DE2719286C2

DE2719286C2 - Verfahren zur Entnahme von Harnproben und zur Bestimmung von Harn-Metaboliten und Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens

Info

Publication number: DE2719286C2
Application number: DE2719286A
Authority: DE
Inventors: Philippe Tomblaine Gauntley; Jean-Lois Cuinzier Loire Magadur; Georges Dombasle Morel
Original assignee: Institut National De Recherche Et De Securite Pour La Prevention Des Accidents Du Travail Et Des Maladies Professionnelles Inrs Paris Fr
Current assignee: Institut National De Recherche Et De Securite Pour La Prevention Des Accidents Du Travail Et Des Maladies Professionnelles Inrs Paris Fr
Priority date: 1976-04-29
Filing date: 1977-04-29
Publication date: 1982-10-07
Also published as: FR2385377B2; DE2719286A1; FR2385377A2; SE7704921L; JPS52148196A; GB1553455A; CA1084395A; US4159193A

Description

Ι'ί Erfindung, wie sie in den Ansprüchen .^kennzeichnet Ist. liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Entnahme von Marnprohcn und /ur Bestimmung Min Ilarn-Metabollten sowie eine Vorrichtung zur Durehtührung dieses Verfahrens anzugeben, durch das bzw. die die Bindung des gesuchten Metaboliien an ilen Träger verbessert und eine genaue Angabe der Menge des mit dem Träger entnommenen Flams möglich Ist.

Damit die Bestimmung des oder der gesuchten Metiiboliten weder durch eine Variation der entnommenen Harnmenge, beispielsweise durch eine Variation der Papierqualität, mich vor allem durch tile mehr oder «eiliger große Verdünnung des Harn« verfälscht wird die Verdünnung stellt einen Faktor dar. dessen Große beispielsweise von der Tageszeit, zu der die Probe entnommen wurde, und von der Menge der eingenommenen Cietriinke sehr stark abhängt -. wird erfindungsgemäß also das Resultat der quantitativen Bestimmung des oder

Tabelle Il

tiven Bestimmung eines Metaboliten ausgedrückt, dessen Abscheidung zeitlich konstant ist.

Im Falle eines lonenaustauscherharz.es aus einem Styrol-Polymerisal als Matrix und Sull'onsäuregruppen besteht die Aktivierung, die erfindjr.äsgemäß durchgeführt wird, darin, daß man das Harz In eine stärkere saure Form überführt, nämlich in die NH₁'- oder H-Form.

Zu diesem Zweck bringt man das Ionenausiauscherharz mit einer die entsprechenden Ionen abgebenden Verbindung in Berührung, wie beispielsweise NH₄(MI oder ITCI.

In der 11"-Form bindet ein Katinnenaustausi.herharz aus einem Styrol-Polymerisat als Matrix mit Sulfonsüuregruppen die ALA sehr viel besser als in der Na'-Form. Das ergibt sich aus den nachstehend in Tabelle I wieder-Begebenen Ergebnissen. Die diesen Eigenschaften zugrundeliegenden Versuche bestanden darin. Streifen des Papiers SA2 in der II -Form und der nicht aktivierten Na"-Form mit 100 μΙ einer ALA-Lösung zu tränken. Dabei betrug die Konzentration an ALA 40 mg/Liter mit einer Beigabe von 1.6 mg/Liter stark radioaktiven ALA^-S M25 600 Zerfälle pro Minute). Danach werden die derart getränkten Streifen zweimal gewaschen.

I abe	■Me I	<>.3 ') 2	Verlust I W₁IS,	bei .hen	Verlust 2 Wjs_t	hei :hen	Gesamt \erlust	0.08 4.3	50
AI Λ			1 -O. 2° - 1	I	16 -	0.02 1 4	i .38 ± 45 -
Il NV	gebunden
16"- 115-

Die Versuche haben gezeigt, daß zur Durchführung des Verfahrens im Rahmen der quantitativen Bestinier ALA ;s ■. .",-zuziehen

aus einem Styrol-

Pnlvmerisut mit Sulfonsäuregruppen bestehende Kationenaustauscherharz in der Weise zu aktivieren, daß es in der H'-Form vorliegt.

Die Resultate, die zeigen, daß die NH/-Form noch to weniger ALA bindet als die nicht aktivierte Nx-Form. sind in der Tabelle II dargestellt.

Die an das aktivierte Kationenaustjuscherharz gebunden:·^ nicht erwünschten Meiaboüten werden durch ■Aif-.ierholtis Waschen in Wasser unter L'mrühr-°.n entferni. beispielsweise durch zweiniiiiiJi-s je H< Minuten dauerndes Waschen. Danach -.vird d.s K.uionenaustauscherharz getrocknet.

Streifen mit	aktivierte I ormen	nicht
Slhll-Gruppen		aktiv ierte
enthaltendem	NH₄- II·	fnrm
Slvml-Polvmerlsai		Na-
gctrilnkt

Gebundene Menge KMK KHK 100'»,

Verlust 8.V\. . H) K _t 0.1 .1(K + 4

bei I. Waschen

Verlust \2% + 2 0.4<\, + 0.04 2 K f 3

bei 2. Waschen

zurückbleibender 5λ. - 0.6 ^l>8(. + Il -I¹K · 5

Rest Im Eluat

Man desorbiert anschließend die Al A. indem man das Kationenaustauscherharz in Koniakt mit einem sauren Puffer bringt. Die quantitative Bestimmung tier ALA orfnlpι y.in/ allgemein durch die Verwendung der mit dem Ehrllch-Reagens erhaltenen Farbreaktion unter den vorstehend erläuterten Bedingungen

Ls wurden bereits verschiedene Methoden zur quantitativen Bestimmung der ALA in Urin vorgeschlagen. Es handelt sich zum einen um Methoden, die denen von Mauzerall und Granlck nahestehen, und zum anderen um Methoden, die jenen von Grabecki ähnlich sind.

Was die quantitative Bestimmung der ΛΙΑ betrifft, befriedigt nur eine einzige Methode voll: Ls ist das von tier Methode nach Grabecki abgeleitete Verfahren mit internem Standard. Diese Methode wird allerdings direkt auf die Urinprobe und nicht auf ein Eluat von Harnmctaboliten angewendet.

Die Anmelderin hat sich deshalb darum bemüht, diese Methode so zu entwlcklen. daß sie für den speziellen Fall der quantitativen Bestimmung von ALA geeigne; ist, die von dem aktivierten lonenaustauscherharz desorbiert ist. Zu diesem Zweck wird die optische Dichte des in der Ehrlich-Reaktlon entstandenen Farbkomplexes unter Berücksi. htlgung der optischen Dichte einer Vergleichsprobe, die ohne Zusatz von Acetylaceton allein das Ehrlich-Reagens enthält, an einer Elchkurve der ALA Im Wasser abgelesen, die mittels eines aktivierten Ioncnaustauscherharzes quantitativ bestimmt wurde. Die aufgrund der optischen Dichte der Verglelchsprobe erhaltene Korrektor erlaubt es, den Reaktionen Rechnung zu tragen, die zwischen dem Ehrlich-Reagens und anderen, beim Auswaschen nicht eliminierien Verbindungen als dem aus der ALA gebildeten Pyrrol erfolgen.

Im übrigen beseitigt das Ablesen in einer in Wasser aufgestellten Standard-Meßkurve, die mittels des aktivierten Ionenaustauscherharzes geeicht wurde, die Gefahr von Fehlern, die mit diesem verbunden sind. Die Genauigkeit der Bestimmung beträgt + 5%.

In einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist das Material, mit dem das Papier beschichtet ist. ein durch Dehydratisierung aktiviertes Kieselgel.

Man verwendet ein derartiges Papier beispielsweise zur quantitativen Bestimmung der Trichloressigsäure und des mit Glucuronsäure konjugierten Trichloräthanols, wobei diese Harnmetaboliten eine Vergiftung durch Trichlorethylen anzeigen.

Die Wahl eines derartigen immobilisierenden Papiers zur Durchführung der quantitativen Bestimmung auf diesem Papier wurde in der Weise durchgeführt, daß verschiedene im Flandel vorhandene immobilisierende Papiere Fixierungsversuchen unterworfen wurden, indem man sich mit 14 C markierter Trichloressigsäure bediente.

Die Eigenschaften des mil Kiesekel bcM hiilHolen l'apleres ergeben sich aus der !tilgenden l'ahelle III In dieser Tabelle sind !tilgende Punkte angegeben

al die Art der Viaschlö.sung für den Papierstreilen nach seinem Eintauchen in eine markierte Trlchloressigsiiurc enthaltende Lösung und dem Trocknen.

b) der Verlust an markierter Trlchloressiusiiure in Proze.'i.-in bei jeder Wäsche, bezogen auf die /urückbehiiilene Menge.

el die Art der Flulerungslösung und

ti) den Prozentsatz der am Ende eluicrtn'i Trichloressigsäure. beziigen aiii tile zurückbehaltene Menge

Es Ist schriftlich, daß das Waschen nicht mit Wasser, sondern mit einem unpolaren I ösungsmllel erfolgt ('ychlohexan liefert befriedigende Ergebnisse.

Vordem Gebrauch wird das mit Kleselgcl beschichtete Papier durch Dehydratisierung (Fntwässerungl aktiviert.

Die liuanlltatKe Bestimmung der Trichloressigsäure und des ! r!ch!'j:Uh;iiy.)!s in '.!e:;; F.! ι:¹.! erfolg! mich 'Jem Verfahren von Ogata und Mitarbeitern.

Dieses Verfahren besteht darin, daß in einem ersten Schritt das konjugierte Trlchloräihanol hydrolysiert wird In einem zweiten Schritt läßt man die Trichloressigsäure und das in Freiheit gesetzte Trichloriithanol mit Pyridin in alkalischem Medium unter Erwärmen reagieren. Fs stellt sich eine rot-orange Färbung ein. Die kalorimetrische Messung hei zwei verschiedenen Wellenlängen ergibt mit Hilfe von Eichkunen die Konzentration an Trichloressigsäure und an Trichloräthanol.

Tabelle .11

Waschlos ιιηκ

Mit Kieselgel

beschlihteles Papier
Hen/ol C'vdohex.in

	(I
1.7",	0
I ',	0
Wasser	Phosphat-
oder	p u Her
Phosphai-
p u Der
93',	98",

Verlust an TCV I Waschen
im Verhältnis zur 2. Waschen
zurückgehaltenen 3. Waschen
Menge in "■
EluiionsMsunu

Eluiertes TCA ") im Verhältnis
zur zurückgehaltenen
Menge in '»

-M TCA = Trichloressiüsaure

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht es ferner, das im Harn enthaltene Kreatinin zu bestimmen.

Bekanntlich dient die quantitative Bestimmung des Kreatinins. dessen Abscheidung über den Tag hin im wesentlichen konstant ist. zur Bestimmung der Verdünnung des Urins und im Hinblick auf diese Verdünnung zur Korrektur der bei anderen am Harn durchgeführten quantitativen Analysen erhaltenen Ergebnisse. Es ist insbesondere üblich, die Menge an ALA in Milligramm ALA pro Gramm Kreatinin anzugeben (Standardisierung des Resultats).

In dem vorliegenden Fall bietet diese Standardisierung darüber hinaus den Vorteil, die möglichen Fehlerquellen zu eliminieren, die mit der Verwendung eines immobilisierenden Papiers als Mittel zur Probenentnahme und daher mit dem Fehlen einer exakten Messung der Menge der entnommenen Probe verbunden sind.

Das erfindungsgemäße Verfahren bietet den Vorteil, daß es gleichzeitig die Entnahme des oder der gesuchten Meicihnllton Im Harn (Al.Λ oder Trichloressigsäure und Konjugiertes Trlchloräthaiiol) und des Kreatinins Im Harn in einem einzigen Arbeitsvorgang auf dem gleichen immobilisierenden träger ermöglicht.

Das aktivierte Material, auf dem die llarnmctabolHcn und tlas Kreatinin gleichzeitig fixiert werden, wird gewaschen, gclrocknel und eluiert. wie dies vorstehend beschrieben wurde. Ein ganzzahligcr Bruchteil des Eluats wird daraufhin zur Bestimmung des oder der gesuchten llarnmetabolltcn und ein anderer Teil zur Bestimmung des Kreatinins verwendet. Schließlich wird das für den oder die gesuchten Melaboliteii erhaltene Resultat auf das für das Kreatinin erhaltene Resultat bezogen.

Wie im Falle der ALA kann man zur Entnahme und zum Fixieren des Krealinins als lonenaustauscherharz ein Slyrol-Polymerlsat mit Sullonsäuregruppen in der II"-l-'orm verwenden, das zufriedenstellende! arbeitet als die Ml₁--Form. Dies ergibt sich aus Tabelle IV.

label le IV

100",	100".-	10()\.
56,55	4.8	68 5
16.5	3.8	16 s.
26.8	91.4	15.4

MiYiIiTi mit SOiM-Cirup- aktivierte l^:ormen nicht akti-

pen LTiIh,iltenilcm Stsrol- \ icrie

Polymerisat Mlj' II· l-orm

netriinkt Na^-

Gebundene Menge
Verlust hei I. Waschen
Verlust bei 2 Waschen
zurückbleibender Rest
im Fluat

Das aktivierte Harz, an dem das Kreatinin fixiert ist. wird in der gleichen, bereits für die Bestimmung der ALA beschriebenen Weise weiter behandelt: Das Harz wird mehrere Maie unter Umrühren in Wasser gewaschen und sodann getrocknet, wonach die Desorption durch Kontakt mit einer sauren Pufferlösung erfolgt.

Die Bestimmung des Krealinins erfolgt nach dem Verfahren von Jaffe. das darin besteht, daß man das Kreatinin in wäßrig-alkalischem Medium mit einer Lösung von Natriumpikrat reagieren läßt, um einen farbigen Komplex zu bilden, der dann durch Kolorimetrie quantitativ bestimmt wird.

Im speziellen Fall der quantitativen Bestimmung des aus einem lonenaustauscherharz eluierten Kreatinins muß in jedem Fall die Wirkung des sauren Puffers neutralisiert werden, der zur vorhergehenden Desorption des Kreatinins oder gleichzeitig zur Zuführung der für die Reaktion nach Jaffe benötigten Reagenzien dient. Erfolgt eine solche Neutralisation nicht, reicht die Menge der Base, deren Zusatz gemäß der Reaktion von Jaffe vorgesehen ist. nicht aus, um den pH-Wert des Mediums in den alkalischen Bereich zu verschieben. Die Reaktion findet nicht statt.

In dem Fall der Bestimmung der ALA wird die optische Dichte der Reaktion nach Jaffe korrigiert, indem man die optische Dichte einer Vergleichsprobe mit in die Rechnung einbezieht, für weiche die Menge des Eluates durch eine entsprechende Menge Wasser ersetzt wurde. Man liest den Wert ab. der auf einer Eichkurve des Kreatinins in Wasser gefunden ur4 mittels des aktivierten IonenaustauscherHarzes bestimmt wurde.

Für die Entnahme und Flxiewng des Kreatinins kann man auch ebensogut ein mit Kieselgel beschichtetes Papier verwenden.

Das Kreatinin wird dann in der gleichen Weise eluiert. wie dies für die Trichloressigsäure und das Trichloräthi-

nol beschrieben wurde, und nach dem vorstehend erläuterten Verfahren von Jaffe bestimmt.

Zur Erläuterung der Erfindung werden Im folgenden zwei Durchführungsbeispiele des erfindungsgemäßen Verfahrens beschrieben.

Beispiel 1

Untersuchung iuf das Vorliegen einer Bleivergiftung.

Im Rahmen dieses Beispiels wird die Erfindung anhand der beigefügten Flg. 1 und 2 erläutert, wobei die Fig. 1 eine Exploslonsdarstellur.g einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung vor deren Zusammenbau und die Flg. 2 einen Längsschnitt durch die gleiche Vorrichtung nach deren Zusammenbau zeigt

In den Flg. 1 und 2 erkennt man, daß die Vorrichtung ein Rohr 1 aufweist, das an einem seiner Enden durch einen Boden 2 verschlossen Ist und an seinem anderen Ende 3 offen Ist. Das offene Ende 3 kann mit einem hohlen Stopfen oder Stöpsel 4 dicht verschlossen werden, der mit einer Griffzunge 5 versehen Ist. In einem Hohlraum 6 des Stöpsels 4 kann ein aus elastischem Material hergestelltes Klemmelement 7 einrasten, das In zwei Teilstücke 8o und Hb unterteilt Ist. Diese beiden Teilstücke 8(7 und Sb sind durch eine MalerlalbrUcke 9 miteinander verbunden und begrenzen zwischen sich einen Spalt 10. Da das Klemmelement 7 aus einem elastischen Matrial gefertigt Ist, Ist es möglich, die Ränder des Spaltes 10 auseinanderzubiegen und In den Spalt 10 ein Ende eines Papierstreifens 11 einzuführen. Wenn sich der Papierstreifen 11 In dem Spalt 10 an seinem richtigen Platz befindet, wird das Klemmelement 7 In den Hohlraum 6 des Stöpsels eingeführt. Dort wird es durch Anlage eines an seinem Umfang ausgebildeten Flansches 12 an einer an der Innenfläche des Stöpsels 4 ausgebildeten entsprechenden Schulter 13 festgelegt. Man sieht, daß damit der Papierstrelfen 11 an dem Stopfen 4 befestigt Ist.

Der Papierstreifen 11 besteht beispielsweise aus Papier SA₂. Dieses Papier ist mit einem Ionenaustauscherharz Imprägniert, das aus einem Styrol-Polymerisat als Matrix und Sulfonsäuregruppen besteht, wobei das Ionenaustauscherharz In der erfindungsgemäßen Welse aktiviert ist.

Zu diesem Zweck wird der mit dem nicht aktivierten lonenaustauscherharz Imprägnierte Papierstreifen 15 Minuten In eine mit zweifach destilliertem Wasser hergestellte Salzsäure getaucht, die in Zeltabständen umgerührt wird. Danach wird der Streifen in zweifach destilliertem Wasser solange gewaschen, bis man den ursprünglichen pH-Wert des zweifach destillierten Wassers wieder erhält, und danach an der Luft unter Ausschluß von Licht und alkalisch reagierenden Dämpfen getrocknet.

Der Papierstreifen 11 weist eine Markierung auf, beispielsweise einen nicht dargestellten Strich, In dessen Höhe der Papierstreifen am Schluß abgeschnitten wird. Wie man leicht erkennt, ermöglicht die Markierung es, den Papierstreifen immer in der gleichen Länge abzuschneiden und deshalb stets mit der gleichen Menge an Ionenaustauscherharz zu arbeiten.

In das Rohr wird eine dehydratisierend wirkende Tablette 14 eingesetzt, die beispielsweise aus einem aktivierten Kieselgel hergestellt Ist, das einen Farbindikator zur Anzeige des Sättigungsgrades (Wassergehalts) einschließt. Diese Tablette wird durch ein Halteorgan 15 an ihrem Platz gehalten, das unter Druck in das Rohr eingepreßt wird.

Vor Gebrauch zeigt sich die Vorrichtung in der in Fig. 2 dargestellten Form. Die Vorrichtung v,ird in der folgenden Weise verwendet:

Probenentnahme

Die Bedienungsperson, die die Vorrichtung In einer lichtundurchlässigen Verpackung verpackt erhält, zieht

% die Vorrichtung aus der Verpackung und nimmt den Stöpsel 4 von dem Rohr 1 ab. wobei sie den Stöpsel 4 an der Griffzunge 5 erfaßt. Damit zieht sie den Papierstreifen 11 aus dem Rohr 1 heraus. Danach taucht die Bedienungsperson den Papierstrelfen während etwa einer

ίο Sekunde In den Urin, streift den Papierstreifen an der Wand des Uringefäßes ab und führt Ihn wieder In das Rohr 1 ein, Indem sie dieses gleichzeitig verschließt.

Während dieser Maßnahmen Ist es ratsam, den Papierstreifen nicht grellem Licht (direkte Sonneneinstrahlung,

i> Licht einer Leuchtstofflampe) auszusetzen. Ebenso Ist die Anwesenheit von ammoniakhaltlgep Dämpfen In der Umgebungsluft zu vermelden, da diese Dämpfe geeignet sind, die Fixierung oder Konservierung der /u bestimmenden Substanzen zu beeinträchtigen. Die Bedlenungsperson steckt danach die vollständige Vorrichtung in einen zu diesem Zweck vorgesehenen und auf geeignete Welse gekennzeichneten Umschlag, wie er etwa verwendet wird, um fotografische Filme an Entwicklungslaboratorien zu schicken. Dann wird dieser Umschlag per Post

2") versandt.

Wie man sieht, sind diese Maßnahmen einfach und schnell durchführbar und erfodern nicht die Teilnahme von speziell qualifiziertem Personal. Aus diesem Grunde ist das Entnahmeverfahren sehr gut zur Entnahme von

M) Proben bei einer Gruppe geeignet, beispielsweise anläßlich einer Untersuchung In einer Fabrik.

Nach der Probenentnahme wird der Papierstreifen In dem Rohr aufbewahrt, wo er unter der dehydratlslerenden Wirkung der Tablette 14 vollständig trocknet. Der

S) Papierstrelfen 11 kann in dieser Welse mehrere Tage ohne Schaden aufbewahrt werden, womit das Problem eines gleichzeitigen Eintreffens einer großen Anzahl von Proben im Labor gelöst 1st.

Untersuchung im Labor

Für die Analyse wird das Rohr 1 geöffnet und der Papierstreifen auf der Höhe der Markierung abgeschnitten. Der Rest wird aufbewahrt, um gegebenenfalls eine Kontrolle durchführen zu können. Danach wird der abgeschnittene Abschnitt des Papierstreifens In destilliertem Wasser gewaschen.
Nach dieser Waschstufe wird der abgeschnittene Teil des Papierstreifens in eine Schale mit 5 ml zweifach destilliertem Wasser gelegt und die Schale auf eine Unterlage gesetzt, die auf eine sanfte und unregelmäßige Welse bewegt wird. Nach 10 Minuten Benetzungszeit wird das Wasser in der Schale durch eine neue Füllung von 5 ml zweifach destilliertem Wasser ersetzt und die Befeuchtung während 10 Minuten unter Bewegung der Schale wiederholt.

Diese längeren und wiederholten Waschungen führen schließlich zur Eliminierung der meisten Substanzen, die

co möglicherweise bei den Endbestimmungen stören können.

Schließlich wird der Papierstreifen an der Luft getrocknet und dann während 10 Minuten unter Abschirmung des Lichtes In 5 ml eines 1 m Acetatpuffers vom pH-Wert 4,6 getaucht. Dieser Verfahrensschritt bewirkt die Desorption der an das Harz gebundenen Metabollten. Das durch diese Behandlung erhaltene Eluat wird für die Bestimmung der ALA und des Kreatinlns verwendet.

Quantitative Bestimmung der ALA

In ein erstes Probenrohr werden 25 μΙ Acetylaceton . ngefüllt. Da.s Probenrohr wird im Wasserbad 20 Minuten auf 100"C erwärmt. Es bildet sich ein Pyrrol. Dann läßt man das Probenrohr auf Umgebungstemperatur abkühlen und gibt darauf 1 ml Ehrlich-Reagens zu. Es stellt sich eine charakteristische rote Färbung ein.

In einem zweiten Probenrohr wiederholt man die gleiche Operation, jedoch wird das Acetylaceton durch eine entsprechende Menge Wasser ersetzt. Dieses Probenrohr dient als Vergleichsprobe, die eine Korrektur einer even tuell auftretenden Färbung ermöglicht, die auf einer Reaktion des Ehrlich-Reagens mit anderen Substanzen als dem von eier ALA gebildeten Pyrrol beruht. Bei einer Wellenlänge von 546 Nanometern wird das Kolorimeter für die Vergleichsprobe (zweites Probenrohr) auf Null eingestellt. Dann wird die optische Dichte des Inhaltes des ersten Probenrohres gemessen. Diese möge beispielsweise 0,268 betragen.

Um den Fehlerquellen Rechnung zu tragen, die möglicherweise mit dem lonenaustauscherharz und dem Papier des Streifens verbunden sind, wird eine Korrektur durchgeführt. Indem man das gefundene Resultat auf einer In Wasser erhaltenen Elchkurve abliest. Diese Kurve wird auf folgende Weise erhalten:

Es wird eine Reihe von wäßrigen ALA-Lösungen mit steigenden Konzentrationen hergestellt, und zwar ausgehend von einer Lösung mit 2 mg/100 ml in Schritten von 2 mg/100 ml. Danach führt man eine Probenentnahme mittels der Papierstreifen durch, als ob es sich um Urin handeln würde. Die Papierstreifen werden danach der gleichen vorstehend beschriebenen Behandlung unterworfen, d. h. dem Waschen, der Desorption, der Umsetzung mit Ehrlich-Reagens und der Messung der der jeweiligen Konzentration an ALA entsprechenden optischen Dichte gegenüber einer Vergleichsprobe. Die gefundenen Werte ermöglichen es. die in der Flg. 3 dargestellte Kurve aufzustellen. Die für eine Probe gefundene optische Dichte, also beispielsweise 0.268, int- -»o - Trichloressigsäure, spricht nach der in Wasser ermittelten Eichkurve einem - Trlchloräthanol und ALA-Gehalt von 20 mg ALA/Liter.

Resultat auf einer In W&sser erhaltenen Elchkurve sbgelesen wird. Diese Kurve wird in der gleichen Weise erhalten wie die Eichkuive für die ALA und Ist In der Fig. 4 dargestellt. Die vorstehend gemessene optische Dichte entspricht einem Kreatlnin-Gehalt von 2 g/Llter. Der Veiglelch der Ergebnisse (20 mg ALA/Llter und 2 g Kreatinln/Llter) erlaubt den Schluß, daß der Harn der untersuchten Person 10 mg ALA/g Kreatinin enthielt.

Beispiel 2

Untersuchung auf Trlchloräthylen-Verglftung. In diesem Falle verwendet man ein mit Kieselgel beschichtetes Papier, das wie das in Beispiel 1 beschriebene mit lcnenaustauscherharz beschichtete Papier verpackt Ist. Die Aktivierung des Kieselgels erfolgt durch die dehydratlslerend wirkende Tablette 14, die zur Trocknung drs Papierstreifens nach dem Eintauchen In den Urin und dem Abstreifen des Papierstreifens dient.

Die entnahme der Urir.proben erfolgt !n der gleichen Welse wie die anläßlich der Bestimmung der ALA beschriebene Probenentnahme.

Untersuchung Im Labor

Nach dem Öffnen des Rohres, in das der Papierstrelfen nach der Probenentnahme eingeführt wurde, wird der Papierstreifen in Höhe der Markierung abgeschnitten und der abgeschnittene Teil gewaschen. Dabei wird wie im Beispiel 1 vorgeganger. jedoch wird anstelle von Wasser Cyclohexan verwendet.

Nachdem die unerwünschten Metaboliten auf dieser Weise eliminiert worden sind, wird der Teilabschnitt des Papierstreifens an der Luft getrocknet und danach wahrend 10 Minuten In 5 ml Wasser oder einen 0.2 M Phosphatpuffer (pH 6) eingetaucht. Diese Maßnahme führt zur Freisetzung de¹ am Kieselgel adsorbierten Metaboliten. Das durch die Behandlung erhaltene Eluat wird dazu verwendet, um folgende Substanzen quantitativ zu bestimmen

- Kreatinin.

Bestimmung des Kreatinlns

In ein erstes Eppendorf-Rohr werden drei Tropfen -15 20%iger Natronlauge (20 g/100 ml) und 1 ml Eluat gegeben. Die Lösung wird 30 Sekunden lang umgerührt, um den Acetatpuffer zu neutralisieren, der zur Desorption diente.

Bestimmung der Trichloressigsäure und des Trichloräthanols

In ein erstes P/obenrohr werden 200 μΐ des Elu.ites und 10 μΐ /i-Glucuronidase (750 Fishman-Einheiten) gegeben. Man erwärmt das Probenrohr 40 Minuten auf 37° C. um das konjugierte Trichloräthanol zu hydrolysieren.

Danach werden 200 μΐ gesättigte Pikrinsäure zugege- 50 Danach werden 200 μ! 50%iger Natronlauge sowie 1 ml

ben und schließlich 100 ml 7%lge Natronlauge. Die Mischung wird 30 Sekunden lang umgerührt, um eine gute Durchmischung zu erreichen, und 20 Minuten im Dunkeln stehengelassen. Es entwickelt sich eine orange Färbung.

In einem zweiten Eppendorf-Rohr wird eine Vergleichslösung hergestellt, indem man In der vorstehend beschriebenen Weise vorgeht, dabei aber die 200 μΐ Eluat durch 200 μΐ destilliertes Wasser ersetzt.

Pyrldln In das Probenrohr gegeben und Jleses 5 Minuten auf 95⁰C erhitzt.

Es entwickelt sich eine rot-orange Färbung. Nach dem Abkühlen werden 800 ml der Pyridinschicht und 400 μΐ Wasser zugefügt.

Es werden zwei Messungen im Kolorimeter durchgeführt, die eine bei 436 Nanometer zur Messung der Konzentration an Trichlorähtanol und die andere bei Nanometer zur Messung der Konzentration an Trichlor-

BeI einer~WelIenlänge von 546 nm wird das Kolorlme- 60 essigsäure. Die Ergebnisse werden anhand von Eichkurter für die Verglelchsprobe (zweites Probenrohr) auf Null ven abgelesen.

eingestellt und danach die optische Dichte des Inhaltes Zur Ermittlung der Elchkurven werden eine Reihe von

des ersten Probenrohres gemessen. Diese betrage bei- Lösungen präpariert, die 100, 300, 500 und 1000 mg/1 spielsweise 0,459. Essigsäure und Trlchloräthanol enthalten (es wäre natür-

Um die mit dem Ionenaustauscherharz und dem 65 Hch exakter, von konjugiertem Trichloräthanol auszuge-Papier des Fapierstreifens verbundenen Fehlerquellen hen, jedoch !st diese Verbindung in dieser Form nicht auszuschließen, führt man, wie im Falle der ALA, eine verfügbar. Man Ist deshalb darauf angewiesen, freies Korrektur durch, indem das vorstehend gefundene Trlchloräthanol zu verwenden).

zur Ermittlung der Eichkurve für die Trichloressigsüure wird aus jeder der Lösungen der Lösu.igsreihe mittels eines Papierstreifens eine Lösung entnommen, der mit jenem für die Urinprobenentnahme identisch ist. Dieser Papierstreifen wird auch in der gleichen Weise behandelt wie jenei Tur Entnahme der Urinprobe.

Die Eichkurve für ilao Trichluräthanol wird in ähnlicher Weise ermittelt, jedoch werden vorher die Lösungen mit den Konzentrationen 100. 300, 500 und 100Γ) mg/1 in der gleichen Weise verdünnt, wie dies durch den Papierstreifen bewirkt wird.

Diese beiden Eichkurven erlauben die Feststellung, daß eine versuchsweise untersuchte Urinprobe, für welche man eine optische Dichte von 0,280 bei 436 Nanometern und eine optische Dichte von 0.4 bei 546 Nanometern gefunden hat. eine Konzentration an Trichloräthanol von 500 ml/1 und eine Konzentration an Trichloressigsäure von 300 mg/Liter enthält.

Bestimmung des Kreatinins

Die Bestimmung des Kreatinins erfolgt in der gleichen Weise wie im Beispiel 1.

In ein erstes Probenrohr werden 200 μΙ des Eluate-, eingefüllt, danach 100 μ! 7%lge Natronlauge und 500 μΙ gesättigte Pikrinsäure in Wasser. Diese Mischung wird 3( Sekunüea umgerührt und 20 Minuten stehengelassen. E; entwickelt sich eine organe Färbung. In einem zweiter Probenrohr präpariert man eine Vergleichsreaktionslö sung. Die Messung der optischen Dichte erfolgt bei 54( Nanometern, indem man das Kolorimeter für die Ver gleic'.isprobe auf Null einstellt.

Für dieselbe, auch für die Bestimmung der Trichlor essigsäure und des Trichloräthanols verwendete Urin probe venvendet man eine optische Dichte von 0,41, wa: unier Bezug auf eine vorher aufgestellte Eichkurve eine Konzentration von 2 g/Liter entspricht.

Standardisierung der Ergebnisse

Der Vergleich der Resultate (500 mg/Liter Trichlor äthanol bzw. 300 mg/Liter Trichloressigsäure, 2 g/Lite Kreatinin) erlaubt den Schluß, daß der Urin der unter suchten Person 250 mg Trichloräthanol/g Kreatinin un< 150 g Trichloressigsäure/g Kreatinin enthielt.

Das erlindungsgemäße Verfahren gestattet es, eini große Anzahl von Proben unter günstigeren Bedingun gen zu untersuchen, was insbesondere die Aufbewahruni der Proben, die Genauigkeit der Ergebnisse oder dii Kosten !ür die Untersuchung anbelangt.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Entnahme von Harnproben und zur Bestimmung von Harn-Metaboliten durch Bindung derselben an einen Immobilisierenden Träger, der aus einem Papier besteht, das mit einem Material beschichtet Ist, das in der Lage ist, die Metaboliten zu binden, bei dem der Träger zur Entnahme einer Probe und zur Bindung des gesuchten Metaboliten zusammen mit unerwOnschten Metaboliten mit dem Harn In Berührung gebracht wird, der beladene Träger zu einem Labor transportiert wird, die unerwünschten Metaboliten, die die Bestimmung des gesuchten Meta- is bellten stören können, von dem Träger entfernt werden, und der gesuchte Metabolit elulert und bestimmt wird, dadurch gekennzeichnet, daß das Material, mit dem das Papier beschichtet ist, ein Ionenaustauscherharz aus einem Styrol-Polymerlsat In der NH₄ ⁺- oder H "-Form oder ein durch Dehydratisierung aktiviertes Kieselgel ist, und daß neben dem gesuchten Metaboliten als Verhältnisgröße ein weiterer Metabolit bestimmt wird, dessen Abscheidung im wesentlichen immer konstant 1st.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger die Fc;rm eines Papierstreifens hat, den man In den Harn eintaucht.

3. Verfahren nach Anspruch I oder 2 zur quantitativen Bestimmung von delta-Aminolävullnsäure (ALA), gekennzeichnet durch folgende Verfahrensschritte: Entnahme einer Harnprobe mittels eines Papierstreifens, der mit olnem ,-'ationenaustauschharz beschichtet 1st, das aus e'nem Styrol-Polymerlsat als Matrix mit Sulfonsäuregrupper in der H*-Form besteht, Trocknen des Papierstreifens, Waschen des Papierstreifens zur Eliminierung der unerwünschten Metaboliten, Trocknen des gewaschenen Paplerstrelfens, Elution der gesuchten Metaboliten und Kondensation der ALA mit Acetylaceton zur Bildung eines Pyrrols, Zugabe von Ehrllch-Reagens zur Bildung eines gefärbten Komplexes und dessen quantitative Bestimmung durch Kolorimetrie.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 zur Bestimmung von Kreatinin, gekennzeichnet durch folgende Verfahrensschritte: Entnahme einer Harnprobe mittels eines Papierstreifens, der mit einem Kationenaustauschharz beschichtet Ist, das aus einem Styrol-Polymerlsat als Matrix mit Sulfonsäuregruppen In der H*- Form besteht, Trocknen des Papierstreifens, Waschen des Papierstreifens zur Beseitigung der unerwünschte 1 Metaboliten, Trocknen des gewaschenen Papierstreifens, Elution der gewünschten Metaboliten und Durchführung einer Reaktion des Kreatinin mit einer Natriumpikratlösung In wäßrigalkalischem Medium zur Bildung einer gefärbten Verbindung, die durch Kolorimetrie quantitativ bestimmbar Ist (Reaktion nach Jaife).

5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Ellmlnlerung der unerwünschten Metaboliten durch wiederholtes Waschen In Wasser unter Bewegung des Trägers erfolgt.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Elution In der Weise erfolgt, daß der Träger mit einer sauren Pufferlösung In Berührung gebracht wird.

7. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, zur quantitativen Bestimmung von Trlchlorcsslgsiture In Harn.

gekennzeichnet durch folgende Verfahrensschritte: Entnahme einer Harnprobe mittels eines Papierstreifens, der mit durch Dehydratisierung aktiviertem KIeselgel beschichtet ist. Trocknen des Papierstreifens, Waschen des Papierstreifens unter Verwendung eines unpolaren Lösungsmittels, das zur Eliminierung der unerwünschten Metaboliten geeignet Ist, Trocknen des gewaschenen Papierstreifens, Elution der gesuchten Metaboliten und Durchführung einer "Reaktion des Eluates mit Pyrldin in alkalischem Medium unter Wärmezufuhr, wobei sich eine rot-orange Färbung entwickelt, die durch Kolorimetrie bei einer geeigneten Wellenlänge gemessen wird, wonach das Resultat mit einer Eichkurve verglichen wird.

8. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 zu>· quantitativen Bestimmung von Trlchloräthanol in Harn, das mit Glucuronsäure konjugiert ist, gekennzeichnet durch folgende Verfahrensschritte: Entnahme einer Harnprobe mittels eines Papierstreifens, der ltilt durch Dehydratisierung aktiviertem Kieselgel beschichtet Ist, Trocknen des Papierstreifens, Waschen des Papiersireifens mit einem unpolaren Lösungsmittel, das zur Eliminierung der unerwünschten Metaboliten geeignet Ist, Trocknen des gewaschenen Papierstreifens, Elution der gesuchten Metaboliten, Hydrolyse des konjugierten Trichloräthanols durch /J-Glucuronldase und Durchführung einer Reaktion des hydrolyslerten Eluats mit Pyrldin In alkalischem Medium unter Wärmezufuhr, wobei sich eine Färbung entwlkkelt, die man bei einer geeigneten Wellenlänge kolorimetrisch mißt und mit einer Elchkurve vergleicht.

9. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 zur quantitativen Bestimmung von Trichloressigsäure und Trichloräthanol, das mit Glucuronsäure konjugiert ist, gekennzeichnet durch folgende Verfahrensschritte: Entnahme einer Harnprobe mittels eines Paplerstrelfens, der mit durch Dehydratisierung aktiviertem Kieselgel beschichtet Ist, Trocknen des Papierstreifens, Waschen mit einem unpoiaren Lösungsmittel, das zur Ellmlnlerung der unerwünschten Metaboliten geeignet Ist, Trocknen des gewaschenen Papierstreifens, Elution der gesuchten Metaboliten, Hydrolyse des konjugierten Trichloräthanols mit /J-Glucuronldase und Durchführung einer Reaktion des hydrolyslerten Eluates mit Pyrldin In alkalischem Medium unter Wärmezufuhr, wodurch sich eine rot-orange Färbung entwickelt, die man durch Kolorimetrie bei einer Wellenlänge von 546 Nanometern zur Bestimmung der Trichloressigsäure und unter einer Wellenlänge von 436 Nanometern zur Bestimmung des Trlchloäthanols mißt.

10. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 zur quantitativen Bestimmung von Kreatinin, gekennzeichnet durch folgende Verfahrensschritte: Entnahme einer Harnprobe mittels eines Papierstreifens, der mit durch Dehydratisierung aktiviertem Kleselgel beschichtet Ist, Trocknen des Papierstreifens, Waschen des Paplerstrelfens mittels eines unpolaren Lösungsmittels, das zur Ellmlnlerung der unerwünschten Metaboliten geeignet Ist, Trocknen des gewaschenen Papierstreifens, Elution der gesuchten Metaboliten und Durchführung einer Reaktion des Eluates In wäßrigaklallschem Medium mit Natrlumplkratlösung. wodurch sich eine orange Färbung entwickelt, die man kolorimetrisch bei einer geeigneten Wellenlänge mißt und mit einer Elchkurve vergleicht.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß zum Waschen des

Paplerstrelfesn Cyclohexan oder Benzol verwendet wird.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 111, dadurch gekennzeichnet, daß zur Elutlon der gesuchten MetaboHten Wasser oder ein Phosphatpuffer verwendet wird.

13. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Verhältnisgröße Kreatinin bestimmt wird.

14. Verfahret nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß ALA und Kreatinin in zwei Fraktionen des gleichen Eluates gemessen werden.

15. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß Trichloressigsäure und Trichloräthanol einerseits und Kreatinin andererseits in zwei Fraktionen desselben Eluates gemessen werden.

16. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 15, gekennzeichnet durch:

a) ein Rohr (1), das an einem Ende (2) geschlossen und am anderen Ende (3) offen 1st,

b) einen Stopfen (4), der ram dichten Verschließen des offenen Endes (3) des Rohres (1) ausgebildet 1st,

c) einen mit einem Ionenaustauscherharz aus einem Styrol-Polymerisat In der NH,*- oder H⁺-Form oder mit einem durch Dehydratisierung aktivierten Kieselgel beschichteten Papierstrelfen (11) zum Einführen In das Rohr (1), und

d) Mittel 7,109 zur Befestigung des Paplerrtrelfens (11) andern Stopfen (4).

17. Vorrichtung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß das Rohr (1) ein Halteorgan (15) zum Festhalten einer eine Dehydratisierung bewirkenden Masse am Boden (2) des Rohres (1) aufweist.

18. Vorrichtung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die eine Dehydratisierung bewirkende Masse In Form einer Tablette (14) aus aktiviertem Kieselgel vorliegt, das einen farbigen Indikator zur Anzeige der Sättigung einschließt.

19. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 29 bis 33, dadurch gekennzeichnet, daß der Stopfen (4) hohl ausgebildet 1st, daß die Mittel zur Befestigung des Papierstreifens von einem aus elastischem Material hergestellten Klemmelement (7) zum Einsatz In den Hohlraum (6) des Stopfens (4) gebildet sind und daß das Klemmelement (7) in einer die Längsachse des Rohres (1) enthaltenden Ebene einen Spalt (10) aufweist, der das Klemmelement (7) praktisch In zvrel nur durch eine Materlaibrücke (9) verbundene Teile (8fl, 8ö) unterteilt, wobei der Spalt (10) zur Aufnahme eines Endes des Papierstreifens (11) auseinanderspreizbar 1st und zum Festhalten des Papierstreifen (11) schließbar ist, wenn das aus elastischem Material bestehende Klemmelement (7) In den Hohlraum (6) des Stopfens (4) eingesetzt wird.

20. Vorrichtung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß der Spalt (10) von geschlossenen Wänden begrenzt Ist.

21. Vorrichtung nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die geschlossenen Wände Vorsprünge aufweisen.

22. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 16 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß der Stopfen (4) mit einem Grlffelerhent (S) versehen Ist.

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Entnahme von Harnproben und zur Bestimmung von Harn-Metabollten nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1 sowie auf eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens.

Bekanntlich stoßen medizinische Reihenuntersuchungen, die beispielsweise in einer Fabrik zur Feststellung von Berufskrankheiten durchgeführt werden, auf zahlreiche Schwierigkeiten. Dazu gehört die Entnahme von

ίο Harnproben, die Konservierung der Proben, Ihr Transport in ein Labor, wo die relativ schwierigen Analysen durchgeführt v/erden können, die gleichzeitige Ankunft einer großen Anzahl von Proben im Labor, das nicht sofort die Gesamtheit der Proben untersuchen kann und seinerseits einen Teil zurückstellen muß, usw.

Um diese Nachtelle zu beseitigen, wurde im speziellen Fall der quantitativen Bestimmung der delta-Aminolävullnsäure, eines charakteristischen MetaboHten bei Bleivergiftungen, von L. Hankin und Mitarbeitein (vgl. CIinlcal Pediatrics, Bd. 9 (1970), Seiten 707 bis 712) vorgeschlagen, die Harnproben am Ort der P-:beentnahme auf einem Träger zu immobilisieren, der aus einem Papier (Nr. SA 2) besieht, das mit einem Kationenaustauscherharz (Styrol-Polymerisat mit Sulfonsäuregruppen In der Na^-Form) beschichtet ist. Das Papier wird kurz in den Harn eingetaucht, getrocknet und Ins Labor gesandt. Nach dem Empfang des Trägers werden im Labor die an dem Kationenaustauscherharz gebundenen Metaboliten mittels eines Acetatpuffers desorbiert. Danach wird eine kolorimetrische Reaktion durchgeführt, welche die quantitative Bestimmung ermöglicht.

Diese Reaktion besteht in der Bildung eines Pyrrols, indem man die delta-Aminolävullnsäure, im folgenden kurz ALA genannt, mit Acetylaceton umsetzt und danach das entstandene Pyrrol mit Ehrllch-Reagens versetzt. Man erhält einen farb'gen Komplex, dessen quantitative Bestimmung durch Kolorimetrie ermöglicht ist. Das Ergebnis läßt sich an einer Eichkurve ablesen, die mit einer Harnstofflösung aufgestellt wurde.

Soweit bekannt Ist, wurde dieses bekannte Verfahren nicht im industriellen Maßstab durchgeführt, was sich durch folgende Gründe erklären läßt.

Die kolorimetrische Reaktion, welche die quantitative Bestimmung ermöglicht, Ist nicht spezifisch für das aus der Reaktion zwischen der ALA und dem Acetylaceton entstandene Pyrrol. Sie wird durch zahlreiche Faktoren beeinflußt, Insbesondere durch die mögliche Anwesenheit von eine positive und/oder negative Ehrlich-Reaktion liefernden Verbindungen sowie durch Harnstoff Im Urin.

Das Verfahren von Hankin trägt zwar dem Harnstoff Rechnung, Indem es ein Ablesen auf einer In einer Harnstofflösutig erhaltenen Elchkurve vorschlägt, aber nicht den unerwünschten Metaboliten, wie den eine positive und negative Ehrllch-Reaktlon liefernden Verbindungen. Es Ist also vor allen notwendig, das Verfahren nach Hankln so zu verbessern, daß die unerwünschten Metaboliten entfernt werden, die die quantitative Bestimmung verfälschen. Die einfachste Lösung scheint hierfür zu sein, das mit Ionei.auslauscherharz beschichtete Papier vor dem Desorbleren der ALA sorgfältig zu waschen.

Die ALA an dem von Hankln verwendeten Träger Ist jedoch nicht genügend fixiert, um eine derartige Waschstufe zuzulassen. Tatsächlich kann das Waschen zu einem Verlust an ALA führen, der 51% der ALA erreichen kann und darüber hinaus nicht einmal konstant 1st. Auch hängt die Menge des entnommenen Harns von der Qualität des verwendeten Papiers ab.