DE2709625A1 - Kunststofftraeger und verfahren zur durchfuehrung von wissenschaftlichen, analytischen oder diagnostischen untersuchungen - Google Patents

Kunststofftraeger und verfahren zur durchfuehrung von wissenschaftlichen, analytischen oder diagnostischen untersuchungen

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Description

ι*.
389-06/49/76
CASCH/DOJ 24. Februar 1977
Kunststoffträger und Verfahren zur Durchführung von wissenschaftlichen, analytischen oder
diagnostischen Untersuchungen
Die Erfindung betrifft einen Kunststofflager und ein Verfahren zur Durchführung von wissenschaftlichen, analytischen und diagnostischen Untersuchungen. Insbesondere betrifft sie einen Kunststofftrager, mit dem Erreger, pathologische Zellformen sowie andere krankhafte Prozesse im menschlichen oder tierischen Organismus schnell nachgewiesen werden können.
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Im allgemeinen, vor allem aber in der medizinischen Labortechnik werden für die mikroskopische Diagnostik an Zellen aus Gewebeproben sowie für den Nachweis von Mikroorganismen Färbeverfahren eingesetzt. Hierbei müssen die Präparate je nach dem geforderten Differenzierungsgrad herzustellender intrazellulärer Strukturen und Substanzen oft sehr zeit- und materialaufwendigen Reaktionen unterzogen werden. Zur Durchführung des Färbeverfahrens werden die benötigten Farbstoffe ir Lösung gebracht und die Objektträger mit dem einzufärbenden Probematerial entweder im Tauchverfahren in diese Lösungen überführt oder mit der Farblösung beschichtet. Der gesamte Färbeprozess wird häufig über mehrere Stufen von Zwischenbehandlungen in verschiedenen Bädern durchgeführt. Das Anfärben der Probematerialien wird von verschiedenen Faktoren beeinflußt, z.B. von der Art des Farbstoffes, der Einwirkungszeit, dem pH-Wert sowie von Verunreinigungen oder Niederschlägen in der Farblösung. Ferner neigen viele Farblösungen dazu, insbesondere im verdünnten Ansatz auszufällen.
Die in der Hämatologie zur Blutzelldiagnostik und zum Nachweis von Erregern im Blut z.B. Trypanosomen oder Malariaerregern am häufigsten eingesetzte Giemsa-Lösung (z.B. gemäß L. Hallmann, "Klinische Chemie und Mikroskopie", 1966, Thieme-Verlag) ist sehr instabil. Diese Farblösung muß vor dem Gebrauch jeweils aus einer Stammlösung frisch angesetzt und vor dem Färbeprozeß sorgfältig filtriert werden.
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Zahlreiche für die Diagnostik sowie auch für wissenschaftliche Untersuchungen eingesetzte Färbeverfahren haben deshalb den Nachteil, daß sie für die praktische Anwendung zeitaufwendig und kompliziert sind. Sie erfordern eine ständige Erneuerung der Reagentien und sind in ihrer Wirkung auf das Objekt nicht st andardi si erbar.
Für den Nachweis von Krankheitserregern in der medizinischen Diagnostik, z.B. Trypanosomen im Blut können außer der Giemsa-Färbung auch andere Methoden angewandt werden. Durch die Immunfluoreszenzmethode werden die Erreger durch fluoreszenzmarkierte Antikörper spezifisch nachgewiesen. Bei der Immunfluoreszenzfärbung wird entweder die direkte oder die indirekte Methode angewandt. Bei der direkten Methode wird der Antikörper mit FITC (Fluoreszeinisothiocyanat) konjugiert. Er bildet mit dem Antigen einen FITC-Antikörper-Antigen-Komplex. Bei der indirekten Methode wird ein fluorochromierter Antikörper eingesetzt, der sich mit dem Antigen-Antikörper-Komplex verbindet.
Die für die beiden letztgenannten Verfahren benötigten Färbelösungen mit den in diesen enthaJ tenon Antikörpern sind ebenfalls nur bedingt haltbar. Sie missen ständig in tiefgekühltem Zustand aufbewahrt werden. Außerdem erfordern diese Methoden ein sehr präzises Arbeiten, damit die notwendige gleichmäßige Beschichtung des Präparates mit der Färbelösung gewährleistet ist.
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Nicht nur die Färbereaktionen in der medizinischen Labortechnik, sondern auch andere mikroskopische Nachweisreaktionen, z.B. in der Kriminalistik erfordern komplizierte, zeitaufwendige Maßnahmen und äußerste Sorgfalt.
Der Nachweis von Organerkrnnkungen wird häufig durch Bestimmung von chemischen Substanzen in Körperflüssigkeiten durchgeführt. So werden z.B. für die Bestimmung von Lactat-Dehydrogenase (LDH) im Serum bei Blut- und Lebererkrankungen oder beim Herzinfarkt, der entnommenen Körperflüssigkeit Reagentien zugesetzt und die hierbei auftretenden Veränderungen photometrisch bestimmt. Die Bestimmung beruht auf dem Prinzip, daß das Enzym Lactat-Dehydrogenase die wasserstoffabertragende Reaktion
Pyruvat + NADH + H+ ^=* Lactat + NAD+,
deren Gleichgewicht weit auf der Seite von Lactat und NAD (Nicotinamid-adenin-dinucleotid) liegt, katalysiert. Man bestimmt die Aktivität der LDH aus der Geschwindigkeit der durch diese Reaktion hervorgerufenen NADH-(reduziertes Nicotinamidadenin-dinucleotid) Abnahme. NADH ist aufgrund seiner Absorption bei 366, 340 oder 334 mn leicht zu bestimmen.
Für die Durchführung dieser Methoden sind Mischungs- und Pipettierungsprozesse erforderlich, die äußerste Sorgfalt erfordern und zeitaufwendig sind. Hinzu kommt, daß manche Reagen-
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tien vor dem Gebrauch jeweils aus einer Stammlösung frisch angesetzt werden müssen. Die Reaktionen werden ferner von verschiedenen Faktoren beeinflußt, z.B. der Einwirkungsweise der Reagentien sowie von Verunreinigungen und dergleichen.
Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, diese Nachteile zu überwinden und ein Verfahren zu entwickeln, mit dem wissenschaftliche, analytische oder diagnostische Untersuchungen schnell, einfach und verläßlich durchgeführt werden können.
Es hat sich nun gezeigt, da/' sich diese Aufgabe in technisch fortschrittlicher Weise lösen läßt, wenn gemäß vorliegender Erfindung ein Träger verwendet wird, der aus einem löslichen Kunststoff besteht, und in ('em die zu untersuchenden und/oder die zur Durchführung von Untersuchungen erforderlichen Materialien eingebaut sind, welche beim An- oder Auflösen des Trägers teilweise oder vollständig freigesetzt werden. Die weiteren Ausführungsformen sind in den Unteransprüchen 2 bis erläutert.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man einen löslichen Kunststofftrager verwendet, in dem die zu untersuchenden und/oder die zur Durchführung von Untersuchungen erforderlichen Materialien eingebaut sind und daß man diesen Kunststoffträger unmittelbar vor der Untersuchung auflöst.
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Wird nach dem erfindungsgemüßen Verfahren ein Kunststoffträger verwendet, in dem lediglich die zu untersuchenden Materialien eingebaut bzw. angeordnet sind, so wird er unmittelbar vor der Untersuchung in einem geeigneten Lösungsmittel aufgelöst. Nach einer besonders vorteilhaften Ausführungsform kann z.B. ein entnommenes Zellmaterial zu einem beliebig späteren Zeitpunkt untersucht werden. Hierzu wird eine mit entsprechenden Farbstoffen versehene Folie einseitig mit Wasser angelöst, mit der Fläche, an der sich die zu entnehmenden Zellen befinden, kontaktiert und wieder abgezogen. Hierauf befinden sich die Zellen an der Klebfläche der Folie und können durch kurzes Eintauchen in einer Fixierflüssigkeit, z.B. Äthanol, welches die Folie nicht auflöst, fixiert werden. Anschließend wird die Folie mit der klebenden Fläche auf einen Objektträger aufgebracht, wodurch alle fixierten Zellen zwischen Folie und Objektträger eingeschlossen sind. Der Objektträger kann nunmehr verschickt, gelagert oder anderweitig aufbewahrt und zu einem späteren Zeitpunkt durch Auflösen der Folie behandelt und untersucht werden. Anstelle des kontaktierten Objektträgers kann auch eine zweite lösliche Folie für das Einschließen der Zellen verwendet werden. In diesem Falle kann es zu späteren Untersuchungen zweckmäßig sein, das gesamte Kunststoffmaterial aufzulösen und die Zellen durch Zentrifugieren von der Lösung zu trennen. Träger, in denen die Zellen eingeschlossen sind, können gleichzeitig die zur Durchführung von Untersuchungen erforder-
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lichen Reagentien enthalten. Sind in dem Träger lediglich die zur Durchführung von Untersuchunp.en erforderlichen Materialien, wie Farbstoffe und Immunfluoreszonzreagentien bzw. Enzymsubstrate eingebaut, ,jedoch nicht die Untersuchungsmaterialien, so wird er auf einer Seite mit einem geeigneten Lösungsmittel angefeuchtet, auf dieser Seite mit dem Untersuchungsmaterial in Berührung gebracht und ansc lließend unmittelbar vor der Untersuchung in dem Lösungsmittel aufgelöst.
Zur Untersuchung von Körperflüssigkeilen auf Erkrankungen im tierischen oder menschlichen Organismus, bei der die Körperflüssigkeit mit Reagentien versetzt und die Reaktionsprodukte in üblicher Weise bestimmt werden, wird der abgemessenen Menge Probeflüssigkeit ein Kunststoffkörper zugegeben, der darin löslich ist und in dem die zur Untersuchung erforderlichen Reagentien in genauer Dosierung eingeschlossen sind. Vorzugsweise enthält der Kunststoffkörper zu diesem Zweck Enzymsubstrate, Enzyme, Mischungen von Enzymsubstraten und Enzymen und Immunreagentien und Puffer-Salze.
Der erfindungsgemäße lösliche Kunststoffträger besteht vorzugsweise aus Polyvinylalkohol odor Polyvinylpyrrolidon. Besonders geeignet ist ein Vinylpyrrolidonpolymerisat mit einem Molekulargewicht von ca. 40.000 bis ca. 700.000, das aus Vinylpyrrolidon-Vinylacetat-Mischpolymerisaten mit unterschiedlichen Vinylacetatanteilen und aus einem teilverseiften nieder-
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polymeren Polvinylalkohol hergestellt wird.
Zum Lösen des Kunststoffträgers sind Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemische geeignet, welche gegenüber den zu untersuchenden Materialien keine schädlichen Wirkungen entfalten und die durchzuführende Reaktion nicht beeinflussen. Vorzugsweise wird ein Träger verwendet, der in Wasser löslich ist. Andere geeignete Lösungsmittel sowie ihre Mischungen mit Wasser, z.B. Alkohol/Wasser- bzw. Aceton/Wasser-Gemische, können ebenfalls eingesetzt werden. Die Mischungsverhältnisse der Lösungsmittelkomponenten können dem jeweiligen Löslichkeitsgrad des verwendeten Kunststoffes bzw. der Art der durchzuführenden Reaktion angepaßt werden.
Zur Färbung von Zellen, Gewebeschnitten und Mikroorganismen können die herkömmlichen Farbstoffe, Immunfluoreszenzreagentien oder Enzymsubstrate in den Kunststoffträgern eingebaut werden. Zur Durchführung von Reaktionen in Lösung werden die Träger mit Enzymsubstraten, Enzymen oder Immunreagentien versehen.
Die erfindungsgemäßen Kunststoffträger werden dadurch hergestellt, daß die für die entsprechenden Reaktionen erforderlichen Stoffe in die Kunststofflösung eingebracht werden. Aus dieser Kunststofflösung wird anschließend eine Folie oder ein Formkörper gebildet. Filme oder Folien von z.B. 0,1 mm Dicke können durch Aufrakeln der entsprechenden Polymerisatlösungen auf eine
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. Al-
Unterlage, z.B. Glas oder Polyätliylenfolie, erhalten werden. Dadurch sind die Reagentien mit Kunststoff umhüllt und haltbar eingeschlossen.
Der Kunststoffträger kann auch in and3ren, für die Aufbewahrung oder Dosierung geeigneten Formen, z.B. Perlen oder Kugeln, vorliegen. Der reagentienhaltige Kunststoffträger kann z.B. auch auf einem Spatel aufgebracht sein, der gleichzeitig zum Rühren der Reaktionslösung verwendet wird.
Die Art und Menge der Reagentien sowie deren Verteilungsßrad im später entstehenden Kunststoffkörper bzw. Kunststoffolie können vorher durch entsprechende Dosierung und Homogenisierung in der Lösung exakt vorbestimmt und den späteren Erfordernissen angepaßt werden.
Die nachfolgenden Beispiele erläutern die vorliegende Erfindung.
Beispiel 1
Eine Mischung aus 300 Gew.-Teilen Polyvinylalkohol (88 Mol.-% Hydroxylgruppen, Viskosität 4 cP nach DIN 53015), 150 Gew.-Teilen Giemsa-Lösung, 120 Gew.-Tcilei! Glycerin p.A. und 430 Gew.-Teilen destilliertes Wasser wird homogenisiert. Anschließend wird aus dieser Lösung ein Film von 0,1 mm Dicke gegossen, der nach dem Abdampfen des Wassers eine Kunststoff-
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folie bildet, in der die Giemsa-J^arbstoffpartikel vollkommen gleichmäßig verteilt sind. Die Kunststoffolie wird einseitig mit Wasser angelöst, wobei die angelöste Kunststoffschicht eine außerordentliche Klebrigkeit aufweist, und mit ihrer klebenden Seite mit der Oberfläche eines Objektträgers, der z.B. mit Blutzellen beschichtet ist, kontaktiert. Anschließend wird der liegende Objektträger mit der nach oben weisenden Kunststofffolie mit Wasser oder mit Wasser-Alkohol-Gemisch (1:1) bedeckt. Nach Lösen der Folie wird der Farbstoff freigesetzt. Dieser färbt die Blutzellen ein. Für den gesamten Vorgang werden nur wenige Minuten benötigt. Die Färbung ist absolut gleichmäßig und entspricht in jeder Beziehung den geforderten Bedingungen in der Zelldarstellung.
Beispiel 2
Eine Mischung aus 175 Gew.-Teilen PoJyvinylalkohol (88 Mol.-% Hydroxylgruppen, Viskosität 4 cP nach DIN 53015), 140 Gew,-Teilen Glycerin p.A., 255 Gew.-Teilen destilliertes Wasser und 500 Gew.-Teilen Wrights-Eosin-Methylenblau-Lösung wird homogenisiert. Die Probeentnahme und die Durchführung der Untersuchung erfolgt nach dem im Beispiel 1 beschriebenen Verfahren.
Beispiel 3
Für die Bestimmung von Trypanosomen werden in 750 Gew.-Teilen Kunststofflösung, die aus 280 Gew.-Teilen Polyvinylalkohol,
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70 Gew.-Teilen Sorbitpulver und 6CO Gew.-Teilen destilliertes Wasser oder aus ooo Gew.-Teiler1. Polyvinylalkohol, 120 Gew.-Teilen Glycerin p.A., 400 Gew.-Teilen Äthylalkohol p.A. und 440 Gew.-Teilen destilliertes Wasser besteht, 2 >0 Gew.-Teile einer fluoreszenzraarkierten Antikörperlösung eingebracht. Anschließend wird eine Folie oder ein Formkörper gebildet. Nach dem Verfahren des Beispiels 1 wird die Folie einseitig angelöst, mit der Oberfläche eines Objektträgers kontnktiert, auf dem sich ein entsprechender Ausstrich befindet. Bei der direkten Nachweismethode wird die auf dem Objektträger befindliche Kunststoffolie mit Konjugatpuffer aberschichtet und ca. 1 Stunde bei 37 C in einer feuchten Kammer inkubiert. Hierauf wird die Probe abgespült, getrocknet und unter dem Fluoreszenzmikroskop untersucht.
Bei der indirekten Methode wird wie oben beschrieben verfahren. Die Fluoreszenz wird jedoch durch eine zweite Inkubation mit einem FITC-konjugierten Antikörper gegen den ersten erhalten. Der erste Antikörper ist dabei nicht fluoreszenzmarkiert.
Beispiel 4
Die für den LDH-Nachweis im Serum erforderlichen Reagentien, z.B. Na2IIP04/NaII2P04/Natriumpyruvnt/NADII werden in erforderlichen Mengen in eine Kunststofflösung eingegeben und homogenisiert. Hierbei werden folgende Kunststofflösungen verwendet:
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I) COO Gew.-Teile Polyvinylalkohol (38 Mo1.-% Hydroxylgruppen; Viskosität 4 cP nach DIN 5Π015) 120 Gew.-Teile Glycerin p.A. 400 Gew.-Teile Äthylalkohol p.A. 440 Gew.-Teile destilliertes tfassor
II) 280 Gew.-Teile Polyvinylalkohol (88 Mol.-% Hydroxylgruppen; Viskosität 4 cP nach DIN 53013) 70 Gew.-Teile Sorbitpulver 650 Gew.-Teile destilliertes «fässer.
Aus diesen Kunststofflösungen mit den erforderlichen Reagentien
ο werden Folien hergestellt, wobei pro i:m Folienfläche 21,6 mg Na2HPO4·2Η20, 27,8 mg NaH2PO4^IiH2O, 0,2 mg Natriutnpyruvat urd 35,8 mg NADH anwesend sind. 3 ml dest .liiertes Wasser werden in eine Küvette pipettiert und nach Zugabe der Folie mit den oben angegebenen Mengen an Puffer/Pyruvat und NADH 5 bis Sekunden umgerührt. Danach werden 0,1 ml frisches hämolysefreies Serum hinzupipettiert und mit der Lösung gemischt. Die Extinktion wird nach 1, 2 und 3 Minuten bei 366, 340, 334 nm in an sich bekannter Weise gemessen. Aus der gemessenen Extinktionsdifferenz pro Minute wird die Enzymmenge mU/ml best imat.
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Claims (13)

  1. 389-06/49/76
    CASCH/DOJ 24. Februar 1977
    Patencanspruche
    . 1.7Kunststoffträger zur Durchführung von wissenschaftlichen, analytischen oder diagnostischen Untersuchungen, dadurch gekennzeichnet, daß er aus einem löslichen Kunststoff besteht, in dem die zu untersuchenden und/oder die zur Durchführung von Untersuchungen erforderlichen Materialien eingebaut sind, welche beim An- oder Auflösen des Trägers teilweise oder vollständig freigesetzt werden.
  2. 2. Träger nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der lösliche Kunststoff der Gruppe der Polyvinylalkohole oder Polyvinylpyrrolidone angehört.
  3. 3. Träger nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Kunststoff in Wasser und/oder Alkohol löslich ist.
  4. 4. Träger nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, drß er chemische oder biologische ReagentLen, Farbstoffe, Immun-
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    ORIGINAL INSPECTED
    a-
    fluoreszenzreagentien, Enzymsubstrate, Enzyme, Mischungen von Enzymsubstraten und Enzymen, Immunreagentien und Puffersalze enthält.
  5. 5. Träger nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß er Mikroorganismen, Zellen, Partikel oder dergleichen enthält.
  6. 6. Träger nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß er die zur Durchführung von Untersuchungen erforderlichen Materialien in homogener Verteilung enthält.
  7. 7. Träger nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gjkennzeichnet, dai er die Form einer Folie oder eines Fj Ims aufweist.
  8. 8. Träger nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß er aus mindestens zwei Lagen Folie oder /ilm besteht, wobei zwischen den Lagen die zu untersuchenden Materialien angeordnet sind.
  9. 9. Träger nacli Anspruch 8, iadurch gekennzeichnet, daß zwischen den Lagen Zellen angeordnet sind.
  10. 10. Verfahren zur Durchführung von wissenschaftlichen, analytischen oder diagnostischen Untersuchungen, dadurch gekennzeichnet , daß man einen löslichen Kunststoffträger verwendet, in dem die zu untersuchenden und/oder die zur Durchführung von Untersuchungen erforderlichen Materialien eingebaut sind,
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    - ν -•3-
    und daß man diesen Kunststoffträger unmittelbar vor der Untersuchung auflöst.
  11. 11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man einen löslichen Kunststoffträger verwendet, in dem die zur Durchführung von Untersuchungen erforderlichen Materialien eingebaut sind und daß man diesen Träger auf einer Seite mit einem geeigneten Lösungsmittel anleuchtet, auf dieser Seite mit dem Untersuchungsmaterial in Lerührung bringt und anschließend unmittelbar vor der Untersuchung in dem Lösungsmittel auflöst.
  12. 12. Verfahren nach Anspruch 10 und 11. dadurch gekennzeichnet, daß der Träger in Wasser und/oder Alkohol angefeuchtet bzw. aufgelöst wird.
  13. 13. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man einen, in zu untersuchenden Körperflüssigkeiten löslichen Kunststoffträger verwendet, in dem die zur Durchführung von Untersuchungen erforderlichen Reagentien in genauer Dosierung eingebaut sind und daß man den Träger in der abgemessenen Menge Probeflüssigkeit auflöst und die Reaktionsprodukte in an sich üblicher Weise bestimmt.
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