DE102005038737B4

DE102005038737B4 - Zytotoxizitätstestverfahren

Info

Publication number: DE102005038737B4
Application number: DE200510038737
Authority: DE
Inventors: Rainer-B. Dr. Volk
Original assignee: Christian Albrechts Universitaet Kiel
Current assignee: Christian Albrechts Universitaet Kiel
Priority date: 2005-08-16
Filing date: 2005-08-16
Publication date: 2009-01-15
Anticipated expiration: 2025-08-17
Also published as: DE102005038737A1

Abstract

Zytotoxizitätstestverfahren zur quantitativen Bestimmung der toxischen Konzentration einer Substanz unter Verwendung von auf einem Träger (10) kultivierten Prüforganismen (30),
gekennzeichnet durch
Aufbringen wenigstens einer definierten Menge einer zu testenden, in einem definierten Volumen eines Lösungsmittels gelösten Substanz (20A, 20B) an wenigstens einem definierten Ort des Trägers (10),
Verdunsten lassen des Lösungsmittels,
Aufbringen der Prüforganismen (30) auf den Träger (10),
Kultivieren der Prüforganismen (30),
Ermitteln der Vitalität der Prüforganismen (30) an dem wenigstens einen definierten Ort des Trägers (10).

Description

Die Erfindung betrifft ein Zytotoxizitätstestverfahren unter Verwendung von auf einem Träger kultivierten Prüforganismen.
Zytotoxizitätstests finden allgemein eine breite Anwendung in der Forschung und Industrie, beispielsweise im Rahmen der Suche nach neuen biologisch aktiven Verbindungen oder im Rahmen von Schadstoffuntersuchungen.
Zur Identifizierung von toxischen Substanzen in Subtanzgemischen werden beispielsweise dünnschichtchromatographische Verfahren zur Auftrennung der in dem Substanzgemisch enthaltenen Substanzen durchgeführt, wobei das dünnschichtchromatographische Präparat anschließend mit einem Prüforganismus besprüht wird. Dieses Verfahren wird beispielsweise in Volk, R. B., Pohl, P., Blaschek W. (2002) Semiquantitative detection of antialgal acitivities in a TLC plate based bioassay. 50th Annual Congresss of the Society for Medicinal Plant Research, 2002, Barcelona, Spain und in Volk, R. B. Screening of microalgal culture media for the presence of algicidal compounds and isolation and identification of two bioactive compounds, excreted by the cyanobacteria Nostoc insulare and Nodularia harveyana, respectively. J. Appl. Phycol. (2005) 17, 339–347 beschrieben. Dieses Verfahren lässt jedoch nur eine qualitative Beurteilung der Zytotoxizität von Substanzen zu.
Zur quantitativen Beurteilung der Zytotoxizität werden im Wesentlichen zwei verschiedene Verfahren angewendet.
Beim Agarplattendiffusionstest werden Prüforganismen in Form eines gleichmäßigen Rasens auf einem Agarmedium kultiviert. Die Testsubstanzen werden auf den Bakterienrasen appliziert und diffundieren in den Agar hinein. Dabei führen zytotoxische Substanzen lokal um den Applikationsort herum zu einer Abtötung der Prüforganismen.
Der Nachteil dieses Verfahrens liegt darin, dass die Quantifizierung der Substanzwirkung lediglich über das Ausmessen der resultierenden Hemmhöfe erfolgen kann. Da jedoch die Konzentration der Testsubstanz aufgrund der Diffusion in den Agar hinein mit zunehmender Entfernung vom Auftragungsort abnimmt, ist es mit Hilfe dieses Analyseverfahren nicht mög lich, die Minimale Hemmstoffkonzentration (MHK) der antibiotisch wirkenden Substanzen zu ermitteln.
Beim zweiten als Suspensionstest bezeichneten Verfahren werden die Testorganismen in einem geeigneten wässrigen Kulturmedium in Suspension kultiviert und die zu testende Substanz hinzugefügt. In ausreichend hoher Konzentration führt die toxische Substanz zum Abtöten der Prüforganismen, wobei die zytotoxische Wirkung der Substanz gut zu quantifizieren ist, da keine Konzentrationsunterschiede in den einzelnen Volumina (Reagenzgläser, Mikrotiterplatten o. ä.) vorliegen.
Der Suspensionstest eignet sich jedoch nur für hydrophile Testsubstanzen, also Substanzen mit guter Wasserlöslichkeit. Hydrophobe Substanzen müssen nämlich regelmäßig in organischen Lösungsmitteln verabreicht werden, die unter Umständen selbst toxisch für die Prüforganismen sind. So können hydrophobe Substanzen nur sehr eingeschränkt auf ihre Toxizität getestet werden, wobei oftmals Vergleichsuntersuchungen zur Toxizität des reinen Lösungsmittels und des Lösungsmittels mit der darin gelösten Testsubstanz notwendig sind. Insbesondere können über die Toxizität von Substanzen, die in toxisch wirkenden Lösungsmitteln gelöst werden müssen, nur sehr eingeschränkte Aussagen gemacht werden.
Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein einfaches Verfahren zu schaffen, mit dem die Toxizität sowohl hydrophiler als auch hydrophober Substanzen quantitativ bestimmt werden kann.
Die Aufgabe wird gelöst durch ein Zytotoxizitätstestverfahren zur quantitativen Bestimmung der toxischen Konzentration einer Substanz unter Verwendung von auf einem Träger kultivierten Prüforganismen, mit den Schritten: Aufbringen wenigstens einer definierten Menge einer zu testenden, in einem definierten Volumen eines Lösungsmittels gelösten Substanz an wenigstens einem definierten Ort des Trägers, Verdunsten lassen des Lösungsmittels, Aufbringen der Prüforganismen auf den Träger, Kultivieren der Prüforganismen, Ermitteln der Vitalität der Prüforganismen an dem wenigstens einen definierten Ort des Trägers.
Das erfindungsgemäße Verfahren macht sich die Flüchtigkeit von Lösungsmitteln zu eigen, indem eine zu testende Substanz in einem geeigneten Lösungsmittel in definierter Konzentration, d. h. eine definierte Menge der Substanz in einem definierten Volumen des Lösungsmittels, gelöst wird, und anschließend an wenigstens einem definierten Ort eines Trägers aufgetragen wird, wobei man das Lösungsmittel verdunsten lässt.
Der Träger ist so eingerichtet, dass die im Lösungsmittel gelöste Substanz an dem definierten Ort des Trägers verbleibend anhaftet oder in den Träger diffundiert. Gleichzeitig besitzt der Träger günstige Eigenschaften zur Besiedlung bzw. Kultivierung von Prüforganismen. Vorzugsweise kann der Träger aus Kieselgel oder aber aus anderen porösen, feinkörnigen oder auch feinfaserigen Polymeren, Kunststoffen oder Harzen bestehen, die sich bevorzugt auf einer geeigneten Unterlage (z. B. Glas, Metall, Papier etc.) in dünner und gleichmäßiger Schicht haltbar aufbringen lassen.
Das Auftragen der zu testenden Substanz erfolgt vorzugsweise mit Hilfe eines automatischen Auftraggerätes, mit dessen Hilfe sehr genau dosierbare und exakt positionierbare Aufträge möglich sind. Vorzugsweise haben die definierten Orte des Trägers eine kreisrunde, ovale oder rechteckige Form.
Nach dem Verdunsten lassen des Lösungsmittels, z. B. durch Verdunsten lassen bei Raumtemperatur oder durch vorsichtiges Erwärmen des Trägers, wobei das Lösungsmittel vollständig vom Träger entfernt wird und damit keinen Einfluss auf die Bestimmung der Toxizität der zu testenden Substanz ausüben kann, schließt sich das Auftragen und Kultivieren der Prüforganismen an.
Als Prüforganismen kann jede Art von Organismus verwendet werden, wobei bevorzugt einzellige Organismen, insbesondere Bakterien und besonders bevorzugt Cyanobakterien verwendet werden. Cyanobakterien zählen zu den prokaryotischen Organismen, deren Zellwandaufbau dem Zellaufbau der gramnegativen Bakterien ähnelt. Untersuchungen des Erfinders der vorliegenden Erfindung zeigen, dass Substanzen, die für Cyanobakterien toxisch sind, auch antibakterielle Effekte besitzen. Daher stellen diese Organismen in Zytotoxizitätsuntersuchungen eine Alternative zur Verwendung von Bakterien als Prüforganismus dar.
Die Prüforganismen werden bevorzugt gleichmäßig auf den Träger – bzw. auf die auf dem Träger in unterschiedlichen Mengen pro Flächeneinheit befindliche Testsubstanz – aufgetra gen. Erfolgt das Auftragen besonders bevorzugt durch Sprühen einer Prüforganismen enthaltenden Suspension, wird vorher die Zahl der Prüforganismen pro cm² durch vorheriges Auszählen der Prüforganismen in der Suspension bestimmt. Das Besprühen der Träger kann mit Hilfe eines für die Dünnschichtchromatographie handelsüblichen Handsprühgerätes erfolgen.
Die mit den Prüforganismen besprühten Träger werden unter für die Prüforganismen optimalen Kultivierungsbedingungen inkubiert. Unter optimalen Kultivierungsbedingungen sind Cyanobakterien auf einer Kieselgelschicht bis zu 14 Tage überlebensfähig.
Zur Quantifizierung der Toxizität der zu testenden Substanz wird die Aktivität bzw. Vitalität der Prüforganismen herangezogen, die bei aktiven Testsubstanzen von deren Menge pro Flächeneinheit abhängt. Die für Cyanobakterien toxische Konzentration aktiver Substanzen führt innerhalb von 24 Stunden zu einer lokalen Aufhellung der Testorganismen. In den Folgetagen kommt es zu einer Intensivierung des Effektes. Das Absterbender Zellen wird in einer vollkommenen Entfärbung deutlich. In dem beschriebenen Verfahren lässt sich die MHK für Cyanobakterien optisch quantifizieren. In Abhängigkeit von der Konzentration (Menge pro Flächeneinheit) der Testsubstanz wird die MHK aufgrund lokal unterschiedlicher Aufhellung des Trägers sichtbar.
Die Erfindung wird im Folgenden anhand von Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen:
1 eine schematische Schnittansicht durch einen für das erfindungsgemäße Verfahren verwendeten Träger und
2 eine fotografische Abbildung des Ergebnisses zweier Zytotoxizitätstests mit als Prüforganismen verwendeten Cyanobakterien nach einem bevorzugten Ausführungsbeispiel nach der Erfindung.
1 zeigt ein schematische Schnittansicht durch einen Träger in einem Stadium nach Ablauf des erfindungsgemäßen Verfahrens nach einem Ausführungsbeispiel. Auf den Träger 10, der bevorzugt aus Kieselgel besteht und der auf einem den Träger 10 unterstützenden Material 40 (z. B. einer Glasscheibe) aufgebracht sein kann, wurden bereits zu testende Substanzen 20A, 20B an definierten Orten des Trägers 10 und anschließend Prüforganismen 30 aufgebracht. Die an den definierten Orten des Trägers 10 aufgebrachten Substanzen 20A, 20B sind im gezeigten Ausführungsbeispiel in den Träger 10 diffundiert, wobei die Substanz 20A eine andere Substanz als die Substanz 20B oder dieselbe Substanz, bloß in einer anderen Menge darstellen kann.
Deutlich zu erkennen ist, dass die Prüforganismen 30 den Träger 10 im gezeigten Ausführungsbeispiel in einer zusammenhängenden gleichmäßigen Schicht bedecken. Lediglich der definierte Ort, an dem die zu testende Substanz 20A aufgetragen ist, wird von den Prüforganismen 30 ausgespart. Ohne Rücksicht auf das beim Auftragen verwendete Lösungsmittel kann daher eine Aussage über die zytotoxischen Eigenschaften der Substanz 20A im Verhältnis zur Substanz 20B gemacht werden.
2 zeigt eine fotografische Aufsicht auf den Träger aus 1 nach Ablauf des erfindungsgemäßen Verfahrens. Im gezeigten Beispiel wurde der Zytotoxizitätstest auf Kieselgel 60 GF₂₅₄ (G = Gipszusatz; F₂₅₄ = Fluoreszenzindikator) der Firma Merck durchgeführt, welches unter Zuhilfenahme eines Automatic TLC Coater 21602 der Firma CAMAG in einer Schichtdicke von 300 μm auf 20 × 20 cm große Glasplatten gestrichen wurde.
Bei der zu testenden Substanz handelte es sich um das Alkaloid Norharman, als gut wasserlösliches Hydrochlorid (1; obere Testreihen) und als schlecht wasserlösliche freie Base (2; untere Testreihen). Die Konzentrationen der Testlösung wurden derart gewählt, dass beim späteren Auftrag mit dem automatischen Auftragegerät Mengen von 0,5 μg oder sogar Mengen von 0,25 μg dosierbar waren (0,50 mg/ml bzw. 0,25 mg/ml).
Der Substanz-Auftrag erfolgte in 0,25 μg Schritten mit Hilfe eines automatischen Auftraggerätes der Fa. CAMAG (Linomat IV) für die Dünnschichtchromatographie (DC)/Hochleistungsdünnschichtchromatographie (HPTLC). Die Breite der definierten Orte an denen der Auftrag erfolgte betrug 1 cm. Der Abstand der Aufträge betrug ebenfalls 1 cm. Vor dem Aufbringen der Prüforganismen wurde das Lösungsmittel (Methanol) der Testlösungen vollständig verdunstet. Zur Überprüfung der Qualität der Aufträge wurde die Platte nach dem Probenauftrag unter UV-Licht (λ = 254 nm) betrachtet und zu Dokumentationszwecken fotografiert.
Als Prüforganismus diente das Cyanobakterium Spirulina laxissima. Von einer ca. 3 Wochen alten Cyanobakterienkultur wurde die Absorption bei 440 nm bestimmt (1 cm Küvette). Eine Teilmenge wurde durch Zentrifugation und Dekantieren des Überstandes aufkonzentriert, so dass eine theoretische Absorption (440 nm) von 40 resultierte. Durch Auszählen der Zellzahl der Cyanobakterienkultur vor dem Versprühen wurde die Zellzahl pro cm² der DC-Platte bestimmt (> 5 × 10⁶/ml). 15 ml dieser konzentrierten (lebenden) Cyanobakterienkultur wurden mit einem für die DC handelsüblichen Handsprühgerät gleichmäßig auf der 20 × 20 cm Kieselgel-Platte aufgesprüht.
Daraufhin wurden die besprühten DC-Platten in eine feuchte DC-Kammer von passender Größe gestellt (Glaskammer der Fa. CAMAG, innere Maße: (L × H × B) 22 × 21 × 6,5 cm) und unter den Kultivierungsbedingungen der Cyanobakterienkultur, bei 27°C und unter ständiger Belichtung (25–30 μmol m^–2s^–1), aufbewahrt.
Innerhalb von 24 Stunden führte die für Cyanobakterien toxische Konzentrationen der Testsubstanz zu einer lokalen Aufhellung der Prüforganismen. Dieser Effekt intensivierte sich in den folgenden Tagen. In der 2 wurden die minimal toxischen Konzentrationen der Testsubstanz mit einen Kreis markiert. Die minimal toxische Konzentration von Norharman-Hydrochlorid beträgt 2,0 μg, die für die Norharman-Base 1,25 μg.

Claims

Zytotoxizitätstestverfahren zur quantitativen Bestimmung der toxischen Konzentration einer Substanz unter Verwendung von auf einem Träger (10) kultivierten Prüforganismen (30), gekennzeichnet durch Aufbringen wenigstens einer definierten Menge einer zu testenden, in einem definierten Volumen eines Lösungsmittels gelösten Substanz (20A, 20B) an wenigstens einem definierten Ort des Trägers (10), Verdunsten lassen des Lösungsmittels, Aufbringen der Prüforganismen (30) auf den Träger (10), Kultivieren der Prüforganismen (30), Ermitteln der Vitalität der Prüforganismen (30) an dem wenigstens einen definierten Ort des Trägers (10).
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Prüforganismen (30) Cyanobakterien sind.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger (10) aus Kieselgel besteht.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Prüforganismen (30) gleichmäßig auf den Träger (10) aufgebracht werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Prüforganismen (30) durch Sprühen aufgebracht werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der wenigstens eine definierte Ort des Trägers (10) eine kreisrunde, ovale oder rechteckige Form hat.