JP6891368B2 - アミラーゼ活性測定試薬及びアミラーゼ活性測定方法 - Google Patents
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Description
本発明は、生化学自動分析装置において用いられるアミラーゼ活性測定試薬及び測定方法に関する。
α−アミラーゼ（ＡＭＹ）は、膵臓、唾液腺に高濃度に存在し、デンプン、グリコーゲンなどの多糖類のα−１,４−グリコシド結合を加水分解してグルコースなどを生成する酵素である。ヒト体液中のＡＭＹには膵型（Ｐ−ＡＭＹ）と唾液腺型（以下、Ｓ−ＡＭＹ）の２種類のアイソザイムが存在する。これらＡＭＹ活性測定するにあたっては、合成基質が異なるさまざまなＡＭＹ活性測定試薬が用いられていたが、基質による反応性の違いから、測定法間で基準範囲が異なるといった問題があった。そこで、１９９８年、国際臨床化学連合（ＩＦＣＣ）により、４,６-Ethyldene(G1)-4-nitrophenyl(G7)-α-（1→4）-D-Maltoheptaoside（以下ＥＮＭ）を基質としたアミラーゼ活性測定の勧告法が公表され、２００４年には日本臨床検査標準協議会（ＪＣＣＬＳ）により、ＩＦＣＣ勧告法がＪＣＣＬＳ-標準測定操作法（ＪＣＣＬＳ-ＳＯＰ法）として認証された。さらに、２００５年１０月、同基質を用いた方法が日本臨床化学会（ＪＳＣＣ）より、勧告法として承認された（非特許文献１）。
ＪＣＣＬＳ-ＳＯＰ法を用いたＡＭＹ測定には、生化学自動分析装置を用いた分析が常用される。生化学自動分析装置を用いた分析は、多数の検体を短時間で測定でき、効率的な分析を実現できる一方で、分析装置内のセルの汚れ、セル表面における気泡の発生、測定試薬を適切に吸引できないといったことが原因で、再現性が担保できないとの問題があることから、かかる問題を解決するために、いわゆる市販キットと呼ばれるＡＭＹ活性測定試薬においては、測定試薬に界面活性剤を添加することが一般的である（特許文献１等）。
しかしながら、ＪＣＣＬＳ-ＳＯＰ法と同じ試薬組成を用いた、あるいはＪＣＣＬＳ-ＳＯＰ法と同じ測定原理を用いたＡＭＹ活性測定試薬に界面活性剤を添加した場合、上記問題の解決はなされるものの、界面活性剤が反応性に影響し、ＪＣＣＬＳ-ＳＯＰ法との反応性が異なることが問題となっていた。具体的には、血清および血漿検体に対し尿検体での反応性が異なる、また逆に尿検体に対し血清および血漿検体の反応性がＪＣＣＬＳ-ＳＯＰ法と異なるといった課題を有していた。
学会誌 臨床化学 Vol.３４：３５０−３７２（２００５）
したがって、本発明の目的は、ＪＣＣＬＳ-ＳＯＰ法の反応性に影響をしないＡＭＹ活性測定試薬及びＡＭＹ活性測定試薬方法を提供するものである。
上記目的に鑑み、本発明者らは、ＪＣＣＬＳ-ＳＯＰ法の反応性に影響をしないＡＭＹ測定試薬及びＡＭＹ測定試薬方法について鋭意検討する中で、特定構造を有する界面活性剤が、ＪＣＣＬＳ-ＳＯＰ法の反応性に影響を与えることなく、ＡＭＹ活性が測定できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下に関する。
［１］ ＥＮＭを基質として、α−グルコシターゼを共役酵素として含む、ＡＭＹ活性測定試薬において、下記一般式（１）
（一般式中、Ｒ１は、炭素数４〜１２の直鎖状または分岐状のアルキル基、Ｒ２、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5は、互いに同一である又は互いに異なる、水素原子、炭素数１〜４の直鎖状または分枝状のアルキル基、Ｘは、２０〜４５である。）よりなる構造の非イオン性界面活性剤を含有することを特徴とする、試料中のＡＭＹ活性測定試薬に関する。
［１］ ＥＮＭを基質として、α−グルコシターゼを共役酵素として含む、ＡＭＹ活性測定試薬において、下記一般式（１）
［２］ ［１］に記載のＡＭＹ活性測定試薬により、生化学自動分析装置を用いて試料中のＡＭＹ活性を測定する方法に関する。
本発明により、ＪＣＣＬＳ-ＳＯＰ法の反応性に影響を与えることなく、ＡＭＹ活性測定できる。
本発明は、ＡＭＹ活性測定試薬に、下記一般式（１）よりなる構造の非イオン界面活性剤が含有されることにより、ＪＣＣＬＳ-ＳＯＰ法の反応性に影響を与えることなく、試料中のＡＭＹ活性を測定できる。
以下に本発明の実施形態について詳述する。
本発明は、ＥＮＭを基質として、α−グルコシターゼを共役酵素として含む、ＡＭＹ活性測定試薬において、下記一般式（１）
よりなる構造を特徴とする界面活性剤を含有することを特徴とする、試料中のＡＭＹ活性測定試薬である。
一般式（１）中、Ｒ１は、炭素数４〜１２の直鎖状または分岐状のアルキル基であれば特に限定されなれいが、血清、血漿、尿等の検体種別にかかわらず、よりＪＣＣＬＳ-ＳＯＰ法との反応性が近似するとの理由により、炭素数６〜１０が好ましく、炭素数８がさらに好ましい。また、直鎖状と分岐状では、分岐状が好ましい。
一般式（１）中、Ｒ２、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5は、互いに同一である又は互いに異なる、水素原子、炭素数１〜４の直鎖状または分枝状のアルキル基であれば特に限定されないが、血清、血漿、尿等の検体種別にかかわらず、よりＪＣＣＬＳ-ＳＯＰ法との反応性が近似するとの理由により、水素原子、メチル基が好ましい。
一般式（１）中、Ｘは、２０〜４０の範囲であれば特に限定されないが、血清、血漿、尿等の検体種別にかかわらず、よりＪＣＣＬＳ-ＳＯＰ法との反応性が近似するとの理由により、２５〜３５が好ましく、３０であればさらに好ましい。
本発明における、前記の一般式（Ｉ）よりなる構造の非イオン性界面活性剤のＡＭＹ活性測定試薬中における含有濃度は、０．００５〜４．０質量％の範囲にあることが好ましく、０．０１〜１．０質量％の範囲が特に好ましい。
ここで、本発明のＡＭＹ活性測定試薬を用いた試料中のＡＭＹ活性測定原理は以下のとおりである。
上記反応に得られた４−ニトロフェノールを、分光光度計を用いて吸光度を測定することにより、遊離した４−ニトロフェノールの量を求め、これにより試料中のＡＭＹ活性の算出を行うことができる。
本発明のＡＭＹ活性測定方法における試料とは、α−アミラーゼを含む可能性があり、その試料中のＡＭＹの有無の測定、または、ＡＭＹ活性値の測定を行うものであり、そのようなものであれば特に限定されない。
例えば、ヒトの血液、血清、血漿、尿、精液、髄液、唾液、汗、涙、腹水、羊水等の体液；ヒトの膵臓、肝臓等の臓器、毛髪、皮膚、爪、筋肉、又は神経組織等の抽出液；ヒトの糞便の抽出液又は懸濁液等が挙げられる。
基質は、ＥＮＭである。
本発明において、基質を含ませて、ＡＭＹ活性の測定を行う場合には、ＡＭＹ活性測定試薬中の基質濃度は、０．０５〜１００ｍＭの範囲にあることが好ましく、０．１〜５０ｍＭの範囲が特に好ましい。
本発明のＡＭＹ活性測定試薬は、１試薬のものでもよいが、必要に応じて２試薬以上に試薬成分を分けて構成してもよい。
ＡＭＹ活性測定時のｐＨは、５．５〜８．０の範囲が好ましく、ｐＨ６．０〜７．５の範囲がさらに好ましい。
ＡＭＹ活性測定試薬が１試薬である場合は、ＡＭＹ活性測定試薬のｐＨを前記の範囲のｐＨとすればよく、２試薬以上である場合には、それらの試薬を測定時の所定の混合比率で混合した時に、前記の範囲のｐＨとなるよう各試薬のｐＨを定めればよい。
本発明におけるＡＭＹ活性測定試薬には、基質、共役酵素及び前記の一般式（Ｉ）よりなる構造の非イオン性界面活性剤の他に、緩衝剤、ＡＭＹの活性化剤、安定化剤、防腐剤等を含有させることができる。
緩衝剤としては、前記のｐＨ範囲に緩衝能がある緩衝剤を適宜用いることができる。
例えば、ｐＨ５．５〜７．０の範囲に緩衝能がある緩衝剤としては、ＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＤＩＰＳＯ、又はＴｒｉｓ等を挙げることができる。
また、ｐＨ６．５〜８．０の範囲に緩衝能がある緩衝剤としては、例えば、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ、ＥＰＰＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＴＡＰＳ、又はＴｒｉｓ等を挙げることができる。
本発明の測定試薬には、ＡＭＹの活性化剤を含有させてもよい。このＡＭＹの活性化剤とは、ＡＭＹの活性化の効果を有する化合物であり、例えば、カルシウムイオン又は塩化物イオンを含む化合物を挙げることができ、より具体的には、酢酸カルシウムや塩化ナトリウム等を挙げることができる。
これらの活性化剤を含有させる場合の濃度としては、カルシウムイオンが０．５ｍＭ以上、塩化物イオンが１０ｍＭ以上であれば好ましい。
更に、本発明のＡＭＹ活性測定試薬中に、ＡＭＹの活性化剤として、アルカリ金属のアジ化物、又はチオシアン酸塩等を含有させてもよい。
具体的には、例えば、アジ化リチウム、若しくはアジ化ナトリウム等のアジ化物であれば、０．１〜１０％含有させることが好ましく、またチオシアン酸ナトリウム、若しくはチオシアン酸カリウム等のチオシアン酸塩であれば、１００〜４，０００ｍＭ含有させることが好ましく、５００〜３，０００ｍＭ含有させることが特に好ましい。
これらの共役酵素を測定試薬に含有させる酵素活性値は、酵素活性測定方法により酵素活性値が異なるので一概に示すことはできないが、適宜共役反応に十分な量を含有させればよい。
本発明のＡＭＹ活性測定試薬には、アジ化ナトリウムなどの防腐剤等を含有させてもよい。
本発明の試料中のＡＭＹ活性測定方法において、試料中のＡＭＹと前記基質の反応時に、前記の一般式（Ｉ）よりなる構造の非イオン性界面活性剤を存在させることを特徴とするものである。
本発明におけるＡＭＹ活性測定方法の一例を具体的に述べると、上記基質として含むＡＭＹ活性測定試薬とＡＭＹを含有すると推測される試料とを混合し、前記の試料中に含有されるＡＭＹを前記基質と反応させる。そして、この反応時に前記の一般式（Ｉ）よりなる構造の非イオン性界面活性剤を存在させる。
共役酵素であるα−グルコシダーゼとも反応させる。そして、この（これらの）反応によりＥＮＭから還元末端側の４−ニトロフェノールを遊離させ、この遊離した４−ニトロフェノールの量を測定することにより試料中のＡＭＹの活性の測定を行う。
ここで遊離した４−ニトロフェノールは、４００ｎｍ付近において吸収を示すので、これを、分光光度計を用いて吸光度を測定することにより、遊離した４−ニトロフェノールの量を求め、これにより試料中のＡＭＹ活性の算出を行うことができる。
本発明における試料中のＡＭＹ活性測定方法の一例をより具体的に例示すると、あらかじめ室温又は２０℃〜４０℃に加温、好ましくは３７℃に加温した、ＥＮＭを基質として含み、前記の一般式（Ｉ）よりなる構造の非イオン性界面活性剤を含有するＡＭＹ活性測定試薬と、ＡＭＹを含有すると推測される試料を混合して測定反応液とし、温度一定の条件下において、試料添加後３０秒から３０分の間、好ましくは３分から５分の間の４００ｎｍ付近におけるこの測定反応液の吸光度変化を測定し、４−ニトロフェノールの生成量（遊離量）から試料中のＡＭＹ活性値を算出する。
また、基質を含まないＡＭＹ活性測定試薬にＡＭＹを含有すると推測される試料を混合し、その後この混合液にＥＮＭを基質として含むＡＭＹ活性測定試薬を添加して測定反応液とし、前記の測定方法と同様の操作により測定を行い、１分間当たりの４−ニトロフェノールの生成量（遊離量）から試料中のＡＭＹ活性値を算出してもよい。
なお、この場合、前記の一般式（Ｉ）よりなる構造の非イオン性界面活性剤は、基質を含まないＡＭＹ活性測定試薬か、又はＥＮＭを基質として含むＡＭＹ活性測定試薬のいずれかに含有させるか、或いは、基質を含まないＡＭＹ活性測定試薬とＥＮＭを基質として含むＡＭＹ活性測定試薬の両方に含有させておく。
測定ステップ本発明の試料中のＡＭＹ活性測定方法は、１ステップ法（１試薬系）で実施してもよく、又は２ステップ法（２試薬系）等の多ステップ法（多試薬系）で実施してもよい。
本発明の試料中のＡＭＹ活性測定方法は、ＡＭＹの反応停止後に吸光度を測定するエンドポイント法、又は単位時間当たりの吸光度変化を測定するレート法のいずれにおいても実施することができる。
本発明の試料中のＡＭＹ活性測定方法において、遊離した４−ニトロフェノールの吸光度の測定を行う波長としては、遊離した４−ニトロフェノールが吸収を持つ波長の範囲内のものであればよく、３４０ｎｍから４５０ｎｍであり、更に好ましくは３８０ｎｍから４２０ｎｍの範囲である。
また、４−ニトロフェノールが吸収を持たない波長を副波長として用い、二波長分析により吸光度の測定を行うこともできる。
以下に本発明を実施例および比較例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではなく、本発明の技術的思想を逸脱しない範囲で種々の変更が可能である。
以下の組成の試薬１及び試薬２を調整した。
ProClin300：2-メチル-4-イソチアゾリン-3-オンおよび5-クロロ-2-メチル-4-イソチアゾリン-3-オンを有効成分とする防腐剤
界面活性剤として、以下のものを調整し、第一試薬に０．０５ｖ/ｖ％添加した。対照（界面活性剤を添加しないもの）については、同量の精製水を添加した。
試料として以下のものを調整した。
HITACHI-7170S/7180形 自動分析装置を用いて分析を行った。分析条件及び分析結果を以下に示す。
本発明にかかる非イオン界面活性剤を用いた場合には、他の非イオン界面活性剤を用いた場合と比較して、吸光度変化量、検量値ともに対照との差異がなく良好な結果が得られた。
次に、血清、血漿、尿に関して対象試薬との相関性を確認した。その結果を以下に示す。
対照測定試薬との相関性においても、本発明にかかる非イオン界面活性剤を用いた場合には、良好な結果が得られた。
次に、各測定試薬に溶血0ミリグラム、250ミリグラム、500ミリグラムを加えた場合の、吸光度変化量、検量値の結果を以下に示す。
対象測定試薬、各界面活性剤を添加した測定試薬ともにほとんど溶血の影響を受けることがないことが確認できた。
次に、対象測定試薬、実施例１測定試薬、実施例２測定試薬について、血清中及び尿中に含まれる共存物質による影響の有無について確認を行った。試験項目を以下に示す。
それぞれの共存物質を添加した場合の検量値を以下に示す。
血清ベース、尿ベースともに、共存物質存在下における本願発明にかかる非イオン界面活性剤を添加したことによる影響はほとんど見られなかった。
上記結果より、本発明にかかるＡＭＹ活性測定試薬を用いることにより、ＪＣＣＬＳ-ＳＯＰ法との反応性に影響を生じることなく、ＡＭＹ活性測定できることが確認できた。
Claims (2)
- ＥＮＭを基質として、α−グルコシターゼを共役酵素として含む、ＡＭＹ活性測定試薬において、下記一般式（１）
- 請求項１に記載のＡＭＹ活性測定試薬により、生化学自動分析装置を用いて試料中のＡＭＹ活性測定方法。
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