DE2737845A1 - Verfahren zum anfaerben und versiegeln einer biologischen probe, die an einem mikroskopischen objekttraeger haftet und luftgetrocknet ist, insbesondere einer blutprobe - Google Patents

Verfahren zum anfaerben und versiegeln einer biologischen probe, die an einem mikroskopischen objekttraeger haftet und luftgetrocknet ist, insbesondere einer blutprobe

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Description

Verfahren zum Anfärben und Versiegeln einer biologischen Probe, die an einem mikroskopischen Objektträger haftet und luftgetrocknet ist, insbesondere einer Blutprobe.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Anfärben und Versiegeln einer auf einen mikroskopischen Objektträger aufgetragenen und luftgetrockneten biologischen Probe, insbesondere Blutprobe,nach Patentanmeldung P 2635 438.1.
Aus der US-PS 3 389 052 ist bekannt, cytologische Proben in Form von Abstrichen auf einem Objektträger zum Transport in ein pathologisches Laboratorium zu schützen, wobei der Schutzüberzug vor oder als Teil eines üblichen Anfärbeprozesses entfernt wird. In dieser US-PS wird besonders die Anwendung eines
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Aerosol-Sprays vorgeschlagen, um Polyäthylenglycol als Überzug aufzubringen, der während des üblichen Anfärbeprozesses entfernt wird. Es werden in dieser US-PS weiter andere Überzüge des Standes der Technik genannt, die vor dem Anfärben der Probe entfernt werden.
Weiterhin ist aus der US-PS 3 498 8GO der Gebrauch eines Deckplättchens bekannt, das vorher mit einem Klebstoff überzogen worden ist, das beim \ufbringen auf einen mikroskopischen Objektträger, der angefeuchtet ist mit einer gewebesäubernden Flüssigkeit, wie Toluol oder Xylol, ausreichend klebrig und du-.'ch Aufdrücken auf den Objektträger fest damit verbunden wird. Es ist lediglich eine Folgeerscheinung, dass die Probe auf dem Objektträger auch angefärbt worden ist; die durch diese US-PS gegebene Lehre ist ausschliesslich die des mechanischen Befest ige ns des Deckplättchens.
In der US-PS 3 770 477 ist das Überziehen eines mikroskopischen Objektträgers mit einem transparenten Metallfluorid beschrieben, um eine Haftung für eine histologische Probe zu erhalten, wie einen gefrorenen oder Paraffinschnitt. Spezifisch verwendet man eine aufgedampfte Schicht aus Magnesiumfluorid mit einer Dicke, die einem Bruchteil einer Wellenlänge des sichtbaren Lichtes entspricht. Der Vorteil ist, dass die Schicht durch die übliche Gewebebehandlung unbeeinflusst zu bleiben scheint und sie ausserdem kein Kulturmedium ist. Eine Beziehung zum Anfärben ist nicht vorgeschlagen.
In der US-PS 3 678 151 ist die Herstellung leicht abgemessener, geringer Mengen trockener Reagenzien durch Sättigen absorbierender inerter Träger aus faserförmigem Material in Blattform mit einer Lösung bekannter Konzentrationen des Reagenz, die gleichmässig durch den Träger verteilt werden kann und die man dann trocknen lässt, beschrieben. Den Träger kann man dann in Teile zerschneiden und so einen definierten Anteil des Reagenz erhalten. Beispielsweise ergeben 10 Milligramm des Reagenz in Lösung, die über lOO cm2 verteilt sind, 100 Mikrogramm pro cm2
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des Trägers. Eine solche geringe, jedoch genau bestimmte Menge kann in Lösung gewonnen werden, indem man den Trägerteil in ein Lösungsmittel eintaucht. Die Idee des Aufnehmens trockener Reagenzien in einem Trägerstreifen wurde auf ein Verfahren zum Anfärben getrockneter Blutabstriche ausgedehnt. Ein Whatman Filterpapier Nr.1 wurde mit einer methanolischen Lösung von Eosin Y, Methylen-Blau, Azur A und Methylen-Violett gesättigt und getrocknet. Zur Anwendung wurde das getrocknete, die Farbe enthaltende Papier in eine Methylalkohol-Lösung eines Katalysators, wie Propylenglycol oder Chlorophyl eingetaucht.Es wurde dann auf den getrockneten Blutabstrich aufgebracht, 1 bis 3 Sekunden darauf belassen und entfernt. Die angefärbte Oberfläche, üblicherweise ein mikroskopischer Objektträger, wurde dann in einer Pufferlösung gespült und getrocknet. Das Anfärben selbst soll rasch erfolgen, in der Grössenordnung von 20 bis 90 Sekunden. Andere bakteriologische Färbemittel können in ähnlicher Weise aufgebracht werden. In jedem Falle wird der Papierstreifen lediglich als Träger der Farbe benutzt, die in Lösung gebracht werden muss, indem man den Streifen vor der Verwendung anfeuchtet und der Streifen wird von der präparierten Probe entfernt, nachdem er seinen Zweck der Übertragung der Farbmittellösung auf die Probe erfüllt hat.
In der US-PS 3 737 335 ist das Problem behandelt worden, zu verhindern, dass sich Proben, wie die des Diarrhöe-Stuhls, die mit Polyvinylalkohol-Fixativ oder einem ähnlichen Material, wie Äthylzellulose, überzogen sind, durch den Methylalkohol, in den sie beim Anfärben wiederholt eingetaucht werden, von dem Objektträger lösen, an dem sie haften. Dies wurde erreicht durch Eintauchen des Objektträgers vor dem Anfärben in Wasser, Salzlösung, Glycerin, Silanlösung oder Diäthylenglycol. Die Objektträger können auch mit Neopren überzogen werden oder man kann sie vor der Verwendung aufrauhen. Die Lehre nach dieser US-PS ist jedoch nicht auf die Anwendung einer organischen Kunststoffumhüllung als Träger der Farbe oder als Schutz der angefärbten Proben gerichtet; sie betrifft vielmehr den Schutz eines einkapselnden Objektträgers (mount) vor dem Angriff durch die
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nachfolgend aufgebrachte Anfärbelösung.
Aus der US-PS 3 796 594 ist die Bereitung eines vorgefärbten Objektträgers, der eine getrocknete Mischung aus Methylen-Blau NN und Cresylviolettacetat trägt, bekannt. Wird ein Tropfen Blut auf dem Objektträger angeordnet und mit einem Deckplättchen ausgebreitet, dann wird das Blut differenziell in einer Weise angefärbt, dxe sonst zwei getrennte Zubereitungen erforderι. In dem in dieser US-PS genannten "Bulletin of the Johns Hopkins Hospital" Band 34 § 923, Seiten 277-288 beschreibt Sabin sehr kurz einige frühe Arbeiten hinsichtlich der Verwendung vorgefärbter Objektträger.
In der US-PS 3 834 874 ist der Gebrauch der vorgenannten vorgefärbten Objektträger zum Nachweis von Malariaparasiten im Blut beschrieben.
Keine der Druckschrifteu lehrt jedoch den Gebrauch eines getrockneten Färbemittels, das auf einen getrockneten Abstrich als Probe aufgebracht und mittels eines transparenten Trägers, der das Färbemittel auf die Probe auf dem Objektträger überträgt, auf den sie aufgebracht ist, an Ort und Stelle versiegelt wird. Am ähnlichsten hierzu ist vielleicht die Offenbarung der US-PS 3 678 151, doch ist diese !Ähnlichkeit nur oberflächlich, da nach dieser Druckschrift ein überzogenes Papier als bequemer Träger für ein Färbemittel benutzt wird, das vor dem Aufbringen der Farbe auf den getrockneten Abstrich angefeuchtet wird. Nach dem Übertragen der feuchten Farbe auf den Abstrich wird der Träger notwendigerweise entfernt, da er opak ist und in dieser US-PS 3 678 151 ist an keiner Stelle die Möglichkeit der Verwendung eines transparenten Trägers angedeutet.
Noch bedeutsamer ist jedoch, dass nach dem Stande der Technik überall angenommen wird, dass eine feuchte Färbemittellösung nach dem Aufbringen und vor dem Aufbringen der Versiegelungsverbindung abgewaschen werden muss, um das Deckglas festzuhalten. So ist z.B. in der US-PS 3 891 327 in Spalte 11 Zeile 47 ff hinsichtlich des Einkapselnseiner Blutprobe, die mit
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Wright's Färbemittel angefärbt ist, folgendes ausgeführt: "Die angefärbte Probe wurde dann mit Wasser gewaschen und getrocknet", obwohl andere ungefärbte rein botanische Proben nicht als notwendigerweise zu waschen beschrieben wurden. In der US-PS 3 670 072 ist in Spalte 1 Zeilen R9-71 hinsichtlich der Zusammensetzung eines Färbemittels ausgeführt: "... wurde fesι gestellt, dass die Thiocarbamyl-Verbindung den Gebrauch von ordinärem Leitungswasser als Spülmittel ermöglicht ...". In der US-PS 2 992 971 ist die Dispersion von Standardfärbemitteln in gewissen Zellulose-Derivaten als bequemem Verdünnungsmittel zur Erleichterung der Messung und Handhabung und die Lösung der Dispersion in üblichen Farblösungsmitteln zur Herstellung eines Färbemittels beschrieben. Es ist in dieser zuletzt genannten US-PS jedoch nicht ausgeführt, dass diese besonderen Färbemittelzusammensetzungen es unnötig machen, die überschüssige Farblösung abzuwaschen, was auch später nicht erkannt worden ist.
Zusammenfassung der Erfindung:
Auf eine biologische Probe, z.B. von Blut als einem luftgetrockneten, auf einen Standard-Glasmikroskopobjektträger aufgebrachten Abstrich, der in der konventionellen Weise hergestellt ist, wurde aus einer flexiblen Flasche, die mit einer Düse oder einer ähnlichen Ausgabevorrichtung versehen war, ein Streifen oder Wulst aus einer viskosen flüssigen Formulierung aufgebracht, die in Lösung ein transparentes Harz, wie Methylzellulose, enthielt. Ein Deckglas, dessen eine Seite mit dem gewünschten Färbemittel überzogen war, wurde über dem Objektträger angeordnet, indem man seine überzogene Seite in Kontakt mit dem Streifen aus der viskosen Formulierung brachte. Die Oberflächenspannung der viskosen Flüssigkeit zog das Deckplättchen gegen den Objektträger und den darauf befindlichen Abstrich und breitete so die Flüssigkeit über den Teil des Objektträgers aus, der sich unter dem Deckglas befand. Gleichzeitig damit wurde der Überzug aus Färbemittel auf dem Deckglas durch die Flüssigkeit entfernt und zur Probe übertragen.
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Die Probe wurde durch das in der Flüssigkeit vorhandene Färbemittel rasch angefärbt. Die flüchtigen Lösungsmittel in der viskosen Flüssigkeit verdampften und Hessen das transparente Harz lest als eine transparente Einkapselung zurück, welche das Deckplfittchen fest auf dem Objektträger hielt und die Probe von der umgebenden Atmosphäre abdichtete. Anfärben und Abdichten werden so in einem einzigen Arbeitsgang ausgeführt und dabei sehr viel Bedienungspersonalzeit gespart.
Da der Begriff "Anfärben" zahlreiche Bedeutungen hat, erscheint es wünschenswert, darauf hinzuweisen, dass dieser Begriff in der vorliegenden Anmeldung insbesondere ein intrazelluloses Anfärben bezeichnet, wie es in den US-PS 3 79Ω 594 und 3 834 874 beschrieben ist.
Das erfindungsgemässe Verfahren unterscheidet sich von dem Verfahren nach der US-PS 3 785 594 dadurch, dass es das Aufbringen des Färbemittels in Lösung in einem Mittel zum Versiegeln vorschlägt, das an Ort und Stelle verbleibt und nicht abgewaschen wird. Der Gebrauch der Lösung zum Versiegeln als Lösungsmittel für das Färbemittel unterscheidet das erfindungsgemässe Verfahren vom gesamten der Anmelderin bekannten Stand der Technik.
Wegen seiner Einfachheit empfiehlt sich das erfindungsgemässe Verfahren für solche Anwendungen, in denen verschiedene Färbemittel zu unvorhersehbar langen Zeitintervallen erforderlich sind; denn Deckplättchen, die mit verschiedenen Färbemitteln überzogen sind, können zusammen mit einem einzigen Ausgeber für die viskose Flüssigkeit leicht zur Verfügung gehalten werden. Die ausserordentlich geringe Dicke der Deckplättchen erfordert einige Sorgfalt bei der Bestimmung, welche Seite des Deckplättchens das Färbungsmittel trägt. Es ist daher wünschenswert, den Behälter für die Deckplättchen so zu markieren, dass dies die Orientierung der Deckplättchen anzeigt. Es ist auch möglich, einige Markierungen vorzusehen, wie einen sehr kleinen Tropfen eines opaken Lacks, an einer äusseren Kante der nicht überzogenen Seite des Deckplättchens.
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Die Zeichnung zeigt in
Figur 1 einen mikroskopischen Objektträger mit einer getrockneten Probe darauf sowie einen Streifen der viskosen Formulierung auf der Probe,
Figur 2 den mikroskopischen Objektträger der Figur 1 mit einem Deckplättchen, das mit einem Färbemittel überzogen ist, in der richtigen Lage, um auf dem Objektträger angeordnet zu werden, und
Figur 3 den mikroskopischen Objektträger und das Deckplättchen der Figur 2, nachdem das Deckplättchen in Berührung mit der viskosen Formulierung gebracht und auf den Objektträger und die getrocknete Probe gezogen worden ist.
In der zu beschreibenden Ausführungsform ist das Färbemittel als getrockneter überzug auf ein Deckplättchen aufgebracht. Die Zubereitung vorgefärbter Deckplättchen zum Blutfärben kann im wesentlichen in Übereinstimmung mit den Lehren der US-PS 3 796 951I erfolgen. Hierzu werden 2 Gramm des neuen Methylenblau N, Farbindex Nr. 52030, in 25 ml absolutem Methanol p.a. durch gründliches Vermischen gelöst, und dann läßt man das Oanze über Nacht, d. h. etwa l6 Stunden, stehen. Danach filtriert man die Lösung durch Whatman-Filterpapier Nr. 1. Ein Gramm Cresylviolettacetat, behördlich garantiert, wird in 25 ml absolutem Methanol p.a. durch gründliches Vermischen aufgelöst und ebenfalls über Nacht, d. h. etwa 16 Stunden, stehengelassen und danach durch Whatman-Filterpapier Nr. 1 filtriert.
Zu einem Milliliter der neuen Methylenblau N Lösung gab nan mit einer Pasteur-Pipette 13 Tropfen der Cresylviolettacetat-Lösung (die normale Kalibrierung der Paeteur-Pipette ist derart, daß 20 Tropfen Wasser 1 ml ergeben j für die Methanollösung wird «ich die Kalibrierung jedoch davon unterscheiden). Die beiden Lösungen wurden durch Schütteln in dem Probengläschen, in dem sie angeord net worden sind, vermischt und die erhaltene Überzugslösung wurde
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in eine 1 ml fassende Spritze überführt, die mit einer 0,66 mm-Nadel versehen war. Die Spritze wurde in einem Halter angeordnet und ihre mit Gewinde versehene Kolbenschraube gedreht, bis an der Nadelspitze kleine Tropfen der Überzugslösung erschienen. Ein sauberes Glasdeckplättchen wurde mit der Nadel in Berührung gebracht und so der hängende Tropfen von Überzugs lösung darauf aufgebracht. Das Deckplättchen wurde dann auf einer flachen Oberfläche angeordnet und die Kante eines anderen Deckplättchens, das etwa vertikal dazu gehalten wurde, über das erstgenannte Deckplättchen gezogen und so ein gleichmäßiger überzug aus der Überzugslösung auf dem ersten Deckplättchen erzeugt. Den überzug lieft man dann bei Raumtemperatur trocknen. Auf diese Weise hat man ein vorgefärbtea Deckplättchen erhalten.
In der obengenannten US-PS sind andere Verfahren zum Zubereiten vorgefärbter Deckträger offenbart, für die eine Kombination von Methylenazur und Methylenblau NN, Methylenblau NN allein, Cresylviolett allein und Toluidinblau allein verwendet wurden.
Pur die Ausführung der Erfindung ist es auch erforderlich, eine geeignete viskose Lösung eines transparenten Harzes zu schaffen. Die folgenden drei Formulierungen viskoser Harzlösungen haben sich als gleichermaßen zufriedenstellend erwiesen.
Formulierung I
Zu 82,35 ml 0,2 molalem Dinatriumorthophosphat (Na2HPO.) wurden 17,65 ml 0,177 molaler Zitronensäure (CgHgO7) hinzugegeben (diese Kombination ist als Mcllvaine's Standardpuffer bekannt) und auf 90 bis 95 0C erhitzt (in den angegebenen Proportionen erzeugt dieser Puffer etwa einen neutralen pH-Wert, und Bezugnahmen auf den Mcllvaine Standardpuffer in der vorliegenden Anmeldung bedeuten die Verwendung einer Lösung im wesentlichen dieser Proportionen). Zu dieser heißen Lösung wurde unter starkem Rühren mit einen Glasstab 10 g Hydroxypropylmethylcellulose mit einer nominellen Viskosität von 15 Centipoise hinzugegeben. Die MethyleelIuIöse löst sich beim Abkühlen der Pufferlösung langsam auf. Nach Ab-
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schließen des LösungsVorganges gab man zu einem Milliliter der erhaltenen Lösung 1 ml einer Mischung gleicher Teile Wasser und Glyzerin p.a. Diese Endmischung war eine geeignete Formulierung zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren.
Formulierung II
Zu 100 ml Dim-ethy1formamid wurden langsam unter Rühren 5 g Methylcellulose mit einer nominellen Viskosität von 15 Centipoise hinzugegeben. Zu 1 ml der erhaltenen Lösung gab man 1 ml einer Mischung gleicher Teile Wasser und Glyzerin p.a. Diese Mischung war eine geeignete Formulierung zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren.
Formulierung III
Zu 20 ml einer Mischung gleicher Teile Wasser und Glyzerin p,a, gab man U g Polyvinylpyrrolidon mit einem nominellen Molekulargewicht von U1000, das als Handelprodukt der BOH Chemicals Ltd., Poole, England, erhältlich ist. Die erhaltene Lösung war eine geeignete Formulierung zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren.
In Figur 1 ist ein mikroskopischer Objektträger 10 dargestellt, der eine Blutprobe 12 trägt, die in konventioneller Weise auf den Objektträger aufgestrichen und luftgetrocknet ist. Ein dünner Streifen 14 einer der oben beschriebenen drei Formulierungen wurde dann auf dem Probenabstrich angeordnet. Dies kann bequemer weise mit einer kleinen Polyäthylenflasche erfolgen, die eine Düse ähnlich einer konventionellen ölkannehat. Der Streifen 14 sollte etwiß kürzer sein als das Deckplättchen.
Figur 2 zeigt ein Deckplättchen 16 mit einem Farbüberzug 18 auf seiner Unterseite, der auf den Streifen I1I aufgebracht werden soll. Wenn dies erfolgt ist, zieht die Oberflächenspannung des Streifens 14 das Deckplättchen auf den Probenabstrich 12 gegen den Mikroskopobjektträger 10. Der Farbstoff 18 dringt in die
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Formulierung des Streifens 14 ein und wird zu dem Probenabstrich 12 Übertragen und färbt diesen.
In Figur 3 ist das Endresultat gezeigt. Die Farbe 18 ist als solche nicht mehr vorhanden, und mit 20 ist der angefärbte Probenabstrich 12 bezeichnet. Die Formulierung, die den Streifen 14 bildete, ist nun bis zu den Kanten des Deckplättchens 16 ausgebreitet und kapselt die angefärbte Probe 20 ein und hat diese gegen Eintritt von Umgebungsluft einschliesslich der darin enthaltenen Feuchtigkeit abgedichtet.
Im Falle einer Blutprobe beginnt mit den in diesem bevorzugten Beispiel angegebenen Farben das Anfärben in 2 bis 3 Minuten und wird intensiver in 15 bis 20 Minuten. Diese Anfärbung ist permanent, wie dies auch nach konventionellen Praktiken der Fall ist, wenn man ein Versiegelungsmittel nach dem üblichen Anfärben aufbringt.
Als geeignete Viskositäten für die Formulierung haben sich 500 bis lüOO Centipoise erwiesen, obwohl auch Viskositäten bis zu 3000 Centipoise benutzt wurden. In dem äussersten oberen Bereich ist es manchmal erforderlich, das Deckplättchen manuell nach unten zu drücken, um es innerhalb einer vernünftigen Zeit in die richtige Lage zu bringen.
Eine andere Formulierung, die mit einem Deckgläschen, das mit Gi«msa - Färbemittel überzogen war, getestet wurde, war die
folgende:
15 g Polyvinylpyrrolidon vom Molekulargewicht 360000 15 ml Glycerin
15 ml Methanol
7O ml Wasser.
Mit dieser Formulierung wurde ein befriedigendes Anfärben der roten Blutkörperchen erreicht.
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Claims (5)

  1. Patentansprüche
    Verfahren zum Anfärben und Versiegeln einer biologischen Probe, die auf einem mikroskopischen Objektträger aufgebracht und luftgetrocknet ist, mit den folgenden Stufen:
    a) Herstellen einer viskosen Lösung eines transparenten Harzes in einer Lösungsmittelmischung aus einer organischen Verbindung und Wasser,
    b) Versehen eines Oeckplättchens mit einem überzug eines biologischen Färbemittels auf einer Seite,
    c) Aufbringen einer Menge der viskosen Lösung auf einen Bereich des Objektträgers, der kleiner ist als die Fläche des Deckplättchens,
    d) Anordnen des Deckplättchens auf der viskosen Lösung in einer Weise, dass sich seine farbüberzogene Seite in Kontakt mit der viskosen Lösung befindet und
    e) ungestörtes Belassen des Deckplättchens auf der Lösung, damit die Oberflächenspannung der Flüssigkeit das Deckplättchen gegen die Probe und den Objektträger ziehen kann, wodurch die flüssige Lösung über die Teile der Probe und den Objektträger, die durch da· Deckplättchen abgedeckt sind, ausgebreitet wird, und wodurch das Färbemittel von dem Deckplättchen durch die Lösung aufgenommen und in Berührung mit der Probe gebracht wird und diese anfärbt, nach Patentameldung P 2 635 438.1 ,
    dadurch gekennzeichnet, dass die viskose Lösung eine Viskosität von mehr als 0,5 und weniger
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    ORIGINAL INSPECTED
    als 3 Pa.s (entsprechend mehr als 500 Centipoise und weniger als 3000 Centipoise) aufweist.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die zusätzliche Stufe, dass man die Lösungsmittelmischung aus der Losung verdampfen lässt, wodurch ein Körper festen transparenten Harzes als eine Dichtung zwischen dem mikroskopischen Objektträger und dem Deckplättchen zurückbleibt.
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass die viskose Lösung eines transparenten Harzes in einer Lösungsmittelmischung aus einer organischen Verbindung und Wasser im wesentlichen aus folgenden Bestandteilen besteht:
    1 Volumenteil der Mcllvaine-Standardpufferlösung, in der pro Milliliter 100 Milligramm Hydroxypropylmethylzellulose mit einer nominellen Viskosität von 15 Centipoise gelöst sind, und
    1 Volumenteil einer Mischung gleicher Volumenteile von Wasser und Glyzerin p.a.
  4. 4. Verfahren nach Anspruch 1,dadurch gekennzeichnet , dass die viskose Lösung eines transparenten Harzes in einer aus einer organischen Verbindung und Wasser bestehenden Mischung im wesentlichen aus folgenden Bestandteilen besteht:
    1 Volumenteil Dimethylformamid, in dem pro Milliliter 50 Milligramm Methylzellulose mit einer nominellen Viskosität von 15 Centipoise gelöst sind, und
    1 Volumenteil einer Mischung gleicher Volumenmengen Wasser und Glyzerin p.a.
  5. 5. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet , dass die viskose Lösung eines transpa-
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    renten Harzes in einer Lösungsmittelmischung aus organischer Verbindung und Wasser im wesentlichen aus folgenden Bestandteilen besteht:
    einer Mischung gleicher Volumenteile Wasser und Glyzerin p.a., in der pro Milliliter 200 Milligramm Polyvinylpyrrolidon mit einem nominellen Molekulargewicht von 44 000 gelöst sind.
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