DE2635449A1

DE2635449A1 - Verfahren zum anfaerben und versiegeln einer biologischen probe und fluessige formulierung zur durchfuehrung des verfahrens

Info

Publication number: DE2635449A1
Application number: DE19762635449
Authority: DE
Inventors: John Auten Geating
Original assignee: General Electric Co
Current assignee: General Electric Co
Priority date: 1975-08-08
Filing date: 1976-08-06
Publication date: 1977-03-03
Also published as: IT1062484B; FR2320544B1; FR2320544A1; DE2635449B2; DE2635449C3; JPS5289374A; GB1557722A; JPS5421757B2

Description

Dr. rer. nat. Horst Schüler όοοο Frankfurt/Main ι ₅. Aug. 1976

PATENTANWALT Kaiserstrasse 41 Dr. Sb. /ki

Telefon (0611) 235555

2635449 ^Telex: ^^{16759 m}ap°^td

Postscheck-Konto: 282420-602 Frankfurt/M.

Bankkonto: 225/0389

Deutsche Bank AG, Frankfurt/M.

3991-39-SS-2358

GENERAL ELECTRIC COMPANY

1 River Road
Sehenectady, N.Y., U.S.A.

Verfahren zum Anfärben und Versiegeln einer biologischen Probe und flüssige Formulierung zur Durchführung des Verfahrens

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Anfärben und Versiegeln einer auf einen mikroskopischen Objektträger aufgetragenen und luftgetrockneten biologischen Probe, insbesondere Blutprobe. Die Erfindung bezieht sich weiter auf eine viskose flüssige Formulierung zum gleichzeitigen Anfärben und Versiegeln einer biologischen Probe.

Es war bekannt, vergleiche z.B. die US-PS 3 389 052, dass ein Schutz cytologischer Proben erhalten werden kann, wenn man diese Proben in Form von Abstrichen zum Transport in ein pathologisches Laboratorium auf einen Objektträger aufbringt, und vor oder als Teil eines üblichen Anfärbeprozesses ein Schutz-

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überzug entfernt wird.

Als Überzug wurde mit einem Aerosolspray aufgebrachtes PoIyäthylenglycol benutzt, das bei dem üblichen Anfärben entfernt wird- Es ist auch der Gebrauch anderer Überzüge bekannt, die vor dem Anfärben der Probe entfernt werden können.

Auch der Gebrauch eines Deckplättchens ist bekannt, das vorher mit einem Klebstoff überzogen worden ist, das angefeuchtet mit einer gewebesäubernden Flüssigkeit, wie Toluol oder Xylol, beim Aufbringen auf einen mikroskopischen Objektträger ausreichend klebrig wird und durch Aufdrücken auf den Objektträger fest damit verbunden wird. Die Probe auf dem Objektträger ist üblicherweise angefärbt worden, doch ist eine solche Lehre ausschliesslich eine des mechanischen Befestigens des Deckplättchens, vergleiche z.B. US-PS 3 498 860.

Eine weiter bekannte Technik ist das Überziehen eines mikroskopischen Objektträgers mit einem transparenten Metallfluorid, um eine Haftung für eine histologische Probe zu erhalten, wie einen gefrorenen oder Paraffinschnitt. Bei dieser Technik kann man eine aufgedampfte Schicht aus Magnesiumfluorid mit einer Dicke, die einen Bruchteil einer Wellenlänge des sichtbaren

verwenden.,
Lichtes entspricht,I Der Vorteil einer solchen Technik ist es, dass die Schicht durch die übliche Gewebebehandlung unbeeinflusst zu bleiben scheint und sie ausserdem kein Kulturmedium ist. Eine Beziehung zum Anfärben ist nicht vorgeschlagen, vergleiche Hierzu US-PS 3 770 477.

Eine andere Art des Herangehens , die in der Vergangenheit angewendet wurde, ist die Herstellung leicht abgemessener geringer Mengen trockener Reagenzien durch Sättigen absorbierender inerter Träger aus faserförmigem Material in Blattform mit einer Lösung bekannter Konzentrationen des Reagenz, die gleichmässig durch den Träger verteilt werden kann und die man dann trocknen lässt. Den Träger kann man dann in Teile zerschneiden und so einen definierten Anteil des Reagenz erhalten. 10 Milligramm

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ο des Reagenz in Lösung, die über 100 cm verteilt sind, können somit 100 Mikrogramm pro cm des Trägers ergeben. Eine solche geringe jedoch genau bestimmte Menge kann in Lösung gewonnen werden, in dem man den Trägerteil in ein Lösungsmittel eintaucht . Die Idee des Aufnehmens trockener Reagenzien in einen Trägerstreifen wurde auf ein Verfahren zum Anfärben getrockneter Blutabstriche ausgedehnt. Ein. Whatman Filterpapier Nr. kann mit einer methanolischen Lösung von Eosin Y, Methylen-Blau, Azur A und Methylen-Violett gesättigt und getrocknet werden. Zur Anwendung wird das getrocknete, die Farbe enthaltende Papier in eine Methylalkohol-Lösung eines Katalysators, wie Propylenglycol oder Chlorophyl eingetaucht. Sie wird dann auf den getrockneten Blutabstrich aufgebracht, 1 bis 3 Sekunden darauf gelassen und entfernt. Die angefärbte Oberfläche, üblicherweise ein mikroskopischer Objektträger, wird dann in einer Pufferlösung gespült und getrocknet. Das Anfärben soll rasch erfolgen, in der Grössenordnung von 20 bis 90 Sekunden. Andere bakteriologische Färbemittel können in ähnlicher Weise aufgebracht werden. In jedem Falle wird der Papierstreifen lediglich als Träger der Farbe benutzt, die in Lösung gebracht werden muss, indem man den Streifen vor der Verwendung anfeuchtet und der Streifen wird von der präparierten Probe entfernt, nachdem er seinen Zweck der Übertragung der Farbmittellösung auf die Probe erfüllt hat, vergleiche hierzu die US-PS 3 678 151.

Im Stand der Technik ist auch das Problem behandelt worden,

zu verhindern, dass sich Proben, wie die des Diarrhöe-Stuhls, die mit Polyvinylalkohol-Pixativ oder einem ähnlichen Material wie Äthylzellulose, überzogen sind, durch den Methylalkohol, in den sie beim Anfärben wiederholt eingetaucht werden, von dem Objektträger lösen, an dem sie haften. Dies wurde erreicht durch Eintauchen des Objektträgers vor dem Anfärben in Wasser, Salzlösung, Glycerin oder Diäthylenglycol. Die Objektträger können auch mit Neopren überzogen werden oder man kann sie vor der Verwendung aufrauhen. Diese Technik ist jedoch auf die Verwendung einer organischen Kunststoffumhüllung als Träger der Farbe oder als Schutz der angefärbten Proben gerichtet und er.be-

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trifft den Schutz einer eingekapselten Probe vor dem Angriff
durch die später aufgebrachte Anfärbelösung, vergleiche US-PS
3 737 335.

Im Stand der Technik ist auch die Zubereitung eines vorgefärbten Objektträgers, der eine getrocknete Mischung aus Methylen-Blau NN und Cresylviolettacetat trägt, bekannt. Wird ein Tropfen Blut auf dem Objektträger angeordnet und mit einem Deckplättchen ausgebreitet, dann wird das Blut differenziell in einer Weise
angefärbt, die sonst zwei getrennte Zubereitungen erfordern,
vergleiche US-PS 3 796 594.

Schliesslich war es auch bekannt, vorgefärbte Objektträger wie die vorbeschriebenen zum Nachweis von Malariaparasiten im Blut zu verwenden, vergleiche US-PS 3 834 874.

Keine der Druckschriften des Standes der Technik lehrt jedoch
die Anwendung einer Lösung, welche das Färbungsmittel enthält, das auf die Probe aufgebracht werden soll sowie ein Dichtungsmittel, welches das Deckplättchen mit der angefärbten Probe
und dem Objektträger, auf dem sich die Probe befindet, versiegelt, noch wird derartiges durch den Stand der Technik nahegelegt.

Auf eine biologische Probe, z.B. Blut als luftgetrocknetem Abstrich, das auf einem üblichen Glasobjektträger zur Mikroskopie befestigt ist, die in üblicher Weise erhalten wurde, trägt man aus einer flexiblen Flasche, die eine Düse oder eine ähnliche
Ausgabevorrichtung aufweist, einen Streifen oder Wulst einer
viskosen flüssigen Formulierung auf, die ein transparentes Harz, wie Methylzellulose enthält, in der das geeignete Färbemittel
gelöst ist. Ein sauberes Glasdeckplättchen wird über dem Objektträger in Berührung gebracht mit dem viskosen flüssigen Streifen und die Oberflächenspannung der Flüssigkeit zieht das Deckplättchen gegen den Objektträger und den darauf befindlichen
Abstrich nach unten und breitet so die Flüssigkeit über den Objektträger aus und bringt das gelöste Färbemittel in Berührung

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mit der Probe. Die Bedienungsperson braucht keine weitere Handlung auszuführen. Die Probe wird sehr rasch angefärbt. Die flüchtigen Lösungsmittel in der viskosen Flüssigkeit verdampfen und lassen das Harz fest als eine transparente einhüllende Matrix zurück, welche das Deckplättchen fest auf dem Objektträger hält und die Probe von der umgebenden Atmosphäre abschliesst und sie so schützt.

Dieses Verfahren ist hinsichtlich der erforderlichen Zeit der Bedienungsperson wirtschaftlich, insbesondere wo, wie in einem pathologischen Laboratorium, eine grosse Zähl von Proben mit dem gleichen Färbemittel anzufärben ist.

Die Erfindung wird anschliessend anhand von Beispielen unter Bezugnahme auf die Zeichnung näher erläutert. Im einzelnen zeigen:

Figur 1 einen mikroskopischen Objektträger mit einer getrockneten Probe darauf, auf die ein Streifen der viskosen flüssigen Formulierung aufgebracht ist

Figur 2 den mikroskopischen Objektträger der Figur 1, über dem ein Deckplättchen in der richtigen Lage angeordnet ist, um aufgebracht zu werden,

Figur 3 den mikroskopischen Objektträger und das Deckplättchen der Figur 2, nachdem das Deckplättchen in Berührung mit der viskosen Formulierung gebracht und nach unten gegen den Objektträger und die getrocknete Probe gezogen worden ist.

Beispiel 1

Eine 5%ige nicht-wässrige Lösung von Methylzellulose wurde hergestellt, indem man zu 100 ml Ν,Ν-Dimethylformamid unter Rühren 5 g Hydroxypropylmethylzellulose-Pulver mit einer nominellen Viskosität von 15 Centipoise hinzugab. (Dieses Material ist

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unter der Bezeichnung A-I5 von der Dow Chemical Company, Midland, Michigan, erhältlich). Zu einem Milliliter der so hergestellten Lösung gab man 0,5 ml einer Lösung von 1,0 g Wright Färbemittel-Pulver in 20 ml destilliertem Wasser. Das Wright Anfärbemittel-Pulver ist ein im Handel erhältliches Produkt, das amtlich garantiert geliefert wird, das eine geeignete Form der Feststoffe darstellt, die in Lösung Wrights Färbemittel ergeben. Zu der Mischung von Methylzellulose und Wrights Färbemittel werden dann noch 0,5 ml Glyzerin p.a. hinzugegeben.

Für die nächsten vier Beispiele wurde gepufferte Methylzelluloselösung benötigt, deren Zubereitung deshalb getrennt beschrieben wird:

Zu 82,35 ml 0,2 molaren Dinatriumorthophosphates (Na₂HPO₄) wurden 17,65 ml 0,177 molarer Zitronensäure (CgHgO₇) hinzugegeben (diese Kombination ist als Mcllvaine's Standardpuffer bekannt). Die Mischung wurde dann auf 90 bis 95 C erhitzt. In den angegebenen Proportionen erzeugt dieser Puffer etwa einen neutralen pH-Wert und sofern in der folgenden Anmeldung Mcllvaine*s Standardpuffer erwähnt ist, dann bedeutet dies eine Lösung im wesentlichen mit diesen Proportionen. Zu der heissen Lösung wurden dann unter kräftigem Rühren mit einem Glasstab 10 g Hydroxypropylmethylzellulose mit einer nominellen Viskosität von 15 Centipoise

hinzugegeben. Die Methylzellulose geht beim Abkühlen der Pufferlösung langsam in Lösung. Das erhaltene Produkt ist die gepufferte Methylze Hu lose lösung.

Beispiel 2

Zu 100 ml Wasser gab man 4 g Polyvinylpyrrolidon mit einem

Molekular gewicht von etwa 44.000. Die Mischung wurde gerührt

und geschüttelt, bis eine Lösung erhalten wurde.

Zu 20 ml destillierten Wassers gab man 1 g des pulverförmigen Wright'sehen Färbungsmittels. In die Mischung führte man eine Ultraschallmikrosonde ein und betrieb sie 5 Minuten lang mit

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60 Watt Ausgangsleistung. Die erhaltene Lösung wurde durch Whatman Filterpapier Nr. 1 filtriert. Die tatsächlich verwendete Ultraschallvorrichtung war das Sonifier Cell Disruptor Modell No. W-185 von Heat Systems-Ultrasonics, Inc., Plainview, N.Y.

Von der Polyvinylpyrrolidonlösung und der Wright'sehen Färbemittellösung wurden gleiche Volumina vermischt und 0,5 ml der Mischung wurden zu 1 ml der gepufferten MethylzelIuloselösung hinzugegeben.

Beispiel 3

Zu 20 ml N,N-Dimethylformamid gab man langsam unter Rühren 1 g des pulverförmigen Wright^fschen Färbungsmittels. Man Hess über Nacht, d.h. etwa 16 Stunden unter häufigem Rühren mittels eines mechanischen Rührers, der mit einem zyklischen Zeitgeber ausgerüstet war, stehen und filtrierte dann durch Whatman Filterpapier No. 1. Von dem FiItrat gab man 1 ml zu 1 ml der gepufferten Methylzelluloselösung.

Beispiel 4

0,5 ml einer Lösung von Wright's Färbemittel in Methanol mit einem Färbemittelgehalt von etwa 0,17 Gew.% und 0,5 ml Glyzerin p.a. wurden zu 1 ml der gepufferten MethylzelIuloselösung hinzugegeben.

Beispiel 5

Zu 20 ml Ν,Ν-Dimethylformamid gab man langsam unter Rühren 1 g pulverförmigen Giemsa Färbemittels, eines behördlich garantierten, im Handel erhältlichen Produktes, das üblicherweise als eine brauchbare Form der Feststoffe verwendet wird, die in Lösung das Giemsa Färbemittel ergibt. Man liess die Lösung über Nacht, d.h. etwa 16 Stunden unter häufigem Rühren stehen und filtrierte sie dann durch Whatman Filterpapier Nr. 1. Vom FiI-

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trat wurde 1 ml zu 1 ml der gepufferten Methylzelluloselösung hinzugegeben.

In Figur 1 ist ein mikroskopischer Objektträger 10 abgebildet, der eine Blutprobe 12 trägt, die in üblicherteise aufgestrichen und luftgetrocknet ist. Ein dünner Streifen 14 aus einem der vorbeschriebenen fünf Färbemittelformulierungen ist auf die aufgestrichene Probe aufgebracht. Dies kann zweckmässigerweise unter Verwendung einer kleinen Polyäthylenflasche geschehen, die eine Düse ähnlich der einer konventionellen Ölkanne hat. Der Streifen 14 sollte etwas kürzer sein als das Deckplättchen.

Figur 2 zeigt zusätzlich ein Deckplättchen 16, das auf den Streifen 14 aufgebracht werden soll. Ist dies geschehen, dann zieht die Oberflächenspannung der Färbstofformulierung das Deckplättchen auf den Probenaufstrich 12 gegen den mikroskopischen Objektträger 10. Die in der Formulierung des Streifens gelöste Farbe wird zu dem Probenaufstrich 12 übertragen unu färbt diesen an.

In Figur 3 ist das Endergebnis gezeigt. Die mit 18 bezeichnete Masse ist der angefärbte Probenaufstrich 12. Die Formulierung des Streifens 14 ist nun bis zu den Kanten des Deckplättchens 16 ausgebreitet und kapselt die angefärbte Probe 18 ein und hat diese so gegen Zutritt der umgebenden Luft einschliesslich der darin enthaltenden Feuchtigkeit abgedichtet.

Die oben angegebenen fünf Beispiele für Farbstofformulierungen sind bevorzugte Ausführungsformen. Es können jedoch viele andere transparente Harze anstelle des in den Beispielen angegebenen bevorzugten Harzes verwendet werden, ebenso wie eine Anzahl verschiedener Lösungsmittel in verschiedenen Kombinationen für die in den bevorzugten Beispielen verwendeten eingesetzt werden kann. Es gibt einige allgemeine Betrachtungen, die bei der Herstellung anderer Formulierungen in Betracht zu ziehen sind:

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So ist es erforderlich, Formulierungen zu verwenden, welche die angefärbten biologischen Zellen weder sofort noch während einer verhältnismässig langen Zeitdauer bei der Lagerung der fertigen Probe unter langsamen Verdampfen der letzten Spuren flüchtigen Lösungsmittels verformen oder zerstören. Wenn die Wasserkonzentration der Formulierung hoch ist, dann wird auch die Diffusiansgeschwindigkeit in die Zelle üblicherweise hoch sein. Dies führt normalerweise zu einem tieferen Anfärben und somit zu einer grösseren Stabilität der Anfärbung in der Probe, erzeugt jedoch auch einen osmotischen Druck in der Zelle, der sie verformt und sie tatsächlich zum Zerreißen bringen kann. Es ist daher erwünscht, dass die Flüssigkeit in der Formulierung eine Mischung organischer oder nicht-organischer Lösungsmittel mit Wasser ist. Die angegebenen Beispiele liegen im Bereich von 25% Wasser in Nr. 1 bis 100% Wasser in Nr.2 und dl<i übrigen Proben enthalten 50% Wasser.

Beispiel 2 ist eine augenscheinliche Ausnahme von der allgemeinen Regel, denn es ist im Experiment festgestellt worden, dass die Formulierung des Beispiels 2 nicht durch zu grosse Diffusion von Wasser in diese Zellen zerstörerisch auf s,ie wirkt.

nxcht Der Grund für dieses aussergewöhnliche Verhalten ist!bekannt. Die Molekulargewichte der verwendeten Harze scheinen so hoch zu sein, dass sie keine bemerkenswerte Verringerung des Wasserdampf drucken in der Lösung verursachen, es ist jedoch ^vorstellbar, dass die Viskosität der Mischung von Methylzellulose und Polyvinylpyrrolidon ausreicht, dass Eindringen von Wasser in die Zellwünde zu verhindern. Dies ist natürlich eine reine Hypothese.

Harze, wie die Alkylzellulosen, können mit einem weiten Bereich nomineller Viskositäten hergestellt werden. Die nominellen Viskositäten sind üblicherweise die in einem Standardlösungsmittel bei einer Standardgewichtskonzentration der Probe gemessenen Viskositäten.Wenn die Löslichkeit einer gegebenen Probe hoch ist, dann wird sie bei der Standardtestkonzentration eine relativ geringe Viskosität haben. Zur Verwendung in der vorliegen-

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den Erfindung ist eine Formulierungsviskosität erforderlich, die bei dem beschriebenen Verfahren eine geeignete Leistungsfähigkeit gestattet. Eine Formulierung der erforderlichen Viskosität, wenn sie mit einem Harz geringer nomineller Viskosität hergestellt wird,enthält eine höhere Gewichtskonzentration als eine Formulierung der gleichen Viskosität mit einem Harz hoher nomineller Viskosität. Wenn eine solche Formulierung durch Verdampfen der flüchtigen Lösungsmittel trocknet, dann bleiben die Feststoffe zusammen mit den nicht-flüchtigen Lösungsmitteln, die auf dem Kunststoffgebiet als "Weichmacher" bekannt sind , zurück. Wenn ein grosses Gewicht an Feststoffen zurückbleibt, dann nimmt dies ein grösseres Volumen ein als eine kleinere Menge und dies bedingt, dass es beim Trocknen weniger schrumpft. Es ist daher allgemein erwünscht, Harze auszuwählen, die eine relativ geringe nominelle Viskosität haben, damit sie weniger stark schrumpfen und die Zellen der Probe weniger verformen. Aus ähnlichen Gründen ist das Verwenden von Weichmachern, wie von Glyzerin in einigen der Formulierungen, erwünscht, da es das feste Harz flexibel macht.

Es gibt einige grundsätzliche Prinzipien, die bei der Herstellung oder Korrektur von Formulierungen verwendet werden können. Man muss sich daran erinnern, dass beim Anfärben und beim Formulieren von Kunststofflacken oder Zementen empirisch vorgegangen wird und selbst zubereitete Lacke und Farben werden mit Anweisungen zu ihrer Verdünnung geliefert, damit sie für besondere Anwendungsbedingungen geeignet sind. Die bekannten Eigenschaften von Farben, die nach bekannten Verfahren aufgebracht werden, können als erste Annäherung ihrer Eigenschaften benutzt werden, wenn man die in den \gemässen viskosen Kunststoffharzlösungen verwendet. Das Puffern zur Einstellung des pH-Wertes kann unter Verwendung üblicher Puffer geschehen, vergl. Mcllvaine's Puffer, obwohl sie der Bequemlichkeithalber in die Harzlösung eingebracht werden können, zu der der Farbstoff später hinzugegeben wird, wie in Beispiel 1. Im wesentlichen kann die Formulierung einer Färbemittelmischung in einer

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viskosen Flüssigkeit zur Ausführung der vorliegenden Erfindung in folgenden Stufen erfolgen:

1. Das gewünschte Färbemittel wird ausgewählt. Dies hängt vom Anwender der Erfindung ab.

2. Anforderungen hinsichtlich der Konzentrations/pH-Kontrolle und irgendwelche sich daraus ergebenden Anforderungen für Zusätze, wie Puffer, werden festgelegt. Auch diese hängen vom Anwender und der dem Stand der Technik zu entnehmenden Kenntnis der Farben ab.

3. Von Daten über die Löslichkeit der Farbe in verschiedenen Lösungsmitteln wird ein geeignetes Lösungsmittel für die Farbe ausgewählt und die erforderliche Konzentration der Farbe darin zur Erzielung einer erwünschten Endkonzentration in der Endformulierung wird bestimmt.

4. Das Harz wird ausgewählt. Es sollte sehr transparent sein und einen Brechungsindex haben, der dicht genug bei dem des Glases liegt, um Reflexionen an der Grenzfläche mit dem Deckplättchen möglichst gering zu halten. Das Harz sollte auch so löslich wie möglich sein, vorzugsweise in Lösungsmitteln, die in Gegenwart einer massigen Wasserkonzentration verträglich sind (in den angegebenen Beispielen liegt die Wasserkonzentration im Bereich von 25 bis 67 %).

5. Aus den bekannten Daten über die Löslichkeit des Färbemittels und des Harzes in verschiedenen Lösungsmitteln wird bestimmt, welches Lösungsmittel für das Färbemittel und welches für das Harz zu verwenden ist. Es können getrennte Lösungen beider hergestellt und dann in den errechneten Proportionen vermischt werden, um die gewünschte Färbemittelkonzentration zu ergeben und einen Wassergehalt von etwa 50%. Die Viskosität kann eingestellt werden, indem man Lösungsmittel hinzu gibt, die Viskosität zu verringern. Ein vom Kunstharzhersteller empfohlener Weichmacher kann hinzugegeben werden

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vorzugsweise in einer Menge an der oberen Grenze der empfohlenen Konzentration, da es nicht nur erwünscht ist ein Brechen des verfestigten Harzes zu vermeiden sondern auch Spannungen darin.

6. Mit der so erhaltenen Formulierung kann ein Test ausgeführt werden. Ist die Anfärbung zu schwach, dann kann der Wasseranteil vergrössert werden oder man kann die Konzentration des Färbemittels erhöhen.Wenneine erhoffte Differenzierung

nicht erhalten wird, dann sollte man eine pH-Einstellung versuchen. Es muss erkannt werden, dass die hier betrachteten möglichen Probleme im wesentlichen mit den Charakteristika der verwendeten Farbe zu tun haben, wobei ein in der vorliegenden Erfindung verwendetes Färbemittel normalerweise keine besseren Wirkungen haben wird, als wenn es üblicherweise verwendet wird.

Die Oberflächenspannung ist normalerweise kein Problem, da sauberes Glas durch viele Lösungsmittel für transparente Harze benetzt wird. Ist die Oberflächenspannung nur am Rande angemessen, dann wird eine Verringerung der Viskosität üblicherweise zu einem Herabziehen des Deckplättchens führen, wie es erforderlich ist.

Während die Zubereitung der angegebenen Formulierungen und ihre Verwendung gemäss den gegebenen Instruktionen im Rahmen der Fähigkeiten eines Technikers im pathologischen Laboratorium liegt, muss erkannt werden, dass die Auswahl neuer Formulierungen mehr die Funktion des forschenden Mikrobiologen ist. Dessen Fähigkeitslevel wird die Herstellung neuer Formulierungen gemäss der Lehre der vorliegenden Erfindung gestatten ebenso wie die Ausführung von Anpassungen, um irgendwelchen auftretenden Schwierigkeiten abzuhelfen. Während die Zahl der als biologische Färbemittel verwendeten Farben klein ist verglichen mit der Zahl der bekannten synthetischen Farben, ist die Zahl der transparenten synthetischen Harze sehr gross, so dass es

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nicht möglich ist, spezifische Formulierungen für alle anzugeben.

Einige Harze, die mit positiven Ergebnissen untersucht worden sind, waren Methylzellulose, AthylzeHulose, Carboxymethylzellulose, Hydroxyäthylzellulose und Hydroxypropylzellulose. Polyoxyäthylen-Produkte, die hauptsächlich als nicht-ionische oberflächenaktive Mittel verwendet werden, sind auch mit positiven Ergebnissen als suspendierend einkapselnde Harze verwendet worden.

Die mit positiven Ergebnissen getesteten Hauptlösungsmittel waren Wasser, Dimethylformamid, Glutaraldehyd, Methylalkohol, Äthylalkohol, Benzol, Toluol, Äthylacetat und Äthylendichlorid.

Die verwendeten Färbungsmittel waren Methylenblau NN, Cresylviolettacetat, Giemsa-Färbungsmittel, Wright-Färbungsmittel, May-Grundwald-Färbungsmittel, MacNeal-Tetrachrom-Färbungsmittel, Methylgrün, Pyronin Y und Jenner's-Färbungsmittel.

Verwendete Weichmacher waren Glyzerin, Polyvinylpyrrolidon, Äthylendiamintetraacetessigsäure und Glutaraldehyd.

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Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zum Anfärben und Versiegeln einer auf einen mikroskopischen Objektträger aufgebrachten und luftgetrockneten biologischen Probe gekennzeichnet durch folgende Stufen:

a) Herstellen einer viskosen flüssigen Formulierung eines transparenten Harzes und eines biologischen Färbungsmittels in einer Wasser enthaltenden Lösungsmittelmischung,

b) Aufbringen einer Menge der viskosen flüssigen Formulierung auf einen Bereich des Objektträgers, der kleiner ist als die Fläche eines Deckplättchens,

c) Aufbringen des Deckplättchens auf die aufgebrachte Menge der viskosen flüssigen Formulierung auf dem Objektträger,

d) das Deckplättchen ungestört auf der flüssigen Formu-r lierung und dem Objektträger belassen, damit die Oberflächenspannung der Flüssigkeit das Deckplättchen gegen die Probe und den Objektträger ziehen kann, wodurch die flüssige Formulierung über die Teile der Probe und den Objektträger ausgebreitet wird, die von dem Deckplättchen abgedeckt sind und die in der flüssigen Formulierung gelöste Farbe in Berührung mit der Probe gebracht wird und diese anfärbt.

2. Viskose flüssige Formulierung zum gleichzeitigen Anfärben und Versiegeln einer biologischen Probe, die sich auf einem mikroskopischen Objektträger befindet, mit einem Deckplättchen, gekennzeichnet durch :

a) ein transparentes Harz,

b) ein biologisches Färbemittel und

c) ein Wasser umfassendes Lösungsmittel.

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3. Formulierung nach Anspruch 2,dadurch gekennzeichnet , dass das transparente Harz eine Zelluloseverbindung ist.

4. Formulierung nach Anspruch 2,dadurch gekennzeichnet , dass das Lösungsmittel von 25 bis 50 Vol.% Wasser umfasst.

5. Formulierung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , dass das Lösungsmittel einen Weichmacher für das transparente Harz umfasst.

6. Formulierung nach Anspruch 2,dadurch gekennzeichnet , dass das transparente Harz

a) Hydroxypropyimethylzellulose,

b) das biologische Färbemittel Wright^fs Färbemittel,

c) das Lösungsmittel N,N-Dimethy!formamid, Wasser und Glyzerin ist,

die in folgende Proportionen vorliegen:

zwei Volumenteile Ν,Ν-Dimethylformamid die pro Milliliter des Dimethylformamid 50 mg Hydroxypropymethylzellulose mit einer nominellen Viskosität von 15 Centipoise enthalten,

ein Volumenteil Wasser, das pro Milliliter 50 Milligramm pulverförmiges Wright's Färbemittel enthält und
ein Volumenteil Glyzerin p.a.

7. Formulierung nach Anspruch 2, dadurch g e kennzeichnet , dass

a) das transparente Harz eine Mischung von Hydroxypropyimethylzellulose und Polyvinylpyrrolidon,

b) das biologische Färbemittel Wright 's Färbemittel und

c) das Lösungsmittel im wesentlichen Wasser ist,
wobei folgende Proportionen vorliegen:

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vier Volumenteile Mellvaine's Standardpufferlösung, die pro Milliliter 100 Milligramm Hydroxypropylmethylzellulose mit einer nominellen Viskosität von 15 Centipoise gelöst enthält,

ein Volumenteil einer wässrigen Lösung mit 40 Milligramm Polyvinylpyrrolidon mit einem Molekulargewicht von etwa 44.000 pro Milliliter und ein Teil einer wässrigen Lösung mit 50 Milligramm pulver förmigem Wright 's Färbemittel pro Milliliter.

8. Formulierung nach Anspruch 2,dadurch g e kennze ichnet , dass das transparente Harz

a) Hydroxypropylmethylzellulose,

b) das biologische Färbemittel Wright's Färbemittel,

c) das Lösungsmittel Ν,Ν-Dimethylformamid und Wasser ist,

wobei folgende Proportionen vorliegen: ein Volumenteil Mcllvaine's Standardpufferlösung, die pro Milliliter 100 Milligramm Hydroxypropylmethylzellulose mit einer nominellen Viskosität von 15 Centipoise gelöst enthält und

ein Volumenteil aus Ν,Ν-Dimethylformamid, das pro Milliliter 50 Milligramm pulverförmiges Wright's Färbemittel enthält.

9. Formulierung nach Anspruch 2,dadurch gekennzeichnet , dass

a) das transparente Harz Hydroxypropylmethylzellulose,

b) das biologische Färbemittel Wright's Färbemittel,

c) das Lösungsmittel Methanol,GLyzerin und Wasser ist, wobei folgende Proportionen vorliegen:

zwei Volumenteile Mcllvaine's Standardpufferlösung, in der pro Milliliter 100 Milligramm Hydroxypropylmethylzellulose mit einer nominellen Viskosität von 15 Centipoise gelöst sind,

ein Volumenteil einer 0,17 Gew.%igen Lösung von Wright's Färbemittel in Methanol, und

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- 17 ein Volumenteil Glyzerin p.a.

10. Formulierung nach Anspruch 2,dadurch gekennzeichnet , dass

a) das transparente Harz Hydroxypropylmethylzellulose,

b) das biologische Färbemittel Giemsa-Färbemittel,

c) das Lösungsmittel Ν,Ν-Dimethylformamid und Wasser ist,

ein Volumenteil Ν,Ν-Dimethylformamid, das pro Milliliter 50 Milligramm des pulverförmigen Giemsa-Färbemittels enthält.

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