JPH0476679B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は液体特に体液中の成分を測定する分析
用具に関するもので、中でも酸化酵素を含有する
分析用具に関するものである。

液体試料の分析にあたり、緩やかな条件でかつ
特異的に検出反応が行なえる酵素的分析法が好適
であり、中でも酸化酵素を使う方法が盛んになつ
ている。これは、被検物質またはその反応生成物
を酸化酵素によつて酸化したときに生成する過酸
化水素にパーオキシダーゼを作用させ色素を形成
する反応に導き、比色的にこれらを測定する方法
であり、検出手段として、螢光法、発光法及び各
種電極を用いることも可能である。

過酸化水素を比色定量する方法にはいわゆるト
リンダーの試薬を用いる方法（Ann，Clin，
Biochem6巻、24頁、1969年）、及びｏ−アニシ
ジン、ベンジジン、ｏ−トリジン、テトラメチル
ベンジジンなどの被酸化型色原体をもちいる方法
がよく知られている。これらの方法は酸化酵素に
よつて生成する過酸化水素にパーオキシダーゼを
作用させ、アミノアンチピリンとフエノール類と
の酸化カツプリングを行わせ、生成した色素を定
量するか又は被酸化型色原体を直接酸化して色素
を形成させる。この反応系の利点は、酸化酵素の
種類を変えても同じ検出系を利用できる点にあ
り、広く各種の分析項目への応用が検討されてい
る。酸化酵素のなかで臨床検査上特に重要なもの
にグルコースオキシダーゼ、ウリカーゼ、コレス
テロールオキシダーゼ、グリセロール−３−リン
酸オキシダーゼ、コリンオキシダーゼ、アシル
CoAオキシダーゼ、サルコシンオキシダーゼ、
各種アミノ酸オキシダーゼ、ビリルビンオキシダ
ーゼ、ラクトースオキシダーゼ、ピルビン酸オキ
シダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、グリセロ
ールオキシダーゼ等がある。

従来より、これらの酸化酵素とパーオキシダー
ゼ及び色原体を含む反応溶液を用いて、臨床検査
としての体液分析が主として実施されてきた。

一方、上記の分析用組成物を混合・乾燥して一
体化した試薬（以下固相試薬という）が、臨床検
査の基本的ニーズである分析の迅速・簡易性を満
たす手段として有用視されてきた。

例えば、これらの酸化酵素と過酸化水素の検出
系等とをポリマー中に分散させてプラスチツクフ
イルムに塗布した試験フイルムが特公昭49−
33800号明細書に開示されている。また特公昭51
−21677号明細書に液体不浸透性光透過性支持体
上に試薬層及び展開層を設けた多層試験フイルム
が記載されている。更に、多層試験フイルムの応
用として特開昭51−40191号明細書記載の光遮蔽
層、特開昭52−3488号明細書記載のバリヤー層、
特開昭53−181089号明細書記載のレジストレーシ
ヨン層および放射線ブロツキング層、特開昭54−
29700号明細書記載のマイグレーシヨン阻止層な
どが加えられた構造のものがある。これら固相試
薬の中には具体例として酸化酵素を含むものが多
くみられる。

ところで、特開昭57−208997号明細書には多層
系の固相試薬における反応系での酸素不足の問題
を是正する手段として、酸化酵素を含む系を最外
層に含ませると空気中の酸素との接触が良くなる
ので、酸化反応の効率が向上することが記載され
ている。

この点に関して、本発明者らが独自に評価した
ところ、試料中に溶存している酸素以外に、酸化
酵素を含む層の一面が大気と直接に接触している
ことによる酸素を利用しているため、酸化酵素を
含む系を最外層にふくませるとかなりの効果があ
るが、その効果は不充分であり、特に高濃度の測
定対象物を含む検体においては問題となることが
わかつた。

一般に、固相試薬における酸化反応に必要な酸
素は試料中に溶存している酸素と大気中から反応
系に溶解する酸素によつて賄われていると推測さ
れていたが、本発明者らが調査・研究したとこ
ろ、従来の固相試薬の試薬層における酸化反応に
よつて消費され減少した酸素量が所定の溶存量に
戻るため大気中より溶解して平衡に達する時間
は、反応時間に比べて極めて長いため、大気中か
ら溶解して供給される酸素は役立つていないこと
がわかつた。したがつて、反応前から反応系に溶
存していた酸素のみが酸化反応に利用されること
になる。また、次に示す理論的根拠により、試料
中に溶存する酸素だけではとても充分な反応が期
待できない。

純水を溶媒としたときの空気の溶解度は25℃１
気圧で０，0167〔ml／ml〕であり、内酸素は０，
0057〔ml／ml〕である〔日本化学会編；化学便覧
基礎編；621頁；丸善(株)；1965年〕。０，0057
〔ml／ml〕の溶存酸素料は計算すると25μmol／dl
になるが、試料中には他の物質も溶解しているの
で実際には25μmol／dlよりも少ない量しか溶存
していない。

一方、正常な血清の各種成分は、例えばグルコ
ースは360〜580μmol／dl、コレステロールは360
〜670μmol／dl、トリグリセライドは34〜
152μmol／dl、尿酸は12〜42μmol／dlであり、
異常な場合はこれらの値より増加する。一般に前
述の固相試薬では、検体を未希釈あるいはせいぜ
い数倍に希釈して適用されるので試料中に溶存し
ている酸素だけでは完全に基質を酸化できないこ
とは明らかである。

したがつて、溶存している酸素のみが利用され
るとすると血清中尿酸のように極めて低濃度の被
検物質であつても、正常域を超える高い濃度の場
合充分な酸化が不可能となり、その他の血清中被
検物質の場合は正常域でも酸化が不充分となる。
以上の検討結果から溶存酸素が微量であること及
び酸素の溶解速度はかなり遅く実質利用されない
ことがわかつた。しかしながら、酸化酵素を含む
系を最外層にもつてくると不充分ではあるが、か
なりの効果を示し、これは酸化酵素を含む系が空
気と接触することにより直接、酸素を利用してい
るためであることが明らかになつた。

このような状況を踏まえて本発明者らは固相試
薬の構造について鋭意研究を重ねた結果、試薬層
と支持体の間に隙間を設け試薬層が支持体側から
も空気と接触できるようにすれば上記課題が解決
できることを見いだした。

本発明の目的は、酸化酵素により基質を酸化す
るのに必要な酸素を試薬層の支持体側からも供給
することにより、迅速且つ正確な測定のできる分
析用具を提供することであつて、特に高濃度の被
検物質の測定においても充分な酸化反応のおこな
える分析用具を提供することにある。

本発明の分析用具は支持体と酸化酵素を含む試
薬層の間に多孔質疎水性である酸素供給層を有す
る。

本発明に基づく多孔質疎水性の酸素供給層は、
あらかじめ空気を含み、かつその流通も可能なの
で、反応系の下部からも酸素を供給することがで
き、上記目的を達成することができる。

以下、本発明の理解を助けるため図面を用いて
説明する。

第１図は単に支持体上にフイルム形成重合体を
バインダーとする試薬を塗布し、乾燥して作成し
た分析用具であり、１は試薬層、２は支持体であ
る。第２図は本発明における分析用具の一例で、
第１図の支持体の上に多孔質疎水性物質を貼り
（酸素供給層３）、さらにこの上に試薬を塗布し、
乾燥して作成した分析用具である。両者の試薬層
には酸化酵素の他に過酸化水素検出用試薬等を含
んでいる。

これらの分析用具に試料を滴下すると、試料は
どちらも液滴をつくる。この状態で発色状態を１
〜２分間観察すると、第１図に示す従来の分析用
具では液滴の付着した部分の周囲から発色しはじ
め、徐々に中心に向かうが最終的には中心部が所
望の強度で発色しない。第２図の分析用具では、
液滴の付着した部分全体で均一に発色がはじまり
所望する充分な強度で均一な発色が得られる。こ
れは試料中に溶解している酸素量だけでは酸化反
応をほとんど行わせることができないうえに、液
滴が反応系への配素の溶解を妨害しているため
で、第１図の分析の場合は空気と反応系とが直接
接触している液滴の周辺部では充分に反応が進行
するが中心部では不充分となる。第２図の分析用
具の場合は酸素供給層を備えているので反応系に
おける酸素が供給され、ほぼ均一に酸化反応が進
行するからである。

実際の検査においては試料滴下後、適当な反応
時間（１〜２分）を待つて試料を除去し、発色の
状態を肉眼または機器によつて観測する。したが
つて、第１図の分析用具は不均一で低い反応率に
基づく不正確な成績が得られ、第２図の分析用具
では充分に満足できる成績が得られる。

第４図は本願出願人による特開昭58−12260号
に記載した多層一体化分析用具の基本構造で、光
反射性支持体９、液体試料中の目的成分と反応し
て光学的検出可能な変化を生じる試薬を含み、且
つ試料液の溶媒によりそれ自身溶解またはゾル状
となる試薬層７と、受け入れた液体試料を該試薬
層に移行させるとともに試薬層で生成または減少
した光学的検出可能な物質を均一に拡散させる機
能を有する検出層６とを一体化したものである。
そして第５図は、第４図の試薬層７と支持体９の
間に酸素供給層８を設けたものである。これらの
多層一体化分析用具は種々の項目の測定に利用で
きるが、ここでは試薬層に酸化酵素と過酸化水素
検出用試薬を含んだ例について、酸素供給層の効
果を説明する。第４図、第５図の多層一体化分析
用具に試料を滴下すると、試料は検出層で幾分、
拡がりながら試薬層に到達し、試薬層との界面で
横方向に広がり、更に試薬層を溶解する。試薬層
を溶解した試料は反応しながら検出層に拡散し、
よつて試薬層の構成物すべてを含む反応混合液が
検出層に移行される。検出層における反応の様子
を観察するとどちらも均一な発色が起きるが第４
図の多層一体化分析用具より第５図の多層一体化
分析用具の方が反応が速く発色が強かつた。発色
速度の違うのは第４図の多層一体化分析用具では
反応系の片面（支持体と反対側）しか空気と接触
できないのに対し、第５図の多層一体化分析用具
では反応系の両面で空気と接触しているので反応
系への酸素の供給が極めて円滑に行われているた
めである。

本発明の酸素供給層は、多孔質疎水性構造であ
る。酸素供給層には不織布、疎水性の織布・紙、
金属及びナイロンメツシユ、メンブランフイル
タ、表面を疎水処理したガラスフイルタ・セラミ
ツクなどの多孔質疎水性物質が用いられる。また
酸素供給層と支持体を兼ねる場合にはポリエステ
ル、アクリル、ナイロン、ポリスチレン、ポリウ
レタン、メタクリル、フエノールなどの各種樹脂
を多孔構造となるよう成型したものの他表面を疎
水処理したセメント・セラミツク・ガラスフイル
タなどで多孔質疎水性のものが用いられる。尤も
はじめから多孔質疎水性でなくても、有機溶媒に
溶かした常温で固体の疎水性高分子物質であれ
ば、この溶媒に不溶性で且つ該有機溶媒より沸点
の高い溶媒を分散させた懸濁液を支持体に塗布し
て、両溶媒を乾燥すれば多孔質疎水性層を形成で
き、これが酸素供給層となる。このような疎水性
高分子物質として酢酸セルロース、エチルセルロ
ース、ポリビニルブチラール、ポリスチレン、ポ
リウレタン、ポリエステル、アクリル、ナイロ
ン、ポリフエノール、ポリメタクリル、ポリ酢酸
ビニル、ニトロセルロース、ポリアミノ酸の低重
合体などが等が挙げられる。要は多孔性であり、
かつ試薬層を形成させる塗工液及び試料が完全に
は浸透しなければ酸素供給層の役割をもたせるこ
とができる。

本発明による酸素供給層を有する分析用具につ
いてより一層理解を深めるため以下に実施例を挙
げるが本発明はこれによつて限定されるものでは
ない。

実施例 １ 厚さ0.125mmの白色ポリエステルフイルム〔東
レ(株)製〕自体と、これの上面に多孔質疎水性膜で
ある酸素供給層〔積水化学(株)製、商品名：セルポ
ア（材質：ポリエチレン；厚さ：150μm）〕を両
面テープで貼つたものの２種を用意し、更にこれ
らの上にグルコース量に応じて発色する試薬層を
構成するため下記塗工液を塗布厚0.2mmで塗布し、
乾燥して試薬層を形成した。これらを裁断し、１
片の長さを10mm×10mmにしたものの中央にグルコ
ース水溶液90mg／dl〔500μmol／dl〕50μを試
料として滴下した。滴下された試料は一部試薬層
に含浸しているが、大部分は試薬層の表面に液滴
を形成した。発色状況は、ポリエステルフイルム
に直接試薬層を形成したもの（以下typeAと記
す）では液滴の周辺部から徐々に発色しはじめ、
反応終了時には中心部も発色してはいたが周辺部
のほうがはるかに濃い発色であつた。多孔性膜に
試薬層を形成したもの（以下typeBと記す）では
全体が均一に発色しはじめ、反応終了時にもやは
り均一な発色であつた。更に、反応の速度も
typeBのほうが早かつた。

（typeA及びtypeBの 試薬層形成用塗工液の組成） 酢酸セルロース ……8.0g １，２−ジクロルエタン ……70ml グルコースオキシダーゼ ……200mg パーオキシダーゼ ……200mg ポリビニルピロリドン（Ｋ−90） ……150mg ４−アミノアンチピリン ……12mg １，７ジヒドロキシナフタレン ……70mg エタノール ……8.0ml ０，1Mリン酸緩衝液（PH7.5） ……16ml 実施例 ２ 実施例１のtypeBにおける酸素供給層としての
多孔性膜を貼る代わりに下記酸素供給層形成用塗
工液を塗布厚0.2mmで白色ポリエステルフイルム
に塗布、乾燥して多孔質疎水性構造を形成した分
析用具（typeC）により実施例１と同じ実験をお
こなつた。結果は発色の均一性についてはtypeB
とほぼ同じ効果が認められたが、速度はtypeBよ
りもやや遅かつた。typeCの場合形成した酸素供
給層に試薬層形成用塗工液が少し浸透するが、完
全には浸透しないために酸素供給層の特徴を備え
ていることがわかる。

（酸素供給層形成用塗工液の組成） ポリビニルブチラール樹脂 ……5g （重合度 700） アセトン ……50ml 精製水 ……10ml 界面活性剤（Tween 20） ……500mg 実施例 ３ 実施例１のtypeAにおける白色ポリエステルフ
イルムの代わりに表面を疎水処理したセラミツク
の板を用いて作成した。これは酸素供給層が支持
体を兼ねている分析用具（typeD）であり、実施
例１と同じ実験をおこなつたところ、発色の均一
性・強度、発色速度ともtypeBと同様であつた。

実施例 ４ 本発明による酸素供給層の効果を調べるため、
実施例１で作成したtypeAとtypeBの分析用具の
反応タイムコースを光反射率計〔(株)日立製作所製
反射率測定用積分球付220A分光光度計〕を用い
て、グルコース濃度既知の血清ａ，ｂそれぞれを
試料として呈色させた際の反射率を550nmで測定
した。

測定方法は以下の通りである。

１） typeAとtypeBの分析用具に血清ａ（グル
コース濃度82mg／dl：456μmol／dl）及び血清
ｂ（グルコース濃度320mg／dl：1778μmol／dl）
を滴下し、反応を開始させる。

このとき、試料を試薬面に載せて反応させる
時間を、０〜４分間において30秒毎に変える。

２） それぞれの反応時間に達したら、余剰試料
を脱脂綿でふき取り除去（酸化反応は試料が除
かれたためほぼ停止する）し、それからどの反
応時間の場合も１分間待つて呈色を完了させ、
酸化反応の進行の様子をその反射率を測定する
ことによつて計測する。

なお、測定して得た反射率を下式により計算し
てＫ／Ｓ値を求め、Ｋ／Ｓ値の時間的変動の様子
（酸化反応のタイムコース）を血清ａの場合第６
図に、血清ｂの場合第７図にしめした。

Ｋ／Ｓ＝（１−Ｒ）²／２×Ｒ 〔式中Ｋは定数であり、Ｓは特定の反射媒体の
散乱係数であり、Ｒは反射率である。〕で定義さ
れる。

この関係はクベルカームンク（Kubelka−
Munk）の式〔グスタフ−コルチユム（Gustav−
Kortum）著「リフレクタンス・スペクトロスコ
ピー（Reflectance Spectroscopy）」106〜111
頁；スプリンガー・バーラズ（Springer−
Verlaz）；1969年〕の簡略形であり、Ｋ／Ｓ値
は、モル濃度と一次的に比例する。

第６図及び第７図より明らかに、酸素供給層を
有する分析用具の場合、酸化反応の進行が速く２
〜３分でほぼ反応が終点に達しているが、酸素供
給層を有しない分析用具の場合は、反応の進行が
遅く、迅速（迅速でないと試料も乾燥するし、時
間も無駄である）かつ正確に定量することができ
ない。

実施例 ５ 本願出願人による特願昭58−122600号に記載の
多層一体化分析用具に適用した例を示す。

厚さ0.125mmの白色ポリエステルフイルム〔東
レ(株)製〕自体と、これに酸素供給層であるメンブ
ランフイルタ〔住友電気工業(株)製〕を両面テープ
を用いて貼つたものの２種を用意し、さらにこれ
らの上に下記のトリグリセライド用塗工液を塗布
厚0.2mmで均一に20mm幅で塗布した後、40℃で２
時間乾燥して試薬層を形成する。次いで試薬層の
表面を軽く湿らして２cm幅の綿ブロード〔東洋紡
績(株)製〕を試薬層に圧着して積層し、検出層を形
成した。これらを塗布方向に沿つて試薬部分を1/
２に切断し、次いで塗布方向に直角に５mm幅に切
断する。こうして検出層及び試薬層の部分が５mm
×10mmのトリグリセライド測定用多層一体化分析
用具並びに酸素供給層を有する多層一体化分析用
具を作成した。

白色ポリエステルフイルムに直接試薬層を形成
した多層一体化分析用具（以下typeEと記す）及
びメンブランフイルタに試薬層を形成した酸素供
給層を有する多層一体化分析用具（以下typeFと
記す）に血清Ｃ（トリグリセライド濃度157mg／dl
−−1768μmol／dlに相当）を10μ滴下したとき
の反応曲線を第８図に示す。

（typeDおよびtypeEの試薬層形成用塗工液の
組成） リポプロテインリパーゼ ……300mg グリセロールキナーゼ ……50mg グリセロール−３リン酸 ……100mg オキシダーゼ パーオキシダーゼ ……100mg アデノシン−３−リン酸 ……600mg ４−アミノアンチピリン ……350mg ３，５ジメトキシ−Ｎ−エチル ……375mg （２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニ
リン・ナトリウム塩 塩化マグネシウム ……0.2mg アルギン酸ナトリウム ……1600mg 0.2Mリン酸緩衝液（PH8.0） ……100ml 第８図より、typeFの方がtypeEより反応速度
が大きく、試薬層の両面で酸素が利用でき、酸素
供給層の効果が顕著である。

以上本発明の好適な実施例について述べたが、
本発明の技術思想の範囲内で種々の変更が加え得
る。

酸素供給層として多孔質疎水性のものが用いら
れる。疎水性の多孔質膜、不織布、疎水性の織
布・紙、金属及びナイロンメツシユ、多孔性の樹
脂、表面を疎水処理したセラミツク・多孔性ガラ
ス・多孔性金属膜が好適であるが、その他多孔質
親水性の材料の片面を疎水化して、この面を試薬
層とあわせることもできる。また、多孔質であれ
ば試薬層を形成するときに、試薬層形成用塗工液
が完全には浸み込まなければよい。

以上詳述したように、本発明の酸素供給層を有
する分析用具は固相試薬の反応系における酸化反
応に必要な酸素を支持体側からも供給できるので
酸化反応を円滑に進行できる。このため、迅速で
精確な酸化酵素を有する固有試薬を提供できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は支持体に直接試薬層を形成した従来の
分析用具、第２図は支持体と試薬層の間に酸素供
給層を有する本発明の分析用具の１例、第３図は
酸素供給層が支持体を兼ねた分析用具の１例、第
４図は本願出願人による特願昭58−122600号記載
の分析用具、第５図は多層一体化分析用具に本発
明の酸素供給層を備えた例、第６図及び第７図は
実施例４で作成した分析用具typeA及びtypeBの
反応タイムコースを表したもので第６図は血清ａ
を試料としたもの、第７図は血清ｂを試料とした
ものである、また第８図は実施例５で作成した分
析用具の反応タイムコースである。 １，９…支持体、２，４，７…試薬層、３，８
…酸素供給層、５…酸素供給層兼支持体、６…検
出層。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 支持体及び酸化酵素を含む試薬層を有する乾
   式液体分析用具において、該支持体と該試薬層の
   間に多孔質疎水性である酸素供給層を有すること
   を特徴とする分析用具。 ２ 酸素供給層が支持体を兼ねることを特徴とす
   る特許請求の範囲第１項記載の分析用具。