DE3510992A1

DE3510992A1 - Analysengeraet mit einer eine oxidase enthaltenden reagenzschicht

Info

Publication number: DE3510992A1
Application number: DE19853510992
Authority: DE
Inventors: Shigeru Ootsu Shiga Fujioka; Yasuo Kyoto Yamao
Original assignee: Kyoto Daiichi Kagaku KK
Current assignee: Arkray Inc
Priority date: 1984-03-30
Filing date: 1985-03-27
Publication date: 1985-10-10
Also published as: US4931387A; JPS60205364A; JPH0476679B2; DE3510992C2

Description

Die Erfindung betrifft ein eine Oxidase enthaltendes Gerät zum Analysieren von Körperflüssigkeiten, insbesondere Körperflussigkeitskomponenten.

Analyse mittels Enzymreaktion ist zum Analysieren von flüssigen Proben geeignet, da diese Reaktion spezifischen Nachweis unter milden Bedingungen gibt; insbesondere die Oxidasereaktion findet weitverbreitet Anwendung. Bei diesen Methoden wird ein Probenmaterial oder sein Reaktionsprodukt durch eine Oxidase oxidiert, das-dabei erzeugte Wasserstoffperoxid wird mit einer Peroxidase unter Bildung eines farbigen Materials umgesetzt und das farbige Material wird mittels Colorimetrie bestimmt. Andere Nachweismethoden, wie Fluorometrie, Emissionsspectroscopie und verschiedene Elektroden stehen ebenfalls zur Verfügung.

Die bekannten Methoden zur colorimetrischen Analyse von Wasserstoffperoxid schließen die Methode, bei der das "Trinder-Reagenz" (Ann, Clin, Biochem., Vol. 6_f S. 24, 1969) verwendet wird, ein und die Methoden, bei denen ein oxidierbares Chromogen, wie o-Anisidin, Benzidin, o-Tolidin und Tetramethylbenzidin verwendet wird. Bei diesen Methoden wird das durch die Wirkung einer Oxidase erzeugte Wasserstoffperoxid mit einer Peroxidase umgesetzt, das Produkt mit Aminoantipyrin und einem Phenol durch Oxidation gekuppelt und das

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erzeugte Farbmaterial wird bestimmt oder das oxidierrbare Chromogen wird direkt unter Bildung von Farbmaterial oxidiert. Dieses System hat den Vorteil, daß das gleiche Nachweismittel für zwei verschiedene Oxidasetypen verwendet werden kann. Daher ist seine Anwendung auf verschiedene Analysengegenstände weitgehend erforscht. Oxidase hauptsächlich für klinische Untersuchungen schließt ein: Glucose-Oxidase, Urecase, Cholesterin-Oxidase, Glyco-3-phosphorsäure-Oxidase, Cholin-Oxidase, Acyl-CoA-Oxidase, Sarcosin-Oxidase, verschiedene Aminosäureoxidasen, Bilirubin-Oxidase, Lactose-Oxidase, Brenztraubensäure-Oxidase,Galactose-Oxidase und Glycerin-Oxidase.

Bisher ist eine eine solche Oxidase, Peroxidase und Chromogen enthaltende Lösung für die Analyse von Körperflüssigkeiten bei der klinischen Untersuchung verwendet worden.

Andererseits sind Reagenzien der vorstehenden Zusammensetzung, vollständig gemischt und getrocknet (nachstehend mit "festes Reagenz" bezeichnet) weitverbreitet verwendet worden, um den fundamentalen Anforderungen nach schneller und einfacher Analyse gerecht zu werden.

So ist z.B. in der US-PS 3 630 957 ein Testfilm offen-

bart, der von einem Kunststoffilm, auf den ein Nachweissystem aus einer Dispersion dieser Oxidase und Peroxidase in einem Polymer aufgebracht ist, gebildet wird. In der US-PS 3 992 158 ist ein mehrschichtiger Testfilm beschrieben, bestehend aus einem flüssigkeitsundurchlässigen und lichtdurchlässigem Substrat, auf dem eine Reagenzschicht und eine Entwicklerschicht aufgebracht ist. Als modifizierte Mehrschicht-Testfilme sind offenbart: in der US-PS 4 066 403 ein Testfilm, dem eine Barrierenschicht zugefügt ist, in der US-PS 4 144 306 ein Testfilm mit einer Eintragungsschicht und einer Strahlenblockierschicht, und in der US-PS 4 166 093 ein Testfilm mit einer Wanderungsblockierschicht. Die meisten dieser Ausführungen mit festem Reagenz enthalten Oxidase.

Bei diesen Methoden, bei denen Oxidase verwendet wird, kann mangelnde Sauerstoffzuführung Meßfehler durch Verminderung der Färbung verursachen.

Der für die Oxidation erforderliche Sauerstoff in einem festen Reagenz wird durch gelösten Sauerstoff in dem Reagenz und gelösten Sauerstoff im Reaktionssystem aus der Atmosphäre geliefert.

Wie jedoch aus der nachstehend gebrachten theoretischen

Grundlage hervorgeht, kann von nur dem in der Probe gelösten Sauerstoff keine ausreichende Reaktion erwartet werden.

Die Löslichkeit von Luft in reinem Wasser ist 0,0167 ml/ml bei 25 C und 1 atm, wovon 0,0057 ml/ml Sauerstoff sind (Chemical Handbook compiled by Chemical Society of Japan, Basic Chapter II, S. 621, 1965, Maruzen). 0,0057 ml/mlgelöster Sauerstoff ist umgerechnet 25 /jmol/dl, da aber auch andere Substanzen in der Probe gelöst sind, ist die tatsächliche Sauerstoff menge weniger als 25 /imol/dl.

Bestandteile von normalem Blutserum sind z.B. 360-580 /amol/dl Glucose, 360-670 ^umol/dl Cholesterin, 34-152 /umol/dl Triglycerid und 12-42 pmol/dl Harnsäure. In abnormen Fällen liegen diese Werte höher. Da das vorstehend beschriebene feste Reagenz der Probe im allgemeinen unverdünnt oder höchstens mehrere Male verdünnt zugegeben wird, ist es einleuchtend, daß allein der in der Probe gelöste Sauerstoff das Substrat nicht vollständig oxidieren kann.

Würde daher nur der gelöste Sauerstoff verwendet werden, würde ausreichende Oxidation unmöglich sein, wenn die Konzentration über dem normalen Bereich liegt, sogar bei einer Substanz, die in sehr niedriger Konzentration im Serum vorliegt, wie z.B. Harnsäure, oder sogar bei an-

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deren Substanzen, wenn ihre Konzentration in dem normalen Bereich liegt.

Bei dem vorstehend erwähnten mehrschichtigen Testfilm befindet sich die Oxidase in der Reagenzschicht zwischen der Probenentwicklungsschicht und der Trägerschicht, und der Sauerstoffmangel ist beachtlich.

Die Zeit, die erforderlich ist, um die Menge Sauerstoff, welche durch Verbrauch gesunken ist, wieder auf den speziellen Wert zurückzubringen, ist erheblich langer als die Reaktionszeit, da der Sauerstoff nur nachdem er aus der Atmosphäre in der flüssigen Probe gelöst ist, dem festen Reagenz zugeführt wird. Dies ist für die Vereinfachung und Beschleunigung des Verfahrens äußerst ungünstig.

Auch der in der US-PS 3 603 957 beschriebene Testfilm, der nur aus einer Reagenzschicht auf einem Substrat besteht, hat einen Nachteil; die einzige Reagenzschicht kann die Wirkung von direktem Kontakt ihrer Oberfläche mit Luft nicht zeigen, da die auf die Reagenzschicht getropfte Probe eine flüssige Schicht zwischen der Reagenzschicht und der Luft bildet. Es werden nur der in dem Reaktionssystem gelöste vor der Reaktion anwesende Sauerstoff und eine kleine Menge Sauerstoff, die

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— Π mm

von dem Teil, der nicht von der Probe bedeckt wird, absorbiert wird, für die Oxidationsreaktion verwendet.

Das heißt, selbst im Fall einer einzigen Reagenzschicht wird der von der Oxidase benötigte Sauerstoff nicht vollständig geliefert, was zu ungenauen Analysen führt.

In der JA-OS 57-208 997 ist ein Mehrschicht-Testfilm offenbart, der zur Beseitigung des Nachteils des Sauerstoffdefizits die Oxidase in der äußersten porösen Entwicklungsschicht enthält. Wegen der porösen Natur der Oxidase enthaltenden Schicht, die eine größere Kontaktfläche für den atmosphärischen Sauerstoff bietet, ist diese Testfilmart im Vergleich zu dem Analysengerät mit nur einer Reagenzschicht auf einem Träger von größerer Wirksamkeit.

Aber sogar bei diesem Testfilm ist die Menge Sauerstoff ungenügend, und die Erfinder haben ermittelt, daß das Problem besonders groß bei einer Probe ist, die eine hohe Konzentration des in Frage stehenden Objekts enthält.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Analysengerät zu schaffen, bei welchem der Reagenzschicht eine ausreichende Menge Sauerstoff zugeführt wird, so daß

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sich mit dem Gerät die Analysen schnell und einfach durchführen lassen und genaue Ergebnisse erhalten werden. Die Aufgabe wird durch das Analysengerät des Anspruches 1 gelöst. Bevorzugte Ausführungsformen sind in den Unteransprüchen angegeben.

Die Erfinder haben gefunden, daß das vorstehend beschriebene Problem gelöst werden kann durch die Vorsehung eines freien Raumes zwischen der Reagenzschicht und dem Träger, so daß die Reagenzschicht von der Trägerseite her mit Luft in Kontakt gebracht wird.

Zusammenfassung der Erfindung

Es ist ein Merkmal der Erfindung, daß ein Analysengerät bereitgestellt wird, welches schnelle und genaue Analysenergebnisse dadurch liefert, daß der Reagenzschicht auch von der Trägerseite her Sauerstoff zugeführt wird.

Ein weiteres Merkmal der Erfindung besteht darin, daß ein Analysengerät bereitgestellt wird, welches bei der Analysierung von besonders hochkonzentrierten Proben ausreichende Oxidation zuläßt.

Die poröse hydrophobe Sauerstoffschicht nach der Erfindung erreicht diese Merkmale durch Zuführen von Sauerstoff auch von der Unterseite des Reaktionssystem, das

Luft von vornherein enthält und in der Lage ist, sie zirkulieren zu lassen.

Die Erfindung wird nun genauer beschrieben, wobei auf die beigefügten Figuren Bezug genommen wird.

Fig. 1 ist eine schematische Seitenansicht eines beispielhaften Analysengeräts nach dem Stand der Technik.

Fig. 2 ist eine schematische Seitenansicht einer Ausführungsform des Analysengeräts nach der Erfindung.

Fig. 3 ist eine schematische Seitenansicht einer anderen Ausführungsform des Analysengeräts nach der Erfindung.

Fig. 4 ist eine schematische Seitenansicht eines anderen Beispiels für ein Analysengerät nach dem Stand der Technik.

Fig. 5 ist eine schematische Seitenansicht einer dritten Ausführungsform des Analysengeräts nach der Erfindung.

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Fig. 6, 7 und 8 sind Diagramme, die den zeitlichen Ablauf der Reaktion bei Verwendung jeder Ausführungsform des Analysengeräts nach der Erfindung zeigen.

Fig. 1 zeigt ein Analysengerät, wobei 1 die Reagenzschicht und 2 der Träger ist. Es wird einfach hergestellt, indem auf einen Träger 1 ein Gemisch von einem Reagenz und einem filmbildenden Polymer als Binder aufgebracht wird und das Ganze danach getrocknet wird. Fig. 2 zeigt eine Ausführungsform des Analysengeräts nach der Erfindung. Es wird hergestellt aus einem in Fig. 1 gezeigten Träger, dem ein poröses hydrophobes Material (Sauerstoffzuführschicht 3) angeklebt wird und auf das ein Reagenz aufgebracht wird, wonach das Ganze getrocknet wird. Die Reagenzschichten in den Fign. 1 und 2 enthalten Oxidase, ein Wasserstoffperoxid-Nachweisreagenz usw.

Wenn die Probe auf diese Analysengeräte aufgetropft wird, bildet es auf jedem Gerät einen Tropfen. Bei dem in Fig. 1 gezeigten gebräuchlichen Analysengerät beginnt nach ein oder zwei Minuten sich Farbe rund um den Tropfen zu entwickeln und die Färbung geht langsam zur Mitte des Tropfenbereiches weiter. Aber am Schluß ist die Mitte des Tropfenbereiches nicht in der erwarteten

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- Il -

Intensität gefärbt. Bei dem in Fig. 2 gezeigten Analysengerät dagegen beginnt gleichmäßige Farbentwicklung im ganzen Tropfenbereich und schließlich wird die Färbung in der erwarteten Intensität beendet. Dies ist auf die Tatsache zurückzuführen, daß die Menge Sauerstoff, die in der Probe gelöst ist, für die Oxidation nicht ausreicht und der Tropfen die Lösung von Sauerstoff in dem Reaktionssystem stört. Das heißt, in dem Bereich des Tropfenumfangs in Fig. 1, wo das Reaktionssystem in direktem Kontakt mit Luft ist, läuft die Reaktion vollständig ab, während im Mittelbereich die Reaktion unvollständig bleibt. Bei dem in Fig. 2 gezeigten Analysengerät läuft die Reaktion infolge der sauerstoffzuführenden Schicht gleichmäßig ab.

Bei der praktischen Prüfung wird die Probe nach einer angemessenen Reaktionszeit (1-2 Minuten) entfernt und der Zustand der Farbentwicklung mit bloßem Auge oder einem optischen Gerät festgestellt. Das in Fig. 1 gezeigte Analysengerät gibt ungenaue Ergebnisse, beruhend auf ungleichmäßiger niedriger Reaktionsrate, während das in Fig. 2 gezeigte Analysengerät zufriedenstellende Ergebnisse liefert.

Fig. 3 zeigt eine andere Ausführungsform des erfindungsgemäßen Analysengeräts, bei welcher der Träger auch als

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Sauerstoffzuführer dient. Eine solche kombinierte Verwendung von Substrat und Sauerstoffzuführer vereinfacht die Herstellung des Geräts und senkt die Kosten.

Fig. 4 zeigt die Grundstruktur des vereinigten Mehrlagen-Analysengeräts der Erfinder, das in der JA-OS 58-122690 offenbart ist. Es enthält zusammengefaßt einen lichtreflektierenden Träger; eine Reagenzschicht 7, die ein Reagenz enthält, welches eine optisch nachweisbare Änderung durch Reaktion mit der zu bestimmenden Komponente erzeugt und gelöst wird oder ein Sol (zol) mit dem Lösungsmittel des Probensystems bildet; sowie eine Nachweisschicht 6, die die empfangene flüssige Probe zur Reaktionsschicht transportiert und das in der Reaktionsschicht erzeugte oder reduzierte optisch nachweisbare Material gleichmäßig verteilt. Fig. 5 zeigt ein Analysengerät, das mit einer Sauerstoffzuführschicht 8 zwischen der Reaktionsschicht 7 und dem Substrat 9 der Fig. 4 versehen ist. Das zu einer Einheit zusammengefügte Mehrschicht-Analysengerät kann zur Bestimmung von verschiedenen Körperflüssigkeitskomponenten (items) benutzt werden. Hier wird die Wirkung der sauerstoffzuführenden Schicht bei Verwendung der Ausführungsformen, die eine Oxidase und Wasserstoffperoxid-Nachweisreagenz in der Reagenzschicht enthalten, gezeigt. Wenn die Probe jeweils auf die Mehrschicht-Analysengeräte, wie sie in den Fig. 4 und 5 gezeigt sind, getropft wird,

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erreicht sie die Reagenzschicht unter einer gewissen Ausbreitung in der Nachweisschicht, breitet sich seitlich in der Zwischenfläche zwischen der Nachweisschicht und der Reagenzschicht aus und löst die Reagenzschicht. Die Probe, die die Reagenzschicht gelöst hat, wandert in die Nachweisschicht, und die gemischte Reaktionslösung, die alle Verbindungen der Reaktionsschicht enthält, wird in die Nachweisschicht transportiert. In jedem Fall wurde gleichmäßige Farbentwicklung festgestellt, aber das Mehrschicht-Analysengerät der Fig. 5 zeigte eine schnellere Reaktion und intensivere Färbung als das Gerät der Fig. 4. Dieser Unterschied in der Farbentwicklungsrate ist auf die Tatsache zurückzuführen, daß das Mehrschicht-Analysengerät der Fig. 4 nur auf einer Seite (gegenüber dem Substrat) des Reaktionssystems in Kontakt mit der Luft steht, während das in Fig. 5 gezeigte Gerät auf beiden Seiten des Reaktionssystems Kontakt mit der Luft hat, was eine sehr glatte Zuführung von Luft zu dem Reaktionssystem sichert.

Die sauerstoffzuführende Schicht nach der Erfindung hat eine poröse hydrophobe Struktur und ist aus einem Material hergestellt, das einer hydrophobierendeη Behandlung unterworfen worden ist, z.B. aus Faservlies, Gewebe, Papier, Metallmaschennetz, Nylonnetz und poröse Keramik. Wenn das Substrat auch als ein Sauerstoffzuführer dient,

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ist es aus einem Harz, wie Polyester, Acrylharz, Polyamid, Polystyrol, Polyurethan,Methacrylharz, Phenolharz, in poröser Struktur geformt ,oder aus porösem hydrophobem Material, wie Zement, Keramik, Glasfilter. Die sauerstoffzuführende Schicht kann auch aus einem hydrophoben Polymeren hergestellt sein, das bei Raumtemperatur fest ist. Die Herstellung erfolgt in folgender Weise: Das Polymer wird in einem organischen Lösungsmittel gelöst und darin wird ein anderes Lösungsmittel dispergiert, welches in dem organischen Lösungsmittel unlöslich ist und einen höheren Siedepunkt als dieses hat, um eine Emulsion zu bilden. Diese Emulsion wird auf den Träger aufgebracht und beide Lösungsmittel werden getrocknet. Beispielhaft für solche hydrophoben Polymeren sind Celluloseacetat, Ethylcellulose, Polyvinylbutyral, Polystyrol, Polyurethan, Polyester, Acrylharze, Polyamid, Phenolharze, Methacrylharze, Polyvinylacetat, Nitrocellulose und niedere Polymere von Polyaminosäuren.

Zur weiteren Veranschaulxchung der sauerstoffzuführenden Schicht nach der Erfindung werden die folgenden Beispiele gebracht, auf die Erfindung jedoch nicht beschränkt ist.

Beispiel L Zwei Filmtypen wurden hergestellt, ein einfacher weißer

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Polyesterfilm einer Dicke von 0,125 mm (von Toray Industries, Inc.) und der gleiche weiße Polyesterfilm, beschichtet mit einem porösen hydrophoben Film als sauerstoffzuführende Schicht (unter dem WZ "Cellopore" von Sekisui Chemical Co., Ltd. in den Handel gebracht, hergestellt aus Polyethylen einer Dicke von 150 Jim) unter Verwendung eines beidseitig beschichteten Bandes. Darauf wurde eine Überzugslösung der weiter unten angegebenen Zusammensetzung in einer Dicke von 0,2 mm aufgetragen und getrocknet, um eine Reagenzschicht zu bilden, die Farbe entsprechend der Menge Glucose entwickelt. Diese Filme wurden in 10 mm χ 10 mm große Stücke geschnitten und 50 μΐ der Probe von 90 mg/dl (500 jumol/dl) wäßriger Glucoselösung wurden in die Mitte jedes Stückes getropft. Die aufgetropfte Probe sickerte z.T. in die Reagenzschicht ein, aber der größere Teil bildete einen Tropfen auf der Oberfläche der Reagenzschicht. Bei dem Stück mit der Reagenzschicht direkt auf dem Polyesterfilm (nachstehend mit Type A bezeichnet) begann die Farbentwicklung langsam vom Rande des Tropfenbereiches aus. Am Schluß der Reaktion war die Mitte auch gefärbt, aber der Rand war deutlich dunkler als die Mitte. Bei dem Stück mit der Reagenzschicht auf dem porösen Film (nachstehend mit Type B bezeichnet) begann die Farbentwicklung im ganzen Tropfenbereich und dieser war am Ende der Reaktion durchgehend gleichmäßig gefärbt. Die

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Reaktionsrate war bei Type B auch größer.

Zusammensetzung der Überzugslösung für die Reagenzschichtbildung für Type A und Type B

Celluloseacetat 1,2-Dichlorethan Glucose-Oxidase Peroxidase Polyvinyl-pyrrolidon (K-90) 4-Aminoantipyrin 1,7-Dihydrox inaphtha1in Ethanol

O,1M Phosphorsäure-Pufferlösung (pH 7,5)

Beispiel 2

Anstelle der porösen hydrophoben sauerstoffzuführenden Filmschicht der Type B des Beispiels 1 wurde eine Überzugslösung der weiter unten angegebenen Zusammensetzung auf den weißen Polyesterfilm in einer Dicke von 0,2 mm aufgebracht und zur Bildung einer porösen hydrophoben Struktur getrocknet. Mit diesem Analysengerät (Type C) wurde der gleiche Versuch, wie in Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt. Type C gab nahezu die gleiche Einheitlichkeit der Farbentwicklung wie Type B, doch war die Entwicklungsrate etwas kleiner als die der Type B. Im Fall

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8	/0 g
70	ml
200	mg
200	mg
150	mg
12	mg
70	mg
8	,0 ml
16	ml

der Type C wurde festgestellt, daß die gebildete sauerstoffzuführende Schicht die Eigenschaft einer sauerstoffzuführenden Schicht hatte, weil sie das vollständige Durchdringen der Überzugs lösung zur Bildung der Reagenzschicht nicht zuließ.

Zusammensetzung der Überzugslösung zur Bildung der sauerstoffzuführenden Schicht

Polyvinylbutryal-Harz (Polymerisationsgrad: 700) 5 g

Aceton 50 ml

Wasser, gereinigt 10 ml

Netzmittel (Tween 20) 500 mg

Beispiel 3

Anstelle des weißen Polyesterfilms für die Type A des Beispiels 1 wurde eine Keramikplatte, deren Oberfläche einer Hydrophobierbehandlung unterworfen worden war, verwendet. Es wurde ein Analysengerät (Type D) mit einem Substrat, kombiniert mit einer sauerstoffzuführenden Schicht, erhalten. Der gleiche Versuch wie in Beispiel 1 unter Verwendung dieses Gerätes Type D ergab eine Gleichmäßigkeit, Intensität und Farbentwicklungsrate ähnlich wie bei Verwendung der Type B.

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Beispiel 4

Um die Wirksamkeit der sauerstoffzuführenden Schicht nach der Erfindung zu prüfen/ wurde der Reaktionszeitverlauf bei den in Beispiel 1 hergestellten Analysengeräten Type A und Type B bestimmt durch Messung des Reflexionsvermögens bei 550 nm unter Verwendung eines Reflektometers (Integrationskugel 220 A Spektrophotometer für Reflexionsvermögensmessung von Hitachi, Ltd.) an farbentwickeltem Serum a und Serum b bekannter Glucosekonzentration.

Pas Meßverfahren ist folgendermaßen:

1) Tropfe sowohl Serum a (Glucosekonzentration 82 mg/dl; 456 μΐηοΐ/dl) sowie Serum b (Glucosekonzentration 320 mg/dl, 1778 μΐηοΐ/dl) auf die Analysengeräte Type A und Type B, um die Reaktion zu starten.

Verwende Reaktionszeiten, während welcher sich die Probe auf dem Analysengerät befindet, von 0 bis 4 Min., in Stufen von 30 Sekunden.

2) Wenn die jeweilige Reaktionszeit erreicht ist, wische überschüssige Probe mit absorbierender Baumwolle ab (nach Entfernen überschüssiger Probe ist die Oxidation nahezu beendet) und messe nach 1 Minute das Reflexionsvermögen, um die Oxidation zu bestimmen.

Der K/S-Wert wird aus dem Reflexionsvermögen nach folgender Gleichung berechnet:

K/S = (1 - R)²/ (2 X R)

in der bedeuten: K eine Konstante, S der Verlustkoeffizient eines bestimmten Reflexionsmediums, und R das Reflexionsvermögen .

Die Änderung des K/S-Wertes mit der Zeit (Zeitverlauf der Oxidationsreaktion) an Serum a ist in Fig. 6 und an Serum b in Fig. 7 gezeigt.

Dieses Verhältnis ist eine vereinfachte Kubelka-Munk-Gleichung (siehe "Reflectance Spectroscopy" von Gustav Kortum, S. 106 - 111, Springer-Verlag, 1969); der K/S-Wert ist linear proportional der Molkonzentration.

Wie aus den Fig. 6 und 7 zu ersehen, verläuft die Reaktion in einem Analysengerät mit einer sauerstoffzuführenden Schicht schneller ab und erreicht ihren Endpunkt in 2 bis 3 Minuten, während in einem Analysengerät ohne sauerstoffzuführender Schicht die Reaktionsrate kleiner ist und eine schnelle genaue Bestimmung unmöglich ist.

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Beispiel 5

Es wurden zwei Typen von Filmen präpariert, ein einfacher weißer Polyesterfilm einer Dicke von 0,125 mm (von Toray Industries, Inc.) pnd ein gleicher weißer Polyesterfilm, beschichtet mit einer sauerstoffzuführenden Membranfilterschicht (von Sumitomo Electric Industries, Ltd.), unter Verwendung von Doppelbeschichtungsstreifen (using double-coated type). Darauf wurde eine Triglycerid-Überzugslösung der weiter unten angegebenen Zusammensetzung gleichmäßig in einer Dicke von 0,2 mm und einer Breite von 20 mm aufgebracht und bei 40 ⁰C 2 Stunden getrocknet, um eine Reagenzschicht zu erhalten. Danach wurde die Oberfläche der Reagenzschicht etwas angefeuchtet und ein 2 cm breites feines Baumwolltuch (von Toyobo Co., Ltd.) daran mittels Druck geklebt, um eine Nachweisschicht zu bilden. Diese Filme wurden in Beschichtungsrichtung der Reagenzschicht in zwei Hälften geschnitten und dann in 5 mm Breite im rechten Winkel zur Beschichtungsrichtung. So wurden zu einer Einheit zusammengefaßte mehrschichtige Analysengeräte für die Glyceridbestimmung mit 5 mm χ 10 mm Nachweisschicht und Reagenzschicht erhalten, sowie zu einer Einheit zusammengefaßte mehrschichtige Analysengeräte, die zusätzlich eine sauerstoffzuführende Schicht hatten.

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Zusammensetzung der Überzugslösung für die Reagenzschichtbildung für Type E und Type F

Lipoprotein-Lipase * ... . 300 mg

Glyerin-Kinase 50 mg

Glycero-triphosphat-Oxidase 100 mg

Peroxidase 100 mg

Adenosintriphosphat 600 mg

4-Aminoantipyrin 350 mg

Natriumsalz des 3/5-Dimethoxy-N-ethyl-

(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-anilins 375 mg

Magnesiumchlorid 0.2 mg

Natriumalginat 1600 mg

0.2M Phosphorsäurepufferlösung (pH 8.0) 100 ml

Auf das Mehrschicht-Analysengerät, gebildet von einer
Reagenzschicht/ die direkt auf den weißen Polyesterfilm
aufgebracht ist (hierin mit Type E bezeichnet) und auf
das Mehrschicht-Analysengerät mit einer Reagenzschicht,
die auf einem Membranfilter gebildet ist (hierin mit
Type F bezeichnet) wurden 10 |il Serum C (Triglycerid-Konzentration 157 mg/dl, 1768 μΐηοΐ/dl) getropft. Die dabei
erhaltenen Reaktionskurven sind in Fig. 5 wiedergegeben.

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Fig. 8 zeigt, daß die Type F eine größere Reaktionsrate hat als Type E und beweist eine bemerkenswerte Wirkung der sauerstoffzuführenden Schicht, durch welche den beiden Seiten der Reagenzschicht Sauerstoff zur Verfügung gestellt wird.

Im Vorstehenden wurden bevorzugte Beispiele beschrieben, an denen jedoch noch Änderungen vorgenommen werden können, ohne den Rahmen der Erfindung zu verlassen.

Bevorzugte poröse hydrophobe Materialien, die als sauerstoffzuführende Schicht verfügbar sind, sind hydrophobe poröse Filme, hydrophobe Faservliese und Gewebe, hydrophobes Papier, Metallmaschendraht, Polyamidnetze, poröse Harze, Keramiken, die einer Oberflächen-Hydrophobierbehandlung unterworfen worden sind, poröses Glas und poröse Metallfolien. Es ist auch möglich, ein poröses hydrophobes Material, das an einer Seite hydrophob ist und auf dieser Seite mit der Reagenzschicht versehen ist, zu verwenden. Jedes poröse Material ist verwendbar, wenn es für die Beschichtungslösung zur Bildung der Reagenzschicht nicht völlig durchlässig ist.

Ein Träger (2) kann auch als sauerstoffzuführende Schicht dienen, wenn er porös und hydrophob ist.

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Wie im einzelnen vorstehend beschrieben, führt das Analysengerät mit einer sauerstoffzuführenden Schicht nach der Erfindung zu einem glatten Ablauf der Oxidationsreaktion, da es die Zufuhr von Sauerstoff, der für die Oxidation des festen Reagenzes in dem Reaktionssystem erforderlich ist, auch von der Trägerseite aus gestattet. So ist dies ein Analysengerät mit festem Reagenz, welches Oxidase enthält, das schnelle und genaue Analysen ermöglicht.

Claims

32 818-21 PATENTANWÄLTE DH.-INC:. H. NIJOKN:TANK ;-ΙΓΤ3, ■ HAUCK, SCHMITZ, GRAALFS, WBHNERT, DÖRING HAMBURG MÜNCHEN DÜSSELDORF PATENTANWÄLTE · NBUKR WALL 41 · 2(K)O HAMIIUHO HO Kabushiki Kaisha Kyoto Daiichi Kagaku 57, Nishiaketa-cho, Higashikujo, Minami~ku, Kyoto-shi KYOTO/JAPAN Dlpl.-Phys. W. SCHMITZ - Dipl.-Ing. E. GRAALFS Neuer Wall 41 · 20OO Hamburg 36 Telefon + Telecopier (O4O) 38 67 56 Telex 021176» input d »ipl-Ιηκ. II. IIAUCK - Dipl.-Ing. W.WBHNEHT Mozartstraße 23 · 8000 München Telefon + Telecopier (OHO) 53Ü2 3H Telex 0B216BB3 pnniu d IJr1-ItIfJ-W. DÖRING K-Wilhelm-HiiiK 41 . 4OOO Düsseldorf Telefon (O2 H) B7B0 27 ZUSTELLUNGSANSCHRIFT / PLEASE REPLY TO: Hamburg. 26. März 1985 Analysenqerät mit einer eine Oxidase enthaltenden Reagenzschicht Ansprüche

1. Analysengerät mit einem Träger und einer eine Oxidase enthaltenden Reagenzschicht, dadurch gekennzeichnet, daß es eine poröse hydrophobe sauerstoffzuführende Schicht enthält.

2. Analysengerät nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die sauerstoffzuführende Schicht zwischen dem Träger und der Reagenzschicht vorgesehen ist.

3. Analysengerät nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die sauerstoffzuführende Schicht auch als der

Träger dient.

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