調製した緩衝液を用いた以
外は実施例２と同様にしてリパーゼ活性を測定し、第４
図の結果を得た。

第４図から明らかなように、血清検体をＳＤＳ濃度０％
で測定した場合には、ＢＳＡ濃度と上昇と共にリパーゼ
活性の抑制が認められたが、１０ｍＭ）リス緩衝液検体
ではリパーゼ活性はＢＳＡ濃度とは無関係に一定であり
、ならびにＳＤＳ濃度０．０５％は両方の検体共に、Ｂ
ＳＡ濃度とは無関係に一定のリパーゼ活性を示す。従っ
て、特公昭５８−４５５９号公報に示されたようなリパ
ーゼ活性がＳＤＳ添加によってもＢＳＡ濃度に大きく依
存する現象は、本測定系においては認められないことが
判る。

実施例７ ５例のヒト血清中のリパーゼ活性を本発明試薬（実施例
２）および市販のキット（ベーリンガー・マンハイム社
）（特公昭５７−２８２７５号公報に記載のキット）を
用いて測定し、次の結果を得た。

５６．１　　　　　　　１８７，４ ｂ　　　　　　　９１．ｊ　　　　　　　３４４．５０
．０　　　　　　　　２４，５ ｄ　　　　　　　４．２．０　　　　　　　１５４，１
ｅ　　　　　　　４５．３　　　　　　１５４．１注　
京１３７℃ ＊２　３０°Ｃ 上表から本法とベーリンガー社との相関を求めると、次
の通りであった： Ｙ　＝　Ｑ、２８３Ｘ−２，０１γ＝　０．９９１（Ｘ
：ベーリンガー社、Ｙ二本発明）。

従って、本発明に従って測定したリパーゼ活性とベーリ
ン〃−社の方法で測定したリパーゼ活性との間に相関係
数０．９９１　　と非常に良好な相関が得られた。なお
、本発明とベーリンガー社法とはリパーゼ活性の表示単
位が異なるため、回帰式４式％ 考慮した場合、本法で得られた値に３．５を乗ずること
によって、国際単位（Ｕ）への変換も可能である。

さらに、本発明に従って測定したリパーゼ活性の日間再
現性（ｎ＝１０）は６．０−１３．７％であり、同時再
現性（ｎ＝１０）は２．１〜９．２％であり、本発明に
よって血清中のリパーゼ活性を精確に測定できることが
判る。

実施例８ 通常血清検体では記述のように、ＳＤＳを添加すること
によってリパーゼ活性を定量することが可能であるが、
血清中には、リパーゼ活性に対し阻害や干渉作用を示す
物質がしばしば混入する場合がある。そのような物質と
してヘモグロビン（臨床検査２０．７５−７７．１９７
６）、高値のトリグリセリド検体（治療６４．１７９−
１８３．１９８２）、乳濁検体、さらに高値のビリルビ
ン検体等が挙げられるが、本測定法がこれらのいずれの
物質にも干渉、阻害されることなくリパーゼ活性を定量
することができた。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例３におけるＳＤＳの有無による血清検
体ならびに緩衝液検体のリパーゼ活性測定のチャート、
第２図は、実施例４におけるリパーゼ活性に及ぼすＳＤ
Ｓ濃度の効果を示す図、第３図は、実施例５におけるリ
パーゼ量とリパーゼ活性の関係を示す図、および第４図
は、実施例６におけるリパーゼ活性に及ぼすＢＳＡの影
響を示す図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、（イ）液状トリグリセリド、 （ロ）アルキル硫酸塩およびアルキルスルホン酸塩から
   成る群から選ばれた少なくとも１種のアニオン界面活性
   剤、 （ハ）胆汁酸もしくはそのアルカリ塩、 （ニ）活性化剤、 （ホ）ｐＨ７〜１０を保持する緩衝剤 を含んで成るリパーゼ定量用試薬。 ２、トリグリセリドの脂肪酸残基が、炭素原子１０〜２
   ０個および炭素−炭素二重結合１〜８個を有している特
   許請求の範囲第１項記載のリパーゼ定量用試薬。 ３、トリグリセリドの濃度が、０．２〜３．０重量％で
   ある特許請求の範囲第１項または２項記載のリパーゼ定
   量用試薬。 ４、トリグリセリドを水溶性有機溶媒の溶液として含む
   特許請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載のリパーゼ
   定量用試薬。 ５、アルキル硫酸塩およびアルキルスルホン酸塩のアル
   キル残基が炭素原子１０〜２０個を有している特許請求
   の範囲第１〜４項のいずれかに記載のリパーゼ定量用試
   薬。 ６、アルキル硫酸塩およりアルキルスルホン酸塩が、ナ
   トリウム塩またはリチウム塩である特許請求の範囲第５
   項記載のリパーゼ定量用試薬。 ７、アニオン界面活性剤の濃度が、０．０１〜０．５（
   重量／容量）％である特許請求の範囲第１〜５項のいず
   れかに記載のリパーゼ定量用試薬。 ８、胆汁酸もしくはそのアルカリ塩が、デオキシコール
   酸もしくはデオキシコール酸塩である特許請求の範囲第
   １〜７項のいずれかに記載のリパーゼ定量用試薬。 ９、胆汁酸もしくはアルカリ塩の濃度が、０．１〜１．
   ０（重量／容量）％である特許請求の範囲第１〜７項の
   いずれかに記載のリパーゼ定量用試薬。