DE2635438C3

DE2635438C3 - Verfahren zum gleichzeitigen Anfärben und Versiegeln einer auf einen mikroskopischen Objektträger aufgebrachten und luftgetrockneten biologischen Probe

Info

Publication number: DE2635438C3
Application number: DE2635438A
Authority: DE
Inventors: John Auten Abington Pa. Geating (V.St.A.)
Original assignee: General Electric Co
Current assignee: General Electric Co
Priority date: 1975-08-08
Filing date: 1976-08-06
Publication date: 1980-11-27
Also published as: DE2737845C2; DE2635438A1; DE2635438B2; DE2737845A1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum gleichzeitigen Anfärben und Versiegeln einer auf einen mikroskopischen Objektträger aufgebrachten und luftgetrockneten biologischen Probe. Es war bekannt, vergleiche z. B. die US-PS 3 389 052, daß ein Schutz cytologischer Proben erhalten werden kann, wenn man diese Proben in Form von Abstrichen zum Transport in ein pathologisches Laboratorium auf einen Objektträger aufbringt, und vor oder als Teil eines üblichen Anfärbeprozesses ein Schut7-überzug entfernt wird.

Auch der Gebrauch eines Deckplättchens ist bekannt, das vorher mit einem Klebstoff überzogen worden ist, das angefeuchtet mit einer gewebesäubernden Flüssigkeit, wie Toluol oder Xylol, beim Aufbringen auf einen mikroskopischen Objektträger ausreichend klebrig wird und durch Aufdrücken auf den Objektträger fest damit verbunden wird. Die Probe auf dem Objektträger ist üblicherweise angefärbt worden, doch ist eine solche Lehre ausschließlich eine des mechanischen Befestigens des Deckplättchens, vergleiche z. B. US-PS 3498860.

Eine weiter bekannte Technik ist das Überziehen eines mikroskopischen Objektträgers mit einem transparenten Metallfluorid, um eine Haftung für eine histologische Probe zu erhalten, wie einen gefrorenen oder Paraffinschnitt. Bei dieser Technik kann man eine aufgedampfte Schicht aus Magnesiumfluorid mit einer Dicke, die einem Bruchteil einer Wellenlänge des sichtbaren Lichtes entspricht, verwenden. Dei Vorteil einer solchen Technik ist es, daß die Schicht durch die übliche Gewebebehandlung unbeeinflußt zu bleiben scheint und sie außerdem kein Kulturmedium ist. Eine Beziehung zum Anfärben ist nicht vorgeschlagen, vergleiche hierzu US-PS 3770477.

Eine andere Art des Herangehens, die in der Vergangenheit angewendet wurde, ist die Herstellung leicht abgemessener geringer Mengen trockener Reagenzien durch Sättigen absorbierender inerter Träger aus faserförmigem Material in Blattform mit einer Lösung bekannter Konzentrationen des Reagenz, die gleichmäßig durch den Träger verteilt werden kann und die man dann trocknen läßt. Den Träger kann man dann in Teile zerschneiden und so einen definierten Anteil des Reagenz erhalten. 10 mg des Reagenz in Lösung, die über 100 cm² verteilt sind, können somit 100 mg/cm² des Trägers ergeben. Eine solche ge-

bo ringe jedoch genau bestimmte Menge kann in Lösung gewonnen werden, indem man den Trägerteil in ein Lösungsmittel eintaucht. Die Idee des Aufnehmes trockener Reagenzien in einen Trägerstreifen wurde auf ein Verfahren zum Anfärben getrockneter Blutabstriche ausgedehnt. Ein Whatman-Filterpapier Nr. 1 kann mit einer methanolischen Lösung von Eosin Y, Methylen-Blau, Azur A und Methylen-Violett gesättigt und getrocknet werden. Zur Anwendung

das getrocknete, die Farbe enthaltende Papier in eine Methylalkohol-Lösung eines Katalysators, wie Propylenglycol oder Chlorophyll eingetaucht. Sie wird .dann auf den getrockneten Blutabstrich aufgebracht, 3 bis 3 Sekunden darauf gelassen und entfernt. Die angefärbte Oberfläche, üblicherweise ein mikroskopischer Objektträger, wird dann in einer Pufferlösung gespült und getrocknet. Das Anfärben soll rasch erfolgen, in der Größenordnung von 20 bis 90 Sekunden. Andere bakteriologische Färbemittel können in ähnlicher Weise aufgebracht werden. In jedem Falle wird der Papierstreifen lediglich als Träger der Farbe benutzt, die in Lösung gebracht werden muß, indem man den Streifen vor der Verwendung anfeuchtet, und der Streifen wird von der präparierten Probe entfernt, nachdem er seinen Zweck der Übertragung der Farbmittellösung auf die Probe erfüllt hat, vergleiche hierzu die US-PS 3678151.

Im Stand der Technik ist auch das Problem behandelt worden, zu verhindern, daß sich Proben, wie die des Diarrhöe-Stuhls, die mit Polyvinylalkohol-Fixativ oder einem ähnlichen Material wie Äthylzellulose, überzogen sind, durch den Methylakohol, in den sie beim Anfärben wiederholt eingetaucht werden, von dem Objektträger lösen, an dem sie haften. Dies ■wurde erreicht durch Eintauchen des Objektträgers vor dem Anfärben in Wasser, Salzlösung, Glycerin oder Diäthylenglycol. Die Objektträger können auch mit Neopren überzogen werden oder man kann sie vor der Verwendung aufrauhen. Diese Technik ist jedoch auf die Verwendung einer organischen Kunststoffumhüllung als Träger der Farbe oder als Schutz der angefärbten Proben gerichtet, und er betrifft den Schutz einer eingekapselten Probe vor dem Angriff durch die später aufgebrachte Anfärbelösung, vergleiche US-PS 3737335.

Im Stand der Technik ist auch die Zubereitung eines vorgefärbten Objektträgers, der eine getrocknete Mischung Methylen-Blau NN und Cresylviolettacetat trägt, bekannt. Wird ein Tropfen Blut auf dem Objektträger angeordnet und mit einem Deckplättchen ausgebreitet, dann wird das Blut differenziell in einer Weise angefärbt, die sonst zwei getrennte Zubereitungen erfordert, vergleiche US-PS 3796594.

Schließlich war es auch bekannt, vorgefärbte Objektträger wie die vorbeschriebenen zum Nachweis von Malariaparasiten im Blut zu verwenden, vergleiche US-PS 3834874.

Der Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, das Verfahren der eingangs genannten Art dahingehend zu verbessern, daß ein mit Färbemittel versehenes Deckplättchen mittels einer viskosen Lösung auf dem mit der biologischen Probe versehenen Objektträger versiegelt wird.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die im kennzeichnenden Teil des Anspruchs 1 enthaltenen Merkmale gelöst.

Bei der Ausführung der Erfindung wird auf eine biologische Probe, z. B. von Blut als einem luftgetrockneten, auf einen Standardglas-Mikroskopobjektträger aufgebrachten Abstrich, der in der konventionellen Weise herg-^ici:. ist, aus einer flexiblen Flasche, die mit einer Düse oder einer ähnlichen Ausgabevorrichtung versehen war, ein Streifen oder Wulst aus einer viskosen flüssigen Formulierung aufgebracht, die in Lösung ein transparentes Harz, wie Methylcellulose, enthält. Ein Deckglas, dessen eine Seite mit dem gewünschten Färbemittel überzogen ist, wird

über dem Objektträger angeordnet, indem man seine überzogene Seite in Kontakt mit dem Streifen aus der viskosen Formulierung bringt. Die Oberflächenspannung der viskosen Flüssigkeit zieht das Deckplättchen gegen den Objektträger und den darauf befindlichen Abstrich und breitet so die Flüssigkeit über den Teil des Objektträgers aus, der sich unter dem Deckglas befindet. Gleichzeitig damit wird der Überzug aus Färbemittel auf dem Deckglas durch die Flüssigkeit entfernt und zur Probe übertragen. Die Probe wird durch das in die Flüssigkeit übergegangene Färbemittel rasch angefärbt. Die flüchtigen Lösungsmittel in der viskosen Flüssigkeit verdampfen und lassen das transparente Harz fest als eine transparente Einkapseiung zurück, welche das Deckplättchen fest auf dem Objektträger hält und die Probe von der umgebenden Atmosphäre abdichtet. Das Anfärben und Abdichten werden so in einem einzigen Arbeitsgang ausgeführt und dabei sehr viel Bedienungspersonenzeit gespart.

Wegen seiner Einfachheit empfiehlt sich das erfindungsgemäße Verfahren für solche Anwendungen, in denen verschiedene Färbemittel zu unvorhersehbar langen Zeitintervallen erforderlich sind; denn Deckplättchen, die mit verschiedenen Färbemitteln überzogen sind, können zusammen mit einem einzigen Ausgeber für die viskose Flüssigkeit leicht zur Verfügung gehalten werden. Die außerordentlich geringe Dicke der Deckplättchen erfordert einige Sorgfalt bei der Bestimmung, welche Seite des Deckplättchens das Färbemittel trägt. Es ist daher wünschenswert, den Behälter für die Deckplättchen so zu markieren, daß dies die Orientierung der Deckplättchen anzeigt. Es ist auch möglich, einige Markierungen vorzusehen, wie einen sehr kleinen Tropfen eines opaken Lacks, an einer äußeren Kante der nicht überzogenen Seite des Deckplättchens.

Weitere vorteilhafte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens finden sich in den Unteransprüchen.

Die Zeichnung zeigt in

Fig. 1 einen mikroskopischen Objektträger mit einer getrockneten Probe darauf sowie einen Streifen der viskosen Formulierung auf der Probe,

Fig. 2 den mikroskopischen Objektträger der Fig. 1 mit einem Deckplättchen, das mit einem Färbemittel überzogen ist, in der richtigen Lage, um auf dem Objektträger angeordnet zu werden, und

Fig. 3 den mikroskopischen Objektträger und das Deckplättchen der Fig. 2, nachdem das Deckplättchen in Berührung mit der viskosen Formulierung gebracht und auf den Objektträger und die getrocknete Probe gezogen worden ist.

In der zu beschreibenden Ausführungsform ist das Färbemittel als getrockneter Überzug auf ein Deckplättchen aufgebracht. Hierzu werden 2 Gramm des neuen Methylenblau N, Farbindex Nr. 52030, in 25 ml absolutem Methanol p. a. durch gründliches Vermischen gelöst, und dann läßt man cias Ganze über Nacht, d. h. etwa 16 Stunden, stehen. Danach filtriert man die Lösung durch Whatman-Filterpapier Nr. 1. Ein Gramm Cresylviolettacetat, behördlich garantiert, wird in 25 ml absolutem Methanol p. a. durch gründliches Vermischen aufgelöst und ebenfalls über Nacht, d. h. etwa 16 Stunden, stehengelassen und danach durch Whatman-Filterpapier Nr. 1 filtriert.

Zu einem Milliliter der neuen Methylenblau N-Lösung gab man mit einer Pasteuer-Pipette 13 Tropfen der Cresylviolettacetat-Lösung (die normale Kali-

brierung der Pasteur-Pipette ist derart, daß 20 Tropfen Wasser 1 ml ergeben; für die Methanollösung wird sich die Kalibrierung jedoch davon unterscheiden). Die beiden Lösungen wurden durch Schütteln in dem Probengläschen, in dem sie angeordnet worden sind, vermischt und die erhaltene Überzugslösung wurde in eine 1 ml fassende Spritze überführt, die mit einer 0,66-mm-NadeI versehen war. Die Spritze wurde in einem Halter angeordnet und ihre mit Gewinde versehene Kolbenschraube gedreht, bis an der Nadelspitze kleine Tropfen der Überzugslösung erschienen. Ein sauberes Glasdeckplättchen wurde mit der Nadel in Berührung gebracht und so der hängende Tropfen von Überzugslösung darauf aufgebracht. Das Deckplättchen wurde dann auf einer flachen Oberfläche angeordnet und die Kante eines anderen Deckpiättchens, das etwa vertikal dazu gehalten wurde, über das erstgenannte Deckplättchen gezogen und so ein gleichmäßiger Überzug aus der Überzugslösung auf dem ersten Deckplättchen erzeugt. Den Überzug ließ man bei Raumtemperatur trocknen. Auf diese Weise hat man ein vorgefärbtes Deckplättchen erhalten.

Für die Ausführung der Erfindung ist es auch erforderlich, eine geeignete viskose Lösung eines transparenten Harzes zu schaffen. Die folgenden drei Formulierungen viskoser Harzlösungen haben sich als gleichermaßen zufriedenstellend erwiesen.

Formulierung I

Zu 82,35 ml 0,2molarem Dinatriumorthophosphat (Na₂HPO₄) wurden 17,65 mlCmmolarerZitronensäure.(C₆H_gO₇) hinzugegeben (diese Kombination ist als Mcllvaine's-Standardpuffer bekannt) und auf 90 bis 95° C erhitzt (in den angegebenen Proportionen erzeugt dieser Puffer etwa einen neutralen pH-Wert, und Bezugnahmen auf den Mcllvaine-Standardpuffer in der vorliegenden Anmeldung bedeuten die Verwendung einer Lösung im wesentlichen dieser Proportionen). Zu dieser heißen Lösung wurde unter starkem Rühren mit einem Glasstab 10g HydroxypropylmethylceUulose mit einer nominellen Viskosität von 15 Centipoise hinzugegeben. Die Methylcellulose löst sich beim Abkühlen der Pufferlösung langsam auf. Nach Abschließen des Lösungsvorganges gab man zu einem Milliliter der erhaltenen Lösung 1 ml einer Mischung gleicher Teile Wasser und Glyzerin p. a. Diese Endmisciiung war eine geeignete Formulierung zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren.

Formulierung Il

Zu 100 ml Dimethylformamid wurden langsam unter Rühren 5 g Methylcellulose mit einer nominellen "> Viskosität von 15 Centipoise hinzugegeben. Zu 1 ml der erhaltenen Lösung gab man 1 ml einer Mischung gleicher Teile Wasser und Glyzerin p. a. Diese Mischung war eine geeignete Formulierung zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren.

Formulierung III

Zu 20 ml einer Mischung gleicher Teile Wasser und: Glyzerin p. a. gab man 4 g Polyvinylpyrrolidon mit einem nominellen Molekulargewicht von 44000, das

ΐϊ als Handelsprodukt erhältlich ist. Die erhaltene Lösung war eine geeignete Formulierung zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren.

In Fig. 1 ist ein mikroskopischer Objektträger IO dargestellt, der eine Blutprobe 12 trägt, die in konventioneller Weise auf den Objektträger aufgestrichen und luftgetrocknet ist. Ein dünner Streifen 14 einer der oben beschriebenen drei Formulierungen wurde dann auf dem Probenabstrich angeordnet. Dies kann bequemerweise mit einer kleinen Polyäthylen-

2^r> flasche erfolgen, die eine Düse ähnlich einer konventionellen Ölkanne hat. Der Streifen 14 sollte etwas kürzer sein als das Deckplättchen.

Fig. 2 zeigt ein Deckplättchen 16 mit einem Farbüberzug 18 auf seiner Unterseite, der auf den Streifen

3(> 14 aufgebracht werden soll. Wenn dies erfolgt ist, zieht die Oberflächenspannung des Streifens 14 das Deckplättchen auf den Probenabstrich 12 gegen den Mikroskopobjektträger 10. Der Farbstorf 18 dringt in die Formulierung des Streifens 14 ein und wird zu dem Probenabstrich 12 übertragen und färbt diesen.

In Fig. 3 ist das Endresultat gezeigt. Die Farbe 18

ist als solche nicht mehr vorhanden, und mit 20 ist der angefärbte Probenabstrich 12 bezeichnet. Die Formulierung, die den Streifen 14 bildete, ist nun bis zu den Kanten des Deckplättchens 16 ausgebreitet und kapselt die angefärbte Probe 20 ein und hat diese gegen Eintritt von Umgebungsluft einschließlich der darin enthaltenen Feuchtigkeit abgedichtet.

Im Falle einer Blutprobe beginnt mit den in diesem bevorzugten Beispiel angegebenen Farben das Anfärben in 2 bis 3 Minuten und wird intensiver in 15 bis 20 Minuten. Diese Anfärbung ist permanent, wie dies nach konventionellen Praktiken ist, wenn man ein Dichtungsmittel nach dem üblichen Anfärben aufbringt.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zum gleichzeitigen Anfärben und Versiegeln einer auf einen mikroskopischen Objektträger aufgebrachten und luftgetrockneten biologischen Probe, gekennzeichnet durch folgende Stufen:

a) Herstellen einer viskosen Lösung eines transparenten Harzes in einer Lösungsmittelmischung aus einer organischen Verbindung und Wasser,

b) Versehen eines Deckplättchens mit einem Überzug eines biologischen Färbemittels auf einer Seite,

c) Aufbringen einer Menge der viskosen Lösung auf einen Bereich des Objektträgers, der kleiner ist als die Fläche des Deckplättchens,

d) Anordnen des Deckplättchens auf der viskosen Lösung in einer Weise, daß sich seine farbüberzogene Seite in Kontakt mit der viskosen Lösung befindet und

e) ungestörtes Belassen des Deckplättchens auf der Lösung, damit die Oberflächenspannung der Flüssigkeit das Deckplättchen gegen die Probe und den Objektträger ziehen kann, wodurch die flüssige Lösung über die Teile der Probe und den Objektträger, die durch das Deckplättchen abgedeckt sind, ausgebreitet wird, und wodurch das Färbemittel von dem Deckplättchen durch die Lösung aufgenommen und in Berührung mit der Probe gebracht wird und diese anfärbt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die zusätzliche Stufe, daß man die Lösungsmittelmischung aus der Lösung verdampfen läßt, wodurch ein Körper festen transparenten Harzes als eine Dichtung zwischen dem mikroskopischen Objektträger und dem Deckplättchen zurückbleibt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die viskose Lösung eines transparenten Harzes in einer Lösungsmittelmischung aus einer organischen Verbindung und Wasser im wesentlichen aus folgenden Bestandteilen besteht:

Volumenteil der Mcllvaine-Standardpufferlösung, in der pro Milliliter 100 Milligramm Hydroxypropylmethylzellulose mit einer nominellen Viskosität von 15 Centipoise gelöst sind und

Volumenteil einer Mischung gleicher Volumenteile von Wasser und Glyzerin p. a.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die viskose Lösung eines transparenten Harzes in einer aus einer organischen Verbindung und Wasser bestehenden Mischung im wesentlichen aus folgenden Bestandteilen besteht:

Volumenteil Dimethylformamid, in dem pro Milliliter 50 Milligramm Methylzellulose mit einer nominellen Viskosität von 15 Centipoise gelöst sind, und

Volumenteil einer Mischung gleicher Volumenmenge Wasser und Glyzerin p. a.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die viskose Lösung eines transparenten Harzes in einer Lösungsmittelmischung

aus organischer Verbindung und Wasser im wesentlichen aus folgenden Bestandteilen besteht: einer Mischung gleicher Volumenteile Wasser und Glyzerin p. a., in der pro Milliliter 200 Milligramm Polyvinylpyrrolidon mit einein nominellen Molekulargewicht von 44000 gelöst sind.